CC BY
90
69. Miller D. W., IrstewarC. F., Rosner W. // Amer. J. Surg. — 1970. — Vol. 119.-P. 754-757.
70. Musk B. R., Trotnow S., Hommel G. // Arch. Gynaecol. — 1975. — Vol. 220. - P. 73-81.
71. Olefsky J. M. // Diabetes. — 1976. - Vol. 25. - P. 1154-1162.
72. Orlandi C. // Minerva Gines. — 1976. — Vol. 20. — P. 219—226.
73. Osborne C. K., Bolan G., Monaco M. E., Lippman M. E. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1976. - Vol. 73, N 12. - P. 4536-4540.
74. Pavelic K., Basic I., Pavelic J. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. — 1980. — Vol. 97. - P. 275-283.
75. Pavelic K., Radic S., Pavelic J. // Res. Exp. Med. — 1982. — Vol. 181.
- P. 63-76.
76. Pavelic K., Slijepcevic M., Pavelic J. et al. // Cancer Res. — 1979. —
Vol. 39. - P. 1807.
77. Puckeit C. Z., Shingleton IV. IV. // Ibid. - 1972. - Vol. 32. - P. 789— 790.
78. Rhomberg W. // Dtsch. med. Wschr. — 1975. — Vol. 100. —
P. 2422-2427.
79. Salvadori B. // Minerva Ginec. - 1976. - Vol. 28. - P. 227-229.
© H. А. Брусенцов, Т. H. Брусенцова, 2002 УДК 615.847.8
H. А. Брусенцов', Т. Н. Брусенцова2
СОЗДАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ: ИММУНОМАГНИТНАЯ СЕПАРАЦИЯ АНТИГЕНОВ И ЕЕ КОМБИНАЦИИ С ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ АНАЛИЗОМ, МЕТОДАМИ PCR И ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ IN SITU
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей', Московский государственный университет им. М. В.Ломоносова2, Москва
В последнее десятилетие быстро развивается метод иммуно-магнитной сепарации (ИМС) субклеточных структур и клеток, основанный на использовании магнитоуправляемых микросфер (ММ) и моноклональных антител (МКА). Чтобы определить исходные материалы и приборы, методы диагностики и биотерапии, применяемые при трансплантации костного мозга и стволовых кроветворных клеток (СКК), приведен обзор научных публикаций [1—101].
Поверхность микросфер, формируемая из полистирола, по-лиглутарового альдегида, полиакролеина, обеспечивает возможность адсорбции и химического связывания МКА. Образующиеся при этом конъюгаты специфично связываются с объектами-мишенями, и, направленно перемещаясь в магнитном поле, увлекают мишени за собой в сторону увеличения градиента поля. Этим способом из биологических жидкостей
80. Shafic S. M„ HilfR. // Cancer Res. - 1978. - Vol. 38 - P. 759-764.
81. Slijepcevic M,, Radacic M. // Period. Biologorum. — 1976. — Vol. 78.-Suppl. l.-P. 130-132.
82. Smith R. D., Hilf R., Senior A. E. // Cancer Res. — 1977. — Vol. 37.
- P. 595-598.
83. Toretsky J. A., Helman L. J. // J. Endocrinol. — 1996. — Vbl. 149, N 3. - P. 367-372.
84. Tuffier P. U Arch. Gen. Med. - 1988. - Vol. 2. - P. 129-140.
85. Vaissman J., Kamel D. C. // Arg. Brasil. Endocrin. Metab. —
1964.-Vol. 13.-P. 193.
86. Welsch C. W., McManus M. J. // Cancer Res. — 1977. —
Vol. 37.-P. 2257-2261.
Поступила 19.09.02 / Submitted 19.09.02
N.A.Brusentsov', T.N.Brusentsova2
DEVELOPMENT OF BIOLOGICAL DRUGS FOR CANCER DIAGNOSIS AND THERAPY: ANTIGEN IMMUNOMAGNETIC SEPARATION AND ITS COMBINATION WITH IMMUNOFLUORESCENCE ASSAY, PCR AND FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION
Institute of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors',
M. V.Lomonosov Moscow State University2, Moscow
Over the last decade there was a marked advance in development ofimmunomagnetic separation (IMS) of subcellular structures and cells as based on the use of magnet-driven microspheres (MM) and monoclonal antibodies (MAb). The attached references [ 1 -101 ] describe materials and instruments, diagnosis and biotherapy methods used in bone marrow and stem hemopoietic cells (SHC) transplantation.
Microsphere surface made of polystyrene, polyglutar aldehyde, polyacroleine provide MAb adsorption and chemical binding. The resultant conjugates bind specifically to targets and transfer the targets towards field gradient increase in magnetic field. This technique ensures separation of proteins, nucleic acid-s, chromosomes, cells and microorganisms from biological fluids [3,4,8,15,17,18,20,28-30, 33,34,46-48,52,55,57,59,60,63,
66,76,78,84,93,94,96,101]. The MM production technology is
выделены протеины, нуклеиновые кислоты, хромосомы, клетки и микроорганизмы [3,4, 8, 15,17,18,20, 28—30, 33, 34, 46-48,52,55, 57,59,60,63,66,76,78,84,93,94,96,101]. Метод получения ММ [96], используется одним из ведущих производителей иммуномагнитных сорбентов (МС) фирмой «Оупа1» (Норвегия). МС ОупаЬеас^ М-270, покрытые специфическими антителами к опухолевым клеткам крови и костного мозга, успешно применяются при диагностике и лечении онкологических заболеваний; чувствительность метода: 1 опухолевая клетка/мл крови [68]. ММ, полученные на основе поливинилового спирта, успешно используются в секвенаторе нуклеиновых кислот [84].
При сепарации клеток используются высокоградиентные магнитные поля. Различные типы магнитных материалов для изготовления постоянных магнитов, используемых в устройствах при магнитной сепарации клеток, методы их испытаний и результаты определения физических характеристик представлены [59]. Примером успешного использования магнитных систем при выделении стволовых клеток может служить квадрупольный магнитный высокопроизводительный (107 клеток/с) проточный сепаратор [78]. Прилипание иммуномагнитных частиц, специфичных к антигенным и цитоки-новым рецепторам на опухолевых клетках, определяют маг-нитофорезом. Не менее 200 молекул рецептора, фактора некроза опухолей (ФНО) на опухолевую клетку, определяется с помощью частиц, покрытых стрептавидином, которые конъюгируют с предварительно биотинилированными ФНО в качестве лигандов [94].
В зависимости от уровня токсичности ММ и МС [1,2,5—16, 20-23, 25, 26, 28-30, 39-45, 48, 52, 53, 60, 66, 67, 79, 101] их применяют следующим образом:
— оставляют на клетках (полностью метаболизируются в организме млекопитающих, обладают низкой токсичностью), например декстранферрит (ДФ) и конъюгаты ДФ с лигандами [8, 15, 19, 20, 29, 30, 38, 87] магнетито-декстран и конъюгаты маг-нетито-декстрана с антителами [71, 73, 77];
— отщепляют от клеток ферментами [27,49, 54, 65, 69, 74,
76, 87, 91, 99] или рилизинг-пептидом [32] (не метаболизируются в организме, обладают высокой токсичностью), например полистироловые МС [3, 4, 17, 18, 24, 28, 31, 33—36, 46-52, 54, 55, 57-64, 66, 68, 71, 72, 75-78, 80-86, 88-91, 93,94,96-101].
Все МС, полученные на основе синтетических полимерных ММ (диаметр от 1 до 6 мкм) с инкапсулированными в них ферро-или ферримагнетиками, токсичны, поскольку не метаболизируются в организме больного и вызывают тромбоз. Поэтому после выделения комплекса (клетка — МС) необходимо отщеплять МС от клетки действием ферментов [76], но при этой манипуляции могут изменяться поверхности клеточных мембран [49,54,91,99]. При вытеснении клеток из комплексов (клетка — МС) рилизинг-пептидами, которые действуют мягче [32], для каждого нового комплекса необходим специфичный рилизинг-пептид.
Созданию нетоксичных магнитоуправляемых микросфер (ММ) [1,2,5-16,20-23,25,26,29,30,37,39-45,53,67,71,73,
77, 79, 92], нетоксичных иммуномагнитных сорбентов (НМС) [8,15, 20,29, 30, 71, 73, 77], разработке и применению методов иммуномагнитной сепарации антигенов, используемых при
used by a world leading manufacturer of immunomagnetic sorbents (MS) Dynal (Norway). The MS Dynabeads M-270 are coated with specific antibodies to blood and bone marrow tumor cells and widely used in cancer diagnosis and treatment, the method sensitivity being 1 tumor cell per ml blood [68]. Polyvinyl alcohol MM are used in nucleic acid sequenators [84].
High-gradient magnetic fields are used to separate cells. Various types of magnetic materials used in manufacture of permanent magnets as well as test methods and physical characteristics determined are summarized in [59]. High-performance (107 cells/s) quadrupole magnetic flow separator [78] is an example of successful application of magnetic systems. Adhesion of immunomagnetic particles specific to tumor cell surface antigen and cy-tokin receptors is measured by magnetophoresis. At least 200 tumor necrosis factor (TNF) receptor molecules per tumor cell are detected using sptreptavidin-coated beads that conjugate with biotin-conjugated TNF as ligands [94].
Depending upon MM and MS toxicity [1,2,5-16,20-23,25,26, 28-30,39-45,48,52,53,60,66,67,79,101] they are used as follows:
- left to stay on cells (are fully metabolized in mammals, demonstrate low toxicity), e.g. dextrane ferrite (DF) and DF-ligand conjugates [8,15,19,20,29,30,38,87], magnetite-dextrane and magnetite-dextrane-antibody conjugates [71,73,77];
- split out from cells with enzymes [27,49,54,65,69,74,76,
87,91,99] or releasing peptides [32] (are not metabolized in the body, demonstrate high toxicity), e.g. polystyrene MS [3,4,17, 18,24,28,31,33-36,46-52,54,55,57-64,66,68,71,72, 75-78,80-86,88-91,93,94,96-101].
All MS on the basis of synthetic polymer M M (1 to 6 mcm in diameter) with encapsulated ferro- or ferrimagnetics are highly toxic since they are not metabolized in the patient’s body and cause thrombosis. Therefore the MS should be split off from the cell using enzymes after isolation of cell-MS complexes [76], however this operation may affect cell surface membranes
[49.54.91.99]. If cell separation from cell-MS complexes is performed using releasing peptides with a milder action [32], a specific releasing peptide is needed for every new complex.
Development of non-toxic magnet-driven microspheres (MM)
[ 1,2,5-16,20-23,25,26,29,30,37,39-45,53,67,71,73,77,79,92], nontoxic immunomagnetic sorbents (NMS) [8,15,20,29,30,71,73,77], development and application of antigen immunomagnetic separation in SHC transplantation [71,73,77] are described in the above mentioned publications.
Production of Non-Toxic Immunomagnetic Sorbents
There is no need in splitting off non-toxic immunomagnetic sorbents (NMS) from NMS-cell complexes since they do not as a rule affect cell functioning. This discovery allowed substitution of NMS that do not require splitting-off [8,15,20, 29,30,71,73,77] for toxic MS that do require splitting-off
[27.49.54.65.74.76.87.91.99].
Considering the importance of NMS in bone marrow cell separation a method to synthesize the NMS and techniques to produce source substances are described below. The NMS are produced on the basis of magnetite, dextrane and specific antibodies:
- Cl'-activated magnetite crystal surface is coated with dextrane to produce dextrane-ferrite MM (DFMM) [5,6,9,15,38,67];
- the DFMM are processed by common technique (a,b) [19,30].
трансплантации СКК [71, 73, 77], посвящены перечисленные научные публикации.
Получение нетоксичных иммуномагнитных сорбентов
Нет необходимости отщеплять нетоксичный иммуномаг-нитный сорбент (НМС) в комплексе НМС — клетка, поскольку он, как правило, не нарушает ее функциональных свойств. Это открытие позволило заменить токсичные МС, которые необходимо отщеплять от клеток [27, 49, 54, 65, 69, 74, 76, 87,
91,99], на НМС, не требующие отщепления [8,15,20,29,30,71, 73, 77].
Учитывая важность НМС в сепарации клеток костного мозга, приводим один из способов их синтеза и методы получения исходных веществ, необходимых для этого. НМС получают на основе магнетита, декстрана и специфичных антител:
— поверхность кристаллов магнетита, активированную ионами СГ, покрывают декстраном, получают ММ декстранфер-рита (ММДФ) [5, 6, 9, 15, 38, 67];
— ММДФ обрабатывают по общей схеме (а, б) [19, 30].
Поверхность ММ декстранферрита окисляют действием перйодата калия (КЮ4) или перйодата натрия (ЫаЮ^, таким образом получают ММ полиальдегиддекстранферрита (ММПДФ). ММПДФ инкубируют с МКА и получают конъюгаты (ММПДФ — МКА), представляющие собой нетоксичные им-муномагнитные сорбенты (НМС).
а) ММДФ+10'4 ММПДФ [8,15,19, 20,29,30];
б)ММПДФ+МКА ММПДФ-МКА[8,15,19,20,29,30]. Химическая схема синтеза НМС на основе ДФ и МКА:
(у-Ре20з)г-т(Ре20зРе0)т(СбН905)Г(СбНю05)^^^-
(V—ИегОз) ™(РеЮ.РеО) „.(СбН-О:.) ДСбНюОзКг-^НЮ^^^ (у—РезОз) г ^ГеЮзРеО) ш(СбН905) Г(СбНюО0ч г-1(С4Н,1О4Ы-К)„ где г — число молекул оксида железа в кристаллическом ядре феррита;
ш — число остатков молекул оксида железа, связанных с ионами хлора или остатками глюкозы; q — число остатков глюкозы в молекулах декстрана;
Г — число остатков глюкозы, связанных с оксидом железа;
] — число остатков глюкозы, связанных с иммуноглобулином; Я — иммуноглобулин.
Окисление декстранферрита перйодатом натрия ведут при 20 °С 30 мин [19]. Иммуномагнитный сорбент, полученный на основе ММПДФ и МКА, является конъюгатом, который имеет диаметр кристаллического ядра 10 нм, диаметр мицеллы до 300 нм, число частиц до 1,5 • 109/г, удельную намагниченность насыщения от 3 до 12 А • м3/кг; в применяемых дозах нетоксичен, поскольку полностью метаболизируется в организме млекопитающих [8, 19, 20, 29, 30, 38]. После выделения в неоднородном постоянном магнитном поле (НПМП) комплекса (ПДФ — МКА — клетка) нет необходимости отщеплять от клетки конъюгат ПАДФ — МКА, поскольку он нетоксичен в применяемых дозах. Электрокинетический потенциал декстранферрита (2-потенциал) — +15 мВ при pH 6,6; ЛДзо декстранферрита — 5 г/кг при внутривенном введении мышам [10, 19, 22, 38, 67]. При внутривенном и внутрибрю-шинном введении мышам в естественных условиях ДФ депонируется в печени и селезенке [6,7,9,11,12,15,22, 37, 38,67].
DFMM surface is oxidized with potassium periodate (KIO4) or sodium periodate (NaIO<) to produce polyaldehyde dextrane ferrite MM (PDFMM). The PDFMM are incubated with MAb to produce PDFMM-MAb conjugates that are non-toxic im-munomagnetic sorbents (NMS).
a) DFMM+JO% PDFMM [8,15,19,20,29,30];
b) PDFMM+MAb — PDFMM-MAb [8,15,19,20,29,30]. Chemical scheme of DF- and MAb-based NMS synthesis is:
(Y-Fe2O3)r-m(Fe2O3FeO)m(C6H9O5)f(C6Hi0O5),^^i-
(Y—FC2O3) rm(FeiO]FeO) 4&H.O) f(C6Hio03Vr-j(C.H4o!)JIi^^ (y-FeiOs) ,„,(Fe20>Fe0) 4GH.Os) fCQHioOsVi^CUH^N-RK where r is the number of iron oxide molecules in ferrite crystal nucleus; m is the number of iron oxide molecule residues bound to chlorine ions or glucose residues; q is the number of glucose residues bound to iron oxide; j is the number of glucose residues bound to immunoglobulin; R is immunoglobulin.
The dextrane ferrite oxidation with sodium periodate is carried out at +20°C for 30 min [19]. The immunomagnetic sorbent produced on the basis of PDFMM and MAb is a conjugate with a 10 nm crystal nucleus diameter, an up to 300 nm mycelial diameter, particle number 1.5 • 10 /g, specific saturation magnetization 3 to 12 A • m2/kg; is not toxic at recommended dosage due to complete metabolization in the mammalians’ body [8,19,20,29,30,38]. There is no need in splitting out the PDF-MAb conjugate from the PDF-MAb-cell complex after separation in nonunifonn permanent magnetic field (NPMF) since it is not toxic at recommended dosage. Dextrane ferrite electric potential (Z-potential) is +15 mVat pH 6.6; LD50 ofi.v. dextrane ferrite formice is 5 g/kg [10,19,22,38,67]. After intravenous and intraperitoneal administration to mice under natural conditions DF is accumulated in the liver and spleen [6,7,9,11,12,15,22,37,38,67]. After intra-arterial administration to dogs in NPMF DF is accumulated in sites with maximal permanent magnetic field gradient [1,2,5,11,14,23,25,26,39-44,53,67,79,92] and undergoes induction heating from 43 to 46 °C in alternating magnetic field at 50 to 1000 kHz [7,10,13,15,21,39,43].
MM and MAb are needed to produce immunomagnetic sorbents. The hybridoma technology developed in the seventies is used today to produce MAb. Beside gene-engineering manipulations the manufacture procedure of pure antibody-producing cell lines includes cell separation, screening and cloning of resultant hybridomas. These procedures are highly labor-consuming. IMS of needed clones [61,83] helps to reduce considerably the time and to increase the number of resultant hybridoma cells. Supernatants of all colonies undergo ELISA to detect an-ti-hCG-antibody producing cells. Chemical binding of hCG-antigen with MM Dynabeads M450 (Dynal, Norway) results in immunomagnetic sorbent, anti-hCG-M450, which undergoes IMS to isolate positive colonies.
Antigen-specific hybridomas are separated from non-secreting cells using an SmCo magnet. Positive cell fraction bound to sorbent beads is resuspended in the medium and transferred into 96-well plates. The stage of producing cell generation directly follows the IMS without the sorbent splitting-off phase [76] which is usually difficult for positive IMS [49,54,91,99]. IMS-isolated hybridomas secret high-afTinity (more than 1-10’ mol-1) monoclonal antibodies of a single isotype [86].
При внутриартериальном регионаром введении собакам в НПМП ДФ концентрируется в местах с максимальным градиентом постоянного магнитного поля [1, 2, 5, 11, 14, 23, 25, 26, 39—44, 53, 67, 79, 92] и индукционно нагревается от 43 до 46 °С в переменном магнитном поле на частотах от 50 до 1000 кГц [7,10, 13, 15,21,39,43].
Для получения иммуномагнитных сорбентов необходимы ММ и МКА. Разработанная в 70-х годах шбридомная технология и сегодня используется в качестве основного способа получения МКА. Процесс получения чистых линий антителопродуцирующих клеток помимо генно-инженерных манипуляций включает сепарацию клеток, скрининг и клонирование образовавшихся гибридом. Перечисленные процедуры трудоемки. Один из возможных вариантов модернизации, позволяющий значительно сократить время и повысить количество получаемых гибридомных клеток, состоит в использовании ИМС желаемых клонов [61, 83]. Супернатанты всех образующихся колоний тестируют методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) для выявления продуцентов анти-ЬСС-анти-тел. Химически связывая полученный hCG-антиген с ММ Dy-nabeads М450 («Dynal», Норвегия), получают иммуномагнит-ный сорбент — анти-ЬСС-М450 и с помощью ИМС выделяют позитивные колонии. Антигеноспецифические гибридомы отделяют от несекретирующих клеток с помощью SmCo магнита. Клетки позитивной фракции, связавшиеся с частицами сорбента, ресуспендируют в среде и рассевают по 96-луночным планшетам. Стадия получения культур клеток-продуцентов следует непосредственно за ИМС, минуя стадию отщепления сорбента [76], которая обычно представляет затруднение при позитивной ИМС [49, 54, 91, 99]. Гибридомы, изолированные ИМС, секретируют высокоаффинные (более 1 ■ 10’ моль1) моноклональные антитела одного изотипа [86].
Трансплантация костного мозга и стволовых кроветворных клеток
Эффективным способом лечения злокачественных опухолей является высокодозная радиохимиотерапия с последующей трансплантацией аутологичного или аллогенного костного мозга, но высокодозная радиохимиотерапия сопровождается гибелью активно пролиферирующих стволовых клеток костного мозга, являющихся предшественниками всех ростков гемопоэза. Для преодоления гемотоксичности используется аутотрансплантация костного мозга. У больного берут костный мозг, больного содержат в асептических условиях и лечат до отсутствия в организме опухолевых клеток, при этом параллельно гибнут нормальные клетки крови и костного мозга. После завершения радиохимиотерапии больному вводят аутологичный или аллогенный костный мозг. При успешном приживлении трансплантата через 2—3 нед после введения костного мозга кроветворение восстанавливается [3,4,17,18,33, 34,46,47, 57, 58, 60, 63, 76, 80, 93]. Широкое применение этого метода в настоящее время ограничено дороговизной. Часто клетки аутологичного костного мозга контаминированы отдельными опухолевыми клетками и их кластерами (метастазами); для трансплантации необходимы здоровые стволовые клетки костного мозга.
пТрансплантация цельного аллогенного или аутологичного костного мозга эффективна на стадии восстановления
Bone Marrow and Stem Hemopoietic Cell Transplantation
High-dose radiochemotherapy with autologous or allogeneic bone marrow transplantation is an effective cancer treatment modality, however, the high-dose radiochemotherapy is accompanied with death of actively proliferating stem cells, precursors of all hemopoietic cell types. Bone marrow autotransplantation is used to counter hemotoxicity. A portion of bone marrow is taken from the patient, then the patient is kept under aseptic conditions until all tumor cells are dead with normal blood and bone marrow cells dying in parallel. After radiochemotherapy completion autologous or allogeneic bone marrow is transplanted to the patient. Hemopoiesis recovers at 2 or 3 weeks following the bone marrow transplantation [3,4,17,18,33,34,46,47,57,58,60,63,76,80,93[. Wide application of this method is limited by high cost. Autologous bone marrow cells are often contaminated with tumor cells or tumor cell clusters (metastases); normal bone marrow stem cells are needed for the transplantation.
Transplantation of whole allogeneic or autologous bone marrow is effective in hemopoiesis restoration in cancer patients undergoing high-dose chemo- and radiotherapy. There are certain problems at each transplantation stage related to cryopreserva-tion, graft rejection and disease recurrence. Bone marrow IMS using acrylic, metacrylic, polystyrene or magnetite-dextrane MS with MAb to stem hemopoietic cell marker CD34 helps to overcome these difficulties [3,4,17,18,33,34,57,63,71,73,93].
A previously calculated portion of MS is added to bone marrow suspension, the mixture is incubated at careful stirring. During the incubation the MS bind selectively to bone marrow stem hemopoietic cells, the latter thus becoming magnet-controlled [3,4,17,18,46,57,63,73,76]. The bone marrow is transferred to a magnetic separator to separate cells attracted by the magnet from other cells [3,4,17,18,57,63,73]. A high-performance multistage separator of magnetic particles is used for this purpose [95].
The use of an SHC fraction (CD34+ population) helps to overcome main difficulties. The advantages of transplantation of pure hemopoietic cell population enhance improvement of their isolation from donor peripheral blood and bone marrow (allogeneic transplantation) and patients (autologous transplantation). IMS is one of the fields to improve the SHC separation for scientific and medical purposes. Conditions should be provided to exclude cell damage during the IMS such as complete extraction of stem cells from source material, exclusion of penetration into the positive fraction even for single tumor cells. This condition requires application of high sensitivity techniques for tumor cell detection.
Immunomagnetic Separation Types -
Bone marrow IMS is based on the use of MS with unique specificity [3,4,8,15,17,18,20,29,30,34,46,47,55,57,63,68,76,93]. There are two IMS types, such as positive IMS (PIMS) [3,4,17,18,33,46,63,73] and depletion [57,73,93]. The PIMS implies administration to patients of cells separated by M S binding. After isolation of cell-MS complexes low-toxic MS are left on the cells [8,15,19,20,29,30,71,73,77,87], while high-toxicity MS are split off from the cells with chemopapain [27,65,69, 74,76,87], this procedure may result in cell membrane marker
кроветворения у онкологических больных после высокодозной химио- и радиотерапии. На разных этапах трансплантации встречаются трудности, связанные с криоконсервацией, отторжением трансплантата и рецидивами заболевания. Для преодоления этого используются методы ИМС костного мозга с помощью акриловых, метакриловых, полистироловых или магнетито-декстрановых МС, несущих на своей поверхности МКА к маркеру стволовых кроветворных клеток CD34 [3,4,17, 18, 33, 34, 57, 63, 71, 73, 93]. К суспензии клеток костного мозга прибавляют рассчитанное количество МС и инкубируют смесь при осторожном перемешивании. В процессе перемешивания МС избирательно связываются со стволовыми кроветворными клетками костного мозга, которые при этом становятся магнитоуправляемыми
[3, 4, 17, 18, 46, 57, 63, 73, 76]. Такой костный мозг помещают в магнитный сепаратор и отделяют клетки, притянувшиеся к магниту, от остальных клеток [3, 4, 17, 18, 57, 63, 73], в частности, для этих целей предназначен высокопроизводительный многоступенчатый сепаратор магнитных частиц [95[.
Использование вместо цельного костного мозга фракции СКК (популяция CD34 ) позволяет избежать основных осложнений. Преимущества трансплантации чистой популяции ге-матопоэтических клеток стимулируют совершенствование технологии их выделения из периферической крови и костного мозга доноров (при аллогенной) и пациентов (при аутологичной трансплантации). Одним из направлений улучшения технологии выделения стволовых кроветворных клеток (СКК) в научных целях и для последующей трансплантации является ИМС. Необходимо подобрать условия, при которых исключается вероятность повреждения клеток при НМС. Должна обеспечиваться полнота извлечения стволовых клеток из исходного материала; не допускается попадание в позитивную фракцию даже одиночных опухолевых клеток. Это условие требует параллельного применения высокочувствительных методов обнаружения опухолевых клеток.
Разновидности иммуномагнитной сепарации
Иммуномагнитная сепарация костного мозга основана на использовании МС, обладающих уникальной специфичностью [3,4,8,15,17,18,20, 29, 30, 34,46,47, 55, 57, 63, 68,76,93]. Разработано два вида ИМС: позитивная ИМС (ПИМС) [3, 4, 17, 18, 33, 46, 63, 73] и истощение [57, 73, 93]. При позитивной сепарации больному вводят клетки, выделенные путем связывания с МС. После выделения комплексов (клетка — МС): МС, обладающие низкой токсичностью, оставляют на клетках [8, 15,19,20,29,30,71,73,77,87[; высокотоксичные МС отщепляют от клеток химопапаином [27,65, 69,74,76, 87], приэтойма-нипуляции могут денатурироваться или отщепиться маркеры клеточных мембран [49, 54, 91, 99]; специфический рилизинг-пептид при отщеплении МС действует мягче [32].
ПИМС используют для выделения стволовых кроветворных клеток. Выделенные клетки культивируют in vitro и вводят больному [28, 52,77]. При этом снижается опасность введения кон-таминированного опухолевыми клетками костного мозга, срок восстановления кроветворения сокращается, у больного уменьшается риск гибели от инфекции, уменьшается потребность в стерильных палатах, наблюдается экономия антибиотиков [28, 52, 77J. ПИМС используют также при диагностике: для
denaturation or splitting-off [49,54,91,99]; specific releasing peptides act milder [32].
The PIMS is used to separate stem hemopoietic cells. The isolated cells are cultured in vitro and administered to the patient [28,52,77]. This techniques reduces the risk of bone marrow contamination with tumor cells, time to hemopoiesis recovery, the risk of death from infection for the patient, the need in sterile ward rooms and the use of antibiotics [28,52,77]. The PIMS may also be used in the diagnosis to enrich and separate breast cancer cells from blood [70].
The depletion involves administration to the patient of cells failing to bind to MS during IMS. The depletion procedure is used:
- to clean bone marrow and blood from leukemia cells, breast cancer cells and neuroblastoma in autotransplantation;
- to remove immunocompetent cells in allotransplantation [48,66,70].
Since IMS allows performance ofboth PIMS and antigen depletion best results are achieved by combination of these procedures. Both the PIMS and depletion are highly specific and fast and therefore have good prospects in experimental and clinical medicine. IMS is effective to isolate minor cell populations: the use of MS allows PIMS of antigen-expressing cells at a concentration 1:106 in the source mixture. There is much evidence of efficacy of IMS of blood elements such as eosinophils [88], neutrophils, T and B-lymphocytes and megakaryocytes of various differentiation [27,91]. The method is used to isolate endothelial cells [49,54], glial cells [99]. All the authors emphasize preservation of vitality and functional properties by the isolated cells. For instance, study of thymocyte phenotype and effects of surrounding cell elements using T-cells was difficult because there was no method to obtain pure early T-lymphocyte populations and thymus stromal cells, i.e. cortical and medullar epithelial and mesenchymal cells. IMS of initial thymus cell suspension helped to solve this problem [91].
Thymus cell suspension freed from MHCII dendritic and lymphoid cells was exposed to thriple depletion using MS for removal of residual CD45 and lymphoid cells. Residual MHCII cells were eliminated by depletion from the resultant cell population. The resulting fraction was a pure population of medullar A2B5 epithelial cells. To have MHCII cortical epithelium cells CD45 and A2B5 cells were eliminated by sequential depletion, then MHCIT-expressing cells were isolated by PIMS. The resulting fraction was washed by resuspension and concentration in NPMP and incubated in pronase solution (10 mg/ml) 2 min at 37 °C to split off MS from conjugates. Early thymocytes were isolated from embryonic thymus cell suspension using PIMS of CD45+ cells. Immunofluorescence assay was used to find that, the resultant population consisted by more than 97% of CD45 CD4 CD8 TCR cells. This method was used to study in vitro maturation of CD4 CD8 TCR thymocytes separated from embryonic thymuses using IMS by CD8 cell marker. The resulting positive fraction consisted by 98% of the required cell phenotype. Microscopy, immunofluorescence assay and polymerase chain reaction based on reverse mRNA transcription (RT-PCR) were used to confirm cell preservation [49].
IMS was also used to isolate CD14 monocytes from peripheral blood mononuclear fractions. Mononuclears isolated in
обогащения и выделения клеток рака молочной железы из крови [70]. При методе истощения больному вводят клетки, не связавшиеся с МС в процессе ИМС. Метод истощения используют:
— для очистки костного мозга и крови от лейкозных клеток, клеток рака молочной железы и нейробластомы при аутотрансплантации;
— для удаления иммунокомпетентных клеток при аллотрансплантации [48, 66, 70].
Поскольку ИМС позволяет осуществлять как ПИМС, так и истощение антигенов, лучших результатов удается достичь комбинацией этих методов. Независимо от того, ПИМС или истощение осуществляется с помощью магнитного сепаратора, метод является высокоспецифичным и быстрым в исполнении. Этим подтверждается перспективность его использования в экспериментальной и клинической медицине. ИМС эффективна при выделении минорных клеточных популяций: использование МС позволило осуществить ПИМС клеток, экспрессирующих антиген, концентрация которых в исходной смеси составляла 1:10 . Многочисленные данные свидетельствуют об эффективности ИМС форменных элементов крови: эозинофилов [88], нейтро-филов, Т- и В-лимфоцитов и мегакариоцитов разных стадий дифференцировки [27, 91]. Метод используется при изоляции эндотелиальных клеток [49, 54], глиальных клеток [99]. Во всех приведенных работах отмечается сохранение жизнеспособности и функциональных качеств выделяемых клеток. Так, например, исследования изменений фенотипа тимоцитов и влияния окружающих клеточных элементов на примере созревания Т-клеток осложнялись отсутствием метода получения чистых популяций ранних Т-лимфоцитов и клеток, составляющих строму тимуса: кортикальных и медуллярных эпителиальных клеток и мезенхимных клеток. Задачу решили иммуномагнитной сепарацией исходной суспензии клеток тимуса [91].
Суспензию клеток тимуса, освобожденную от MHCII -ден-дритных и лимфоидных клеток, подвергали трехкратному истощению с помощью МС для удаления остаточных CD45 - и лимфоидных клеток. Из полученной клеточной популяции методом истощения элиминировали остаточные MHC1I -клетки. Полученная на этой стадии фракция представляла собой чистую популяцию медуллярных А2В5 -эпителиальных клеток. Для получения MHCII -клеток кортикального эпителия методом последовательного истощения удаляли CD45 - и А2В5 -клетки, после чего методом ПИМС выделяли клетки, экспрессирующие MHCII-маркер. Для отщеплепия МС от связавшихся с ним клеток полученную фракцию, дважды отмытую ресуспендированием и концентрацией в НПМП, инкубировали в растворе пролазы (10 мг/мл) 2 мин при 37 °С. Ранние тимоциты выделяли из суспензии клеток эмбрионального тимуса с помощью ПИМС CD45 - клеток. Иммунофлуорес-центным анализом определили, что полученная популяция более чем на 97% состояла из CD45 CD4 CD8 TCR-клеток. Представленную методику использовали при изучении созревания CD4 CD8 TCR-тимоцитов in vitro, которые выделяли из тканей эмбриональных тимусов с помощью ИМС по клеточному маркеру CD8. Полученная позитивная фракция на 98% состояла из клеток требуемого фенотипа. Для подтверждения сохранности клеток, изолированных методом ИМС, использовали микроскопию, иммунофлуоресцентный анализ и метод
density gradient from peripheral blood of a normal donor were labeled with biotin-conjugated antibodies against CD14(VIM13 and MEM18) 15 min at 0 °C. Then the cells were incubated with MM conjugated with streptavidin 10 min at +4 °C. Separation of this mixture was made using a VARIOMACS (Miltenyi Biotec GmBH, Germany) device. The positive fraction (CD14 cells) were retained in the column with nonuniform permanent magnetic field and eluted after NPMF was switched off. Cytofluor-imetry of the positive fraction was used to find that the content of CD 14 cells was 98.57% on the average. The resultant cells underwent RT-PCR to demonstrate properties of typical mature peripheral blood monocytes (expression of M-CSF-mRNA, GM-CSFR-nRNA, TNFRI(p55)-mRNA, CD14-mRNA, LZ-mRNA and no MPO-mRNA, a typical marker of myeloid precursor cells). Microscopy of the isolated cells determined a morphology characteristic of monocytes, the ex tempore-isolated cell fraction and cell populations tested at 3 to 7 days of culture contained up to 98% of vital cells [54].
Cells of the needed phenotype were isolated from the initial mixture by PIMS on the basis of a single surface marker or by sequential depletion and PIMS of the antigen-expressing cell mixture. Enzymatic cell processing to split off MS often led to loss of some surface markers [49,54,91,99].
A double marker IMS [85] using MM of different diameter and therefore different magnetization excludes the need in MS splitting off after the first separation stage. Preliminary PIMS of cell mixture using 50 nm MM and a MiniMACS (Miltenyi Biotech) is used at the first step. MM supplied by Dynal M280 and M450 (2.8 and 4.5 mcm in diameter, respectively) are used further. The second separation step is performed using a Dynal Magnetic Particle Concentrator (Dynal, Wirral, England) in an NPNF of a 3-fold lower induction as compared to MiniMACS magnets. Efficacy of this technique was confirmed by IMS of thymocytes and stem hemopoietic cell minor populations. The two-step procedure for isolation of mature T-cells of Thyl.2 CD4 phenotype from murine lymph nodes involved PIMS of Thyl.2 cells with CD4 lymphocyte depletion to follow. Suspension enrichment with Thyl.2 cells was made in a MiniMACS system using 50 nm MM. The separation resulted in isolation of cells with a 100% expression of Thyl.2 marker with heterogenic CD4 and CD8 expression. Further CD4+ cell depletion of the Thyl.2-positive fraction using anti-CD4M450 MS in a Dynal MPC separator produced a population mainly consisting of CD4 CD8 lymphocytes (92%). Isolation of early thymic T-cells of a CD8CD69 phenotype was made similarly except MS M280 were used for CD69 cell depletion [85].
Isolation of Hemopoietic Stem and Other Rare Cell Types from the Liver and Peripheral Blood
To isolate hemopoietic stem cells expressing a common leukocyte marker CD45 and a stem cell marker c-kit embryonic liver cells were exposed to IMS by the two cell markers. Cytofluorime-try of initial cell mixture demonstrated that about 1.5% of all cells had CD45 c-kit phenotype. The first separation step involved PIMS of CD45 cells using 50 nm MM in a MiniMACS system. The isolated fraction consisted by 99% of CD45+ cells. The second separation phase (PIMS of c-kit cells) was performed using anti-c-kit MS M280 (diameter 2.8 mcm). Separation of the cell
полимеразной цепной реакции, основанной на обратной транскрипции мРНК (RT-PCR-анализ) [49].
Метод ИМС использовали для выделения CD14 -моноцитов из фракции мононуклеарных клеток периферической крови. Мононуклеарные клетки, выделенные в градиенте плотности из периферической крови здорового донора, метили биотинилированными антителами против CD14 (VIM13 и МЕМ18) 15 мин при О °С. Полученные клетки инкубировали с ММ, конъюгированными со стрептавидином 10 мин при 4 °С. Разделение полученной смеси проводили на устройстве VA-RIOMACS («Miltenyi Biotec GmbH», Германия). Позитивную фракцию (CD14 -клетки) удерживали в колонке неоднородным постоянным магнитным полем и элюировали после выключения НПМП. Методом цитофлуориметрического анализа позитивной фракции определили, что содержание в ней СБ14+-клеток составляло в среднем 98,57%. Полученные клетки подвергли RT-PCR-анализу и обнаружили у них свойства типичных зрелых моноцитов периферической крови (экспрессия M-CSF-mRNA, GM-CSFR-mRNA, TNFRI(p55)-mRNA, CD14-mRNA, LZ-mRNA и отсутствие типичного для клеток-предшественников миелоидного ряда маркера MPO-mRNA). Микроскопией выделенных клеток определили морфологию, характерную для моноцитов; причем фракция клеток, выделенных ex tempore, и клеточные популяции, тестированные после 3—7 сут культивирования, содержали в среднем до 98% жизнеспособных клеток [54].
Клетки определенного фенотипа выделяли из исходной смеси ПИМС на основе единственного поверхностного маркера, либо последовательно проводили истощение и ПИМС смеси клеток, экспрессирующих антиген. Ферментативная обработка клеток для отщепления МС часто приводила к утрате ряда поверхностных маркеров [49, 54, 91, 99].
Метод ИМС по двум маркерам [85] с использованием ММ разного диаметра и, соответственно, разной намагниченности исключает необходимость отщепления МС после первой стадии сепарации. На первой стадии осуществляется предварительная ПИМС клеточной смеси с использованием ММ диаметром 50 нм на сепараторе MiniMACS («Miltenyi Biotech», Германия). Для дальнейшей обработки применяются ММ фирмы «Dynal» М280 и М450 (диаметры соответственно 2,8 и 4,5 мкм). Разделение смеси на второй стадии осуществляется на магнитном устройстве Dynal Magnetic Particle Concentrator («Dynal», «Wirral», Англия) в НПМП в 3 раза меньшей индукции, чем у магнитов MiniMACS. Эффективность этого метода подтвердили при ИМС тимоцитов и минорной популяции стволовых кроветворных клеток. Двустадийная процедура выделения зрелых Т-клеток фенотипа Thyl.2 CD4 из тканей мышиных лимфоузлов включала ПИМС Thyl.2 -клеток и следующее за ней истощение CD4 -лимфоцитов. Обогащение суспензии Thyl.2 -клетками производили в системе MiniMacs с использованием ММ диаметром 50 нм. В результате сепарации изолировали популяцию клеток со 100% экспрессией Thyl.2-маркера, гетерогенную по экспрессии CD4- и С08-маркеров. Последующим истощением CD4 -клеток позитивной по Thyl.2-маркеру фракции с использованием МС amn-CD4M450 на сепараторе Dynal МРС получили популяцию, содержащую преимущественно CD4 CD8 -лимфоциты (92%). Выделение ранних Т-клеток тимуса, характеризующихся фенотипом
mixture using a Dynal MPC separator discovered that 50 nm MM failed to be held by a weak magnetic field provided by the Dynal MPC system unlike 2.8 mcm MM. The cell population resulting from the second step was treated with trypsin to split off the MS. There was a c-kit degradation on the cell surface in parallel with the MS splitting-off, therefore the cell culture was exposed to an additional incubation and analyzed by flow cytoflu-orimetry for separation efficacy and confirmation of stem nature of the isolated cells after a certain time needed for re-expression of trypsin-sensitive c-kit-markers. The hemopoietic precursor markers c-kit, CD34 and Seal were present respectively in 97,99 and 95% of cells in the population. When cultured with thymus stroma elements the resulting CD45 c-kit cells entered T-cell differentiation which confirmed their preservation of initial functional characteristics [85].
To overcome disadvantages of trypsin, pronase and chemopa-pain that destroy cell surface antigens [49,54,91,99] a stem cell releasing factor, PR34 was synthesized. The factor is an octa-peptide used to isolate CD34 cells in an Isolex300 magnetic separator. In the Isolex system the immunomagnetic sorbent binds CD34 cells and remains in the NPMF while non-labeled cells are eliminated. After purification a PR34 releasing factor is added to the MC-CD34 -cell complex to competitively release free CD34 cells with their surface markers preserved. The PR34 reacts with the complex to release free CD34 cells with-
out MS or MAb admixture. This is the main advantage of PR34 against chemopapain, trypsin or pronase [32].
There is no cell separation technique compatible to IMS by sensitivity and efficacy. The IMS is successfully used to isolate allergen-specific B-cells from peripheral blood where their concentration was 1:104 [62] and to isolate fetus cells from mother peripheral blood at a concentration not more than 1:105 [51 ].
Being highly sensitive the IMS helps to overcome difficulties in SHC separation. The main difficulties are related to low concentration of cells in question (hemopoiesis precursor cells are about 0.1 % of mononuclear cells in peripheral blood of normal donors) and to few surface markers they express. The SHC IMS is used in clinical practice in bone marrow transplantation. Pure stem cell populations are needed to study morphology and function in culture in vitro [36]. Besides, the IMS-isolated stem cells are used for transfection in vaccine genetic engineering to be used in treatment for cancer and genetic disorders [24,64,82,97,100].
IMS is used to isolate CD34 cells from leukapheresis products of breast cancer patients. Leukocyte IMS was performed immediately after leukapheresis. CD34 cell concentration in leukocyte masses from 25 patients was 1.05% on the average (range 0.21 to 3.12%). The IMS was carried out using a Baxter Isolex 300 SA magnetic cell separation system. Cell conjugates on MS presenting the positive fraction were treated with chemopapain to split off the MS. The resultant populations contained 95.1% of CD34-expressing cells and were about 0.94% of source cell material. The IMS therefore helped to isolate up to 78% of CD34 cells from the total cell number contained in leukocyte mass. The resultant cells were used in autotransplantation performed to normalize hemopoiesis after high-dose chemotherapy. Subcutaneous administration of R-metHuG-CSF was used to mobilize circulating stem cells [60]. IMS efficacy for MACS separators (Miltenyi Biotech GmBH, Bergisch
CD8CD69 , проводили аналогично, но для истощения CD69 -клеток использовали МС М280 [85].
Выделение гемопоэтических стволовых и других редких клеток из печени и периферической крови
Для выделения гемопоэтических стволовых клеток, экспрессирующих общелейкоцитарный маркер CD45 и маркер стволовых клеток c-kit, провели ИМС клеток эмбриональной печени по двум соответствующим клеточным маркерам. Цитофлуори-метрический анализ исходной смеси показал, что около 1,5% общего количества клеток имели фенотип CD45 c-kit . На первой стадии сепарации с использованием ММ диаметром 50 нм проводили ПИМС CD45 -клеток в системе MiniMACS. В выделенной фракции содержалось 99% CD45 -клеток. Вторую стадию сепарации (ПИМС c-kit -клеток) осуществили с помощью МС анти-с-кИ-М280 (диаметр 2,8 мкм). При разделении клеточной смеси на сепараторе Dynal МРС определили, что ММ диаметром 50 нм в отличие от ММ диаметром 2,8 мкм не удерживаются слабым магнитным полем системы Dynal МРС. Популяцию клеток, полученную на втором этапе сепарации, обрабатывали трипсином для отщепления МС. Одновременно с отщеплением МС на поверхности клеток произошла деградация c-kit-маркеров, поэтому культуру клеток дополнительно инкубировали и через определенное время, необходимое для ре-экспрессии чувствительных к трипсину c-kit-маркеров, культуру анализировали методом проточной цитофлуориме-трии для оценки эффективности сепарации и подтверждения принадлежности выделенных клеток к линии стволовых. Маркеры гемопоэтических предшественников c-kit, CD34 и Seal присутствовали, соответственно, у 97, 99 и 95% клеток данной популяции. При культивировании полученных CD45 c-kit -клеток совместно с элементами стромы тимуса они вступали в Т-клеточную дифференцировку, это подтверждает сохранение ими функциональных свойств [85].
Для устранения недостатков, присущих трипсину, проназе и химопапаину, разрушающих поверхностные антигены клеток [49, 54, 91, 99], синтезирован рилизинг-фактор стволовых клеток, PR34 , представляющий собой октапептид, который используется для выделения CD34 -клеток в магнитном сепараторе Isolex300. В системе Isolex иммуномагнитный сорбент связывает CD34 -клетки и остается в НПМП, в то время как немеченые клетки выделяются. После очистки к комплексу
+ +ТМ
(MC-CD34 -клетка) прибавляют PR34 рилизинг-фактор, который конкурентно вытесняет свободные CD34 -клетки с
+1М
сохранением их поверхностных маркеров. Пептид PR34 при взаимодействии с комплексом обменивается с выделением свободных CD34 -клеток, не содержащих примеси МС и МКА. В
нм
этом преимущество октапептида, PR34 , перед химопапаи-ном, трипсином и проназой [32].
Нет метода сепарации клеток, сравнимого по чувствительности и эффективности с ИМС. Метод ИМС с успехом применили при выделении специфичных к аллергену В-клеток из пе-
4
риферической крови, где их содержание составляет 1:10 [62], и при выделении клеток плода, встречающихся в материнской периферической крови с частотой не более 1:10 [51].
Высокая чувствительность метода ИМС позволяет преодолеть сложности, возникающие при выделении СКК. Основные затруднения связаны с низкой концентрацией этих клеток
Gladbach, Germany) reaches a 95.5% CD34* cell content in the resultant fraction with a 91.5% isolation of the cells from the source suspension [70,75]. Compare with column immuno-adsorption providing purity of CD34 cell fraction ranging from 49 to 72% [34,35,55].
Functional and morphological characteristics of CD34 hemopoietic precursor cells isolated from bone marrow by P1MS using a MiniMACS separator without MS splitting-off to follow. IMS was stopped at MS-cell complex separation. MS particles remaining on cells (950 nm ferrite nuclei were not removed) produced but a slight slow-down effect on cell differentiation and maturation [89].
It was found that the number of stem cells isolated by IMS was proportional to their initial concentration and therefore depended only on efficacy of previous mobilization and volume of leukocyte mass used. Amount of CD34 cell produced by IMS from a single leukapheresis was enough to maintain hemopoietic function at least after two cycles of high-dose chemotherapy in most (61.5%) patients. CD34+ transplanted volume is much less as compared to leukocyte mass. This provides the advantage of simpler graft cryoprotection and storage and less dimethylsulfoxide penetrating in the patient's body with the cryoprotector and producing toxic effects [66]. Clinical trials of CD34 grafts found no side effects related to possible presence of IMS reagents in the grafts. Many patients with hematological malignancy [80] and neuroblastoma [58] demonstrated hemopoiesis recovery, lower rates of recurrence and no side effects related to CD34* cell IMS.
Immunomagnetic Separation in Combination with Immunofluorescence Assay
Immunofluorescence assay (IFA) is a common technique for specific separation of cell mixtures that is based on selective binding of fluorescent labels with cell surface markers. However, its application is limited due to low cell marker expression and low concentration of antigen-positive cells in the mixture analyzed. The IFA has the disadvantage of low performance speed during separation: performance of flow cytofluorimeter is about 10 cells/h which is not acceptable for separation of large amounts of cells. Alternative cell mixture separation methods such as panning, rosette-formation and complement-depend-ent lysis are rather fast but have low sensitivity and selectivity, are associated with cell loss and require many reagents. IMS of initial cell suspension preceding IFA helps to overcome these difficulties. The IMS can process more than 10 cells for 15 min and provides suspension enrichment with Ar cells by more than two orders of magnitude. The depletion results in reduction in Ar -free cells by several thousand times. The IMS-IFA combination may be used to process suspension with a large number of cells. The IMS-IFA method involves the use of 200-400 nm magnetic liposomes coated with fluorescein molecules and having a ferrite nucleus 50-100 nm in diameter. The liposome conjugation with monoclonal antibodies ensures their selective binding with target cells. The resultant label fluorescence is two or three orders higher as compared to FITC-conjugated antibodies; the liposomes are fluorescent MS. This helps to perform IMS of the initial cell mixture before IFA of cell populations [90].
(клетки-предшественники гематопоэза составляют в среднем 0,1% фракции мононуклеарных клеток периферической крови здорового донора), а также малое число экспрессируемых ими поверхностных маркеров. В клинической медицине методами ИМС СКК решают задачи, связанные с трансплантацией костного мозга. Чистые популяции стволовых клеток необходимы для изучения их морфологии и функции в культуре in vitro [36]. Кроме того, выделенные ИМС стволовые клетки используются для трансфекции при создании генно-инженерных вакцин, применяемых в терапии онкологических и генетических заболеваний [24, 64, 82, 97, 100].
Методом ИМС из продуктов лейкафереза больных раком молочной железы получены CD34 -клетки. ИМС лейкоцитов проводили сразу после процедуры лейкафереза. Содержание CD34 -клеток в лейкоцитных массах 25 пациенток составляло в среднем 1,05% (от 0,21 до 3,12%). ИМС осуществляли на устройстве Baxter Isolex 300 SA Magnetic Cell Separation System. Конъюгаты клеток на MC, составляющих позитивную фракцию, обрабатывали химопапаином для отщепления МС. Полученные популяции содержали в среднем 95,1% клеток, экспрессирующих С034-маркер, и составляли 0,94% исходного клеточного материала. Таким образом, ИМС позволила выделить до 78% CD34 -клеток из общего числа клеток, имеющихся в лейкопитной массе. Полученные клетки использовали при аутотрансплантации для нормализации кроветворения после высокодозной химиотерапии. Для увеличения числа циркулирующих в крови стволовых клеток проводили их мобилизацию путем подкожного введения R-metHuG-CSF [60]. Эффективность ИМС на магнитном сепараторе MACS («Miltenyi Biotech GmbH», «Bergisch Gladbach», Германия) достигает 95,5% содержания CD34 -клеток в полученной фракции при их 91,5% извлечении из исходной суспензии [70, 75]. Эффективность иммуноадсорбции на колонке меньше эффективности ИМС, чистота выделяемых фракций CD34 -клеток колеблется между 49 и 72% [34, 35, 55].
Определены функциональные и морфологические характеристики CD34 -клеток — предшественников гематопоэза, выделенных из костного мозга методом ПИМС на сепараторе Mi-niMACS («Miltenyi Biotech», Германия) без последующего отщепления МС. Процесс ИМС заканчивался на стадии выделения комплекса МС — клетка. Частицы МС, остающиеся на клетках (ферритовые ядра диаметром 50 нм не удалялись), незначительно замедляли дифференцировку и развитие клеток-предшественников [89].
Отмечено, что количество выделяемых при ИМС стволовых кроветворных клеток пропорционально их исходному содержанию и, таким образом, зависит лишь от эффективности предварительной мобилизации и объема взятой лейкоцитной массы. Количества CD34 -клеток, полученных с помощью ИМС из продуктов однократно произведенного лейкафереза, было достаточно для поддержания кроветворных функций, по меньшей мере, после двух циклов высокодозной химиотерапии у большинства (61,5%) пациентов. Обьем CD34 -клеток, трансплантируемых больным, много меньше объема лейкоцитой массы. Это дает преимущества перед методом пересадки костного мозга: упрощаются процедуры криопротекции и хранения трансплантата с последующим значительным снижением количества диметилсульфоксида, попадающего в организм
Combinations of Immunomagnetic Separation with PCR
of mRNA (RT-PCR), DNA (PCR) and Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)
Polymerase chain reaction for DNA amplification (PCR) and its modifications provide analysis of target genomes and detection of needed cells in specimens. However the PCR has a number of limitations. There is a rather high probability of false-negative result if a small amount of material to be detected is present in the specimen assayed. These situations are hazardous when tumor micrometastases or pathogens are to be found.
Preliminary separation of specimens to be tested for pathogens requires the specimen to be cultured in selective media. IMS helps to achieve the same goal but much faster. Further culture and identification of isolated cells is made by conventional microbiological, biochemical, immunological and molecular techniques [86,98].
The combined utilization of IMS of pathogenic cells with PCR to follow reduces time of the study to several hours and provides higher sensitivity and specificity of detection. Besides, the amplified DNA fragments are conjugated with a specific signal label and biotin to be isolated with streptavidin-coated MM. Further analysis of such specimens may be performed by methods simpler than standard gel-electrophoresis. This method allows preparation and sequencing of20-30 different sequences of300 to 600 nucleotides for 12 to 24 h [81]. The combined IMS-PCR assay of malignant cells is superior by specificity and efficiency than all other methods [72].
Preliminary IMS of bone marrow with fluorescent in situ hybridization (FISH) to follow and analysis of breast cancer micrometastases were successfully used in experiments with artificial cell mixtures. Positive IMS allows identification of cancer cells by FISH analysis in specimens with a 1:10 ratio of tumor to normal cells [50].
A universal IMS with analysis and sorting by flow cytometry [77] was developed on the basis of NMS [73]. The investigators used 100 nm magnetite-dextrane MM. Cell labeling consisted of three steps. The first step is cell labeling with biotin-conjugated antibodies. The second step consists of cell incubation with fluo-rescein-streptavidin. Finally, the fluorescent target cells are bound to MM through avidin-biotin complex. The whole procedure takes about 30 min. Since the MS possess low specific magnetization the cell separation is conducted in an NPMF of 0.6 T in a MACS (Miltenyi Biotech GmbH, Germany) permanent magnet system. The cell-MS complex-containing suspension is transferred in a column filled by 2-4% of volume by stainless steel fibers. The cell-MS complex is captured by the magnetized fibers. Fiber surface area, column volume and elution rate are determinant factors for binding capacity of the device and are selected specially for specific goals. The use of this sorbent in the NMS system allows both PIMS of antigen-positive cells and depletion. Owing to a small diameter of ferrite nuclei the magnetite-dextrane MS has no effect on optic characteristics of the cells bound and is not toxic in recommended doses. This advantage as well as the presence of fluorescein-streptavidin in MS make the methods a useful supplement to IFA [77].
In summary, IMS of cell suspension is an important component of many analytical and functional biological studies and becomes wider applied in clinical medicine. The IMS technology
реципиента в составе криопротектора и проявляющего выраженный токсический эффект [66]. При клинических испыта-+
ниях CD34 -трансплантатов определили отсутствие побочных эффектов, связанных с возможным присутствием в трансплан- 1 татах реагентов, использовавшихся при ИМС. Восстановление кроветворных функций, снижение числа рецидивов и отсутствие побочных эффектов, связанных с процедурой ИМС С034+-клеток, отмечено у больных онкогематологическими заболеваниями [80] и нейробластомой [58].
Комбинация иммуномагнитной сепарации и иммунофлуоресцентного анализа
Иммунофлуоресцентный анализ (ИФА) является общепринятой технологией специфического разделения клеточных смесей, основанной на избирательном связывании флуоресцентных меток с поверхностными клеточными маркерами. Однако область его применения ограничена уровнем экспрессии клеточного маркера и количеством антигенположитель-ных клеток в анализируемой смеси, существенным недостатком ИФА является низкая скорость обработки материала при процедуре сепарации: пропускная способность проточного цитофлуориметра около 10 клеток/ч, это неприемлемо при сепарации большого числа клеток. Альтернативные методы разделения клеточных смесей: пэннинг, розеткообразование и комплементзависимый лизис, обеспечивают высокую скорость обработки материала, но не обладают высокой чувствительностью и селективностью, ведут к потерям клеток и требуют большого числа дефицитных реагентов. ИМС исходной клеточной суспензии, предшествующая ИФА, устраняет перечисленные трудности. ИМС позволяет в течение 15 мин обра-
9 +
ботать более 10 клеток с обогащением суспензии Аг -клетками более чем на два порядка, в результате истощения в тысячи раз
+
сокращается число клеток, не экспрессирующих Аг -маркер. Комбинация ИМС с ИФА позволяет обрабатывать суспензии, содержащие большие количества исходных клеток. Методика комбинированного использования ИМС и ИФА основана на применении магнитных липосом диаметром 200—400 нм, покрытых молекулами флуоресцеина и содержащих ферритовое ядро диаметром 50—100 нм. Конъюгация липосом с моноклональными антителами обеспечивает их последующее селективное связывание с клетками-мишенями. Интенсивность флуоресценции метки, получаемой этим способом, повышается на два три порядка по сравнению с конъюгатами антител с FITC; полученные липосомы являются флуоресцирующими МС. Это позволяет перед ИФА клеточных субпопуляций осуществить ИМС исходной клеточной смеси [90].
Комбинированные методы иммуномагнитной сепарации с методами PCR мРНК (RT-PCR-анализ), ДНК (PCR-анализ) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH-анализ)
Метод полимеразной цепной реакции амплификации ДНК (PCR-анализ) и его модификации позволяют по фрагментам нуклеотидов анализировать геномы объектов-мишеней и выявлять в образцах нужные клетки. Однако PCR-анализ имеет ряд недостатков и ограничений. При исследованиях методом PCR есть вероятность получения ложноотрицательных результатов в тех случаях, когда выявляемый объект присутствует в пробе в незначительных количествах. Такие ситуации опасны при
involves fast, low labor-consuming but highly efficient separation ofinitial materials. The method is universal and allows depletion, positive IMS or their combination to be used to separate various cells and subcellular structures. Non-toxic immunomagnetic sorbents and separation procedure have no adverse effects on optical characteristics, vitality, morphology or functional properties of cells, and the isolated cell-MS complex may therefore by further used for culture, analysis and even for clinical purposes. The preliminary immunomagnetic separation makes simpler, more effective and sensitive such technologies as immunofluorescent assay, cell sorting, polymerase chain reaction of mRNA (RT-PCR), DNA (PCR), fluorescent in situ hybridization (FISH).
Immunomagnetic separation of stem hemopoietic cells is superior in efficacy to all other methods. The above-mentioned results are evidence of efficacy of immunomagnetic separation of stem hemopoietic cells using magnetic separators and of successful clinical tests of grafts produced using this technique.
Acknowledgment. The authors gratefully acknowledge the assistance of scientists from the Institute of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors E. A. Golenkina and P. K. Ivanov, M.D. in collection of literature for this review.
This study was supported by RFFI grant 02-01-006 94.
определении микрометастазов опухолей и при выявлении патогенных микроорганизмов.
Для предварительной сепарации образцов, проверяемых на наличие патогенных микроорганизмов, обычно их культивируют на селективных средах. Та же цель, но с меньшими затратами времени, достигается ИМС исследуемого образца. Дальнейшее культивирование и идентификация выделенных клеток осуществляются традиционными микробиологическими, биохимическими, иммунологическими и молекулярными методами [86, 98].
Комбинированное использование предварительной ИМС популяции патогенных клеток и последующей PCR-идентификации позволяет сократить общее время исследования до нескольких часов с одновременным увеличением чувствительности и специфичности определения. Более того, амплифицированные фрагменты ДНК после включения в них специфической сигнальной метки и биотинилирова-ния изолируются ММ, покрытыми стрептавидином. Дальнейший анализ такого образца проводят более простыми методами, чем гель-электрофорез, традиционно применяемый в таких случаях. Последовательности ампликонов ДНК, связанных МС, определяют их автоматическим сек-венированием. Этот метод позволяет подготовить и секве-нировать 20—30 разных последовательностей длиной в 300—600 нуклеотидов в течение 12—24 ч [81]. Комбинированный метод ИМС и PCR-анализа злокачественных клеток превосходит в специфичности и эффективности обнаружения все известные методы [72].
Предварительная ИМС костного мозга с последующей флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH-выявление) и анализ микрометастазов рака молочной железы успешно использованы в экспериментах на искусственно созданных
смесях клеток. Позитивная ИМС позволила идентифицировать раковые клетки методом FISH в образце при соотношении опухолевых и нормальных клеток 1:10 [50].
На основе НМС [73] разработан универсальный способ ИМС клеток с последующим их анализом и сортировкой методом проточной цитофлуориметрии [77]. Исследователи использовали магнетито-декстрановые ММ диаметром около 100 нм. Процесс мечения клеток состоит из трех стадий. На первой стадии клетки метят биотинилированными антителами. На второй стадии клетки инкубируют с флуоресцеин-стрептави-дином. И наконец, флуоресцирующие клетки-мйшени связывают с ММ посредством авидин-биотинового комплекса. Вся процедура занимает около 30 мин.
Учитывая низкую удельную намагниченность МС, сепарацию клеток проводят в НПМП индукцией 0,6 Тл в системе постоянных магнитов MACS («Miltenyi Biotech GmbH», Германия). Суспензию содержащую комплекс клетка — МС, помещают в колонку, заполненную на 2—4% объема волокнами нержавеющей стали. Комплекс (клетка — МС) удерживается намагниченными волокнами. Площадь поверхности волокон, объем колонки и скорость элюции определяют связывающую способность устройства и подбираются с учетом конкретной задачи. Использование этого сорбента в системе НМС позволило успешно осуществись как ПИМС антигенпо-ложительных клеток, так и истощение.
Магнетито-декстрановый МС, благодаря малому диаметру ферритовых ядер, не влияет на оптические характеристики связанных им клеток, он нетоксичен в применяемых дозах. Это преимущество, а также одновременное включение в состав МС флуоресцеин-стрептавидина, делают разработанную методику сепарации важным дополнением ИФ-анализа [77].
Разбор приведенных выше данных показывает, что ИМС клеточных суспензий является неотъемлемой стадией множества аналитических и функциональных биологических исследований, а также находит все более широкое применение в клинической медицине. Технология ИМС включает быструю, нетрудоемкую, но при этом высокоэффективную сепарацию исходного материала.
Метод универсален, он позволяет осуществить истощение, позитивную ИМС и их комбинацию в процессе разделения различных клеток и субклеточных структур. Нетоксичные им-муномагнитные сорбенты и процедура сепарации не оказывают существенного влияния на оптические свойства, жизнеспособность, морфологию и функциональные качества клеток, благодаря чему выделяемый комплекс (клетка — МС) может далее использоваться для культивирования, анализа, а также в клинических целях. Предварительная иммуномагнитная сепарация позволяет значительно упростить, повысить эффективность и чувствительность таких методов, как иммунофлуорес-центный анализ и сортировка клеток, метод полимеразной цепной реакции амплификации мРНК (RT-PCR-анализ), ДНК (PCR-анализ) и флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH-анализ).
Из рассмотренных методов технология иммуномагнитной сепарации стволовых кроветворных клеток по своей эффективности не имеет равных. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности иммуномагнитной сепарации стволовых кроветворных клеток с помощью магнитных
сепараторов и об успешных клинических испытаниях трансплантатов, полученных этим методом.
Авторы выражают благодарность сотрудникам НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей аспирантке Е.А. Голенкиной и доктору мед. наук П. К. Иванову за помощь в подборе литературы к данной статье.
# Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 02-01-00694.
ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES
1. Анашкин О. П., Брусенцов И. А., Лыков В. В. и др. // Вопросы атомной науки и техники. Сер. общ. ядерн. физ. — 1987. — С. 52-53.
2. Анашкин О. П., Брусенцов Н. А., Лысенко В. В., Миронова И. Б. // Магнитная гидродинамика. — 1990. — № 1. — С. 77—81.
3. Барышников А. Ю., Блохин Д. Ю., Глухоедов Н. П. и др. Ц Научно-технический сборник ЭВРИКА, Министерство оборонной промышленности Российской Федерации,
НТЦ ИНФОРМАТИКА. - 1995. - № 6. -
С. 13-14.
4. Барышников А. Ю., Блохин Д. Ю., Глухоедов Н. П. и др. // Патент РФ № 20892222 от 10.09.97.
5. Брусенцов И. А. // IV Всесоюзн. конф. по магнит, жидкостям.
Т. 1. — Иваново, 1985. — С. 63, 64.
6. Брусенцов Н. А. //ЖВХО им. Д. И. Менделеева. — 1987. —
Т. 32, № 5. - С. 562-569.
7. Брусенцов Н. А. // Там же. — 1990. — Т. 35. — С. 759—766.
8. Брусенцов Н. А., Аутеншлюс А. И. // Тезисы докладов VI Всесоюзн. конф. по магнитным жидкостям.— М., 1991. —
Т. 1. - С. 46, 47.
9. Брусенцов Н. А: // Хим.-фарм. ж. — 1996. — № 9. — С. 3—11.
10 Брусенцов Н. А., Брусенцова Т. Н. Сергеев А. В., Шумаков Л. И. // Хим.-фарм. ж. — 2000. — Т. 34, № 4. — С. 38—43.
11 Брусенцов Н. А., Глазкова Т. 10., Яворская Н. П., Юрченко Н. Я. Ц Экспер. онкол. — 1990. — Т. 12, № 6. — С. 59, 60.
12. Брусенцов Н. А., Гогосов В. В., Лукашевич М. В. //
Хим.-фарм. ж. — 1996. — № 10. — С. 48—53.
13. Брусенцов Н. А., Гогосов В. В., Гендлер Т.С. //Тамже. — 1999. — № 1.-С. 9-12.
14. Брусенцов Н. А., Лукашевич М. В., Гогосов В. В. // Магнитная гидродинамика. — 1994. — Т. 30, № 2. — С. 215—218.
15. Брусенцов Н. А., Лыков В. В. // ЖВХО им. Д. И. Менделеева. —
1989. - Т. 34, № 5. - С. 566-572.
16. Брусенцов Н. А., Юрченко Н. Я., Осипов Н. Е. и др. //
VIII Международная плесская конференция по магнитным жидкостям. Сборник научных трудов. — Плес, 1998. — С. 170-173.
17. Глухоедов Н. П., Ершов О. Л., Иванов П. К. и др. // Тезисы 1-й Международной плесской конференции по магнитным жидкостям. — Плес, 1996. — С. 136.
18. Иванов П. К., Блохин Д. Ю., Барышников А. Ю. идр. //Тезисы 1-й Международной конференции «Иммуномагнетики и иммунотерапия». — Витебск, 1995. — С. 202,203.
19. Иванов П. К., Брусенцов И. А., Блохин Д. Ю. и др. Ц Труды девятой Международной плесской конференции по магнитным жидкостям. — Плес, 2000. — Т. 2. —
С. 303-308.
20. Лукьянчикова И. Л., Брусенцов Н. А., Аутеншлюс А. И. Ц Бюллетень сибирского отделения АМН СССР. — 1989. —
№ 1.-С. 17-21.
21. Митин В. Н., Брусенцов Н. А. // IV Всесоюзн. конф. по магнит, жидкостям, Т. 1. — Иваново, 1985.— С. 218, 219.
22. Сенин В. М., Брусенцов Н. А., Лаптев В. П., Афанасьева А. В. // Там же.-С. 91.
23. СыркинА. Б., Юшков С. Ф., Булычев Ю. Н. и др. // Экспер. онкол.
- 1990. - Т. 12, № 5. - С. 71-73.
24. Adema G. J., Hangers F., Verstraten R. et al. // Nature. — 1997. — Vol. 387.-P. 713-717.
25. Anashkin 0. P., Brusentsov N. A., Lysenko V. V, Mironova I. B. // The Proc. of the first Japan CIS joint seminar on electromagnetomechanics in structures. Tokyo. Jap. Soc. App. Electromagn. (JSAEM). —
1992. - P. 85-88.
26. Anashkin O. P., Brusentsov N. A., Dmitrieva V. E. et al. // Programme and abstracts sixth international conference on magnetic fluids. —
Paris, 1992. - P. 484,485.
27. Anderson G., Owen J. Т., Moore N. C., Jenkinson E. J. // J. Immunol. —
1994. - Vol. 153. - P. 1915-1920.
28. Andrews R. G., Bartelmez S. H., Knitter G. H. // Blood. — 1991. — \Ы. 78. — Suppl. 1. — P. 257 (Abstract).
29. Autenshlyus A. L., Brusentsov N. A. // Programme and abstracts sixth international conference on magnetic fluids. — Paris, 1992. —
P. 86,487.
30. Autenshlyus A. L., Brusentsov N.A., LockshinA. //J. Magnet. Magn. Mater. - 1993. -Vol. 112. — P. 360-363.
31. Banchereau J., Steinman R. M. // Nature. — 1998. — Vol. 392. — P. 245-252.
32. Baxter report series № 0.0006, 0007, ISOLEX® 300 Magnetic cell separator system, Performance of Isolex® System with PR34 Releasing Agent.
33. Bensinger IV. I., Berenson R. J., Andrews R. G. //J. Clin. Apheresis. —
1990. - Vol. 5. - P. 74-76.
34. Berenson R. J., Bensinger W. I., HillR. S. etal. // Blood. — 1991. —
Vol. 77.-P. 1717-1722.
35. Brugger W., HerschelR., HeimfeldS. etal. // Ibid. — 1994. —
Vol. 84.-P. 1421-1426.
36. Brugger W., Mocklin W., Heimfeld S. et al. // Ibid. — 1993. —
Vol. 81. - P. 2579-2584.
37. Brusentsov N. A. // Abstracts of Eight International Conference on Magnetic Fluids. — Timisoara, Romania, 1998. —
P. 152, 153.
38. Brusentsov N. A., Gendler T. S., Haliulina E. A., NovakovaA. A. //
9-th IPCMF-2000, Book of abstracts. — 2000. — P. 77—79.
39. Brusentsov N. A., Gogosov V. V., Brusentsova T. N. et al. //Third international conference on the scientific and clinical applications of magnetic carriers. — Rostock. Germany, 2000. — P. 22.
40. Brusentsov N. A. Lukashevich М. V, Lykov V. V. et al. // Abstracts of fifth in-temational conference on magnetic fluids. — Salaspils, 1989. — P. 258, 259.
41. Brusentsov N. A., Lucashevich М. V., LockshinA. // Programme and abstracts sixth international conference on magnetic fluids. — Paris,
1992. - P. 482, 483.
42. Brusentsov N. A., Shevelev A. A., Lukashevich М. V. etal. //Abstracts of the seventh international conference on magnetic fluids. — Bhavnagar, India, 1995. - P. 243, 244.
43. Brusentsov N. A., Jurchenko N. Y., Razumovsky V. A. et al. // Ibid. —
P. 275-276.
44. Brusentsov N. A., Jurchenko N. Y., Javorskay N. P. et al. // Ibid. —
P. 239-240.
45. Brusentsov N. A., Jurchenko N. Y, Osipov N. E. et al. // The 8-th international Plyos Conference on magnetic fluids. Book of abstracts. - 1998. - P. 87, 88.
46. Civin С. /., Loken M. R. I I Intern. J. Cell Cloning. — 1987. — \fol. 5. — P. 267-288.
47. Civin С. I., FackierM. J., Trischmann Т. M. etal. // Bone Marrow Purging and Processing. Inc. — 1990. — P. 387—402.
48. Combaret V, FavrotM. S., Chauvin F., BouffetE. // J. Immunogenet. —
1989.-Vol. 16.-P. 125-136.
49. Conrad-Lapostolle V, Bordenave L., Baquey C. // Cell. Biol. Toxicol. — 1996. - Vol. 12, N 4-6. - P. 189-197.
50. ForusA., HoifodtH. K., OverliG. E. etal. // Mol. Pathol. — 1999.
- Vol. 52, N 2. — P. 68-74.
51. Ganshiet-AhlertD., Brjesson-StollR., BurschykM. etal. //
Am. J. Reprod. Jmmunol. — 1993. — Vol. 30, N 2—3. —
P. 194-201.
52. Gaudernack G., Leivestad T., Ugelstad J., Thorsby E. //
J. Im. Methods. - 1986. - Vol. 90. - P. 179-187.
53. Gendler T. S., Novakova A. A., Brusentsov N. A. // Programme and abstracts sixth international conference on magnetic fluids. —
Paris, 1992. - P. 488, 489.
54. Gomez D. E„ HartzlerJ. Corbitt R. H. et al. // In Vitro Cell Dev Biol. Anim. - 1993. - Vol. 29A, N 6. - P. 451-455.
55. Gorin N. C., Lopez M., Laporte J. P. et al. // Blood. — 1995. —
Vol. 85. - P. 1647-1654.
56. Guedson J. L., Avrameas S. // Immunochemistry. — 1977. —
Vol. 14. — P. 443.
57. Haik Y, Pai V, Ching-Jen Chen. // J. Magnet. Magn. Mater. — 1999. - Vol. 194, N 1-3. - P. 254-261.
58. HandgretingerR., GreilJ., Schirmann U. etal. //J. Hematother. — 1997. - Vol. 6, N 3. - P. 235-242.
59. Hatch G. P., Stelter R. E. 11 J. Magnet. Magn. Mater. — 2001. — Vol. 225, N 1-2. - P. 262-276.
60. Hohaus S., Pforsich M., Murea S. et al. // Br. J. Hematol. —
1997. - Vol. 97. - P. 881-888.
61. Horton J. K., Evans O. M., Swann K, Swinbum S. //
J. Immunol. Meth. - 1989. - Vol. 124. - P. 225-230.
62. Irsch J., Hunzelmann N., Tesch H. et al. // lmmunotech. — 1996. — Vol. 1,- P. 115-125.
63. Ivanov P. K., Blokhin D. Yu., Baryshnikov A. Yu. etal. // 7-th Interntl. Congress on Anti-Cancer Treatment. — Paris, 1997. —
P. 166, poster P163.
64. Karsson S., Correll P. H., Xu L. // Bone Marrow Transplant. —
1993. - Vol. 11, Suppl. 1. - P. 124-127.
65. Kemshead J. T., Ugelstad J. //Mol. Cell. Biochem. — 1985. —
Vol. 67. — P 11—18.
66. Kemshead J. T., Heas L., Gibson F. M., Katz F., Br. // J. Cancer. — 1986. - Vol. 54. - P. 771-778.
67. Kuznetsov O. A., Brusentsov N. A., Kuznetsov A. A. et al. //
J. Magnet. Magn. Mater. — 1999. — Vol. 194, N 1—3. — P. 83—89.
68. Lesson E., HaflanA.-K., Rian A., Rasmussen A.-M. //
Third international conference on the scientific and clinical applications of magnetic carriers. — Rostock, Germany, 2000.
- P. 39.
69. Lea T., Vartdal F., Nustad K. et al. // J. Mol. Recog. — 1988. —
Vol. 1, N 1. — P. 9—18.
70. Liberti P. A., Rao C. G., Terstappen L. W. M. M. // J. Magnet.
Magn. Mater. - 2001. — \bl. 225, N 1-2. - P. 301-307.
71. LubbeA. S., Bergemann C. // Scientific and clinical applications of magnetic carriers. Ed. Hafeli et al. Plenum Pres, New York,
1997.-P. 457-480.
72. Maas R. A., Bruning P. F., BreedijkA. P. etal. // Lab. Invest. —
1995. - Vol. 72. - P. 760-784.
73. Magnetic cell sorting and separation of biomolecules (2000)
MACS, Miltenyi Biotec GmbH, Germany.
74. Mapara M. Y., Komer I. J., Hildebrandt M. etal. j I Blood. —
1997. - Vol. 89. - P. 337-344.
75. McNiece I., Briddell R., Stoney G. et al. // J. Hematother. —
1997. — V>1. 6, N 1. — P. 5—11.
76. Methods in Molecular Biology, Vol. 10: Immunochemical Protocols pp. 347—357, 1992, Ed.: M. M. Manson. The Humana Press, Inc., Totowa, NJ.
77. Miltenyi S., Muller W., Weichel W., RadbruchA. // Cytometry. —
1990. - Vol. 11. - P. 231-238.
78. Moore L. R., Rodrigues A. R., Williams P. S. et al. // J. Magnet. Magn. Mater. - 2001. - Vol. 225, N 1-2. - P. 277-284.
79. Novakova A. A., Gendler T. S., Brusentsov N. A. // Hyperfme Interactions. —1992. — Vol. 71. — P. 1315—1318.
80. Ogura M., Kagami Y, Suzuki R. etal. // Cancer Chemother. Pharmacol. — 1997. — Vol. 40. — Suppl. — P. 51—57.
81. OlsvikO., Popovic T., Skjerve E. etal. // Clin. Microbiol. Rev. — 1994. -Vol. 7, N 1,-P. 43-54.
82. O'Shaughnessy J. A., Cowan K. II., NienhuisA. W. et al. II Hum. Genet. Ther. - 1994. - Vol. 5, N 7. - P. 891-911.
83. Ossendorp F. A., Bruning P. F., Van den Brink J. A., De Boer M. // J. Immunol. Methods. - 1989. - Vol. 120, N 2. - P. 191-200.
84. OsterJ., Parker J., Brassard L. //Third international conference on the scientific and clinical applications of magnetic carries. — Rostock, Germany, 2000. — P. 29. ■
85. Partington K. M., Jenkinson E. J., Anderson G. //J. Immunol. Meth. — 1999. - Vol. 223. - P. 195-205.
86. Porter J., Robinson J., Pickup R., Edvards C. // J. Appl. Microboiol. —
1998. - Vol. 84, N 5. - P. 722-732.
87. Sanderstorm C. E., Bender J.G., Papoutsakis E. T., Miller W. M. // Blood. - 1995. - Vol. 86. - P. 958-970.
88. Sedgwick J. B., Shikama Y., Nagata M. etal. //J. Immunol. Methods.
- 1996. - Vol. 198, N 1. - P. 15-24.
89. Servida F., Soligo D., Caneva L. etal. // Stem Cells. — 1996. — Vol. 14, N 4. - P. 430-438.
90. Scheffold A., Miltenyi S., Radbruch A. // Immunotech. — 1995. —
Vol. l.-P. 127-137.
91. Schmitz B., Radbruch A., Kummel T. et al. // Eur. J. Haematol. —
1994. - Vol. 52, N 5. - P. 267-275.
92. Syrkin A. B., Brusentsov N. A. // Programme and abstracts sixth international conference on magnetic fluids. — Paris, 1992. — P. 480, 481.
93. Tchikov V., Schultze S., Kronke M. // J. Magnet. Magn. Mater. —
1999. - V>1. 194, N 1-3. - P. 242-247.
94. Tctikov V., Winoto-Morbach S., Kabelitz D., Schutze S. // Ibid. — 2001. - Vol. 225, N. 1-2. — P. 285-293.
95. Todd P., Cooper R. P., Doyle J. F. etal. // Ibid. —2001. — Vol. 225, N1-2.-P. 294-300.
96. Ugelstad J., Soderberg L., BergeA., Bergstrom J. // Nature. — 1983.
- Vol. 303. - P. 95-96.
97. Ward M., Richardson C., Pioli P. et al. // Blood. — 1994. — Vol. 84. -P. 1408-1414.
98. Wright D. J., Chapman P. A., Siddons C. A. // Epidemiol. Infect. —
1994. - Vol. 113, N 1. - P. 31-39.
99. Wright A. P., FitzgeraklJ. J., Colello R. J. // J. Neurosci.
Methods. - 1997. - Vol. 74, N 1. — P. 37-44.
100. Xu L., Stahl S. K., Dave H. P. etal. // Exp. Hematol. — 1994. — Vol. 22. - P. 223-230.
101. Zborowski M., Sun L., Moore L. R. et al. // J. Magnet. Magn. Mater. - 1999. - Vol. 194, N 1-3. - P. 224-230.
Поступила 15.11.01 / Submitted 15.11.01
