CC BY
73
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ
УДК 616-006-073.8:615.847.8
BIOMAGNETIC PREPARATIONS FOR DIAGNOSTICS AND THERAPY
P. К. Ivanov', D. Yu. Blokhin'. E.A. Golenkina1, V.l. Filippov2, O.L. Ershov2 ’N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS Scientific Manufacturing Center «MedBioSpectrum», Ltd.
ABSTRACT
Biomagnetic preparations represent a structural composite of micromagnetic particles and bioactive macromolecules.
Forming less bulky and more effective in comparison with traditional technology approaches of work with biomaterials, biomagnetic sorbents can be used in PCR-diagnostics, immunomagnetic stem cell separation, in research of tumor and normal cells surface interactions.
Matrix for PCR- biomagnetic sorbents (Ferrosils) created is magnetic materials on the basis of the silicates received by processing of magnetit colloids or alpha-iron by silicon-organic compounds. Ferrosils were shown to have specific capacity concerning virus DN A without inhibition of PCR analysis.
Within the framework of the project on creation of human hemopoietic cell selection system immunomagnetic separation device for blood and a bone marrow cell selection was developed. The separator constructed has received the Gold medal of the International Interior of Inventions «Eureka — 95» (Brussels, EU).
We also managed to receive Ferrosil conjugated with MoAbs against human T-lymphocyte FAS-receptor. The conjugate obtained has proved to be a convenient tool when studying intracellular apoptotic signals.
Creation of a wide spectrum of biomagnetic preparations promotes realization of technological break in biomedical areas especially in the areas connected with nanobiotehhnologies.
БИОМАГНИТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ
ПК. Иванов', Д. Ю. Блохин', Е.А. Голенкина1, В. И. Филиппов2, О.Л. Ершов2 'ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН 2Научно-производственный центр «МедБиоСпектр»
РЕЗЮМЕ
Биомагнитные препараты представляют собой структурный композит микромагнитных частиц и биоактивных макромолекул.
Формируя менее громоздкую и более эффективную по сравнению с традиционными подходами технологию работы с биоматериалами, биомагнитные сорбенты уже сегодня могут использоваться в диагностике методом полимеразной цеппой реакции (ПЦР). иммуномапштной сепарации гемопоэтических клеток, исследованиях рецепторно-лигаидных взаимодействий на поверхности опухолевых и нормальных клеток.
Матрицей для ПЦР-биомагнитных сорбентов (Ферросилов) являются магнитные материалы па основе силикатов, получаемые обработкой коллоидной суспензии магнетита или альфа-железа кремннй-органичес-кими соединениями (силиконами, силанами). Использование сорбентов серии Ферросил не ингибирует полимеразную реакцию: по специфической емкости в отношении вирусной ДИК сорбенты Ферросил не уступают лучшим зарубежным аналогам (Merck, Micromod), превосходя по этому показателю продукцию других фирм.
В рамках проекта по созданию отечественной системы предтрансплантационной селекции гемопоэтических клеток человека разработан иммуномагнитный сепаратор клеток крови и костного мозга марки МСК-1
(головной разработчик — ЦНИИТОЧМАШ). защищенный Патентом РФ, экспериментальный образец которого получил Золотую медаль Международного Салона Изобретений «Эврика-95» (Брюссель. ЕС).
Используя технологию активации Ферросила тетрахлоридом титана с иммобилизацией на его поверхности моноклональных антител к РаБ-рецептору Т-лимфоцитов человека, нам удалось получить иммуномагнитный препарат, сохранивший специфичность иммобилизованных антител в отношении антигена, но изменивший их биологическую активность, что сделало его удобным инструментом для изучения клеточных сигналов апоптоза.
Создание широкого спектра биомагнитных препаратов способствует осуществлению технологического прорыва в биомедицинских областях, особенно связанных с нанобиотехнологиями.
Биомапштные препараты — это ферро- или супер-парамагнитные микро- и наиочастицы со специфически модифицированной поверхностью, на которой иммобилизованы определенные биологически активные лиганды, определяющие их специфичность. Специфическая активность лигандов в сочетании с магнитной восприимчивостью (следовательно — магннтоуправ-ляемостью) матрицы создают широкие возможности применения подобных препаратов в экспериментальной и клинической медицине, в частности, в онкологии.
Таким образом, биомагнитные препараты представляют собой структурный композит микромагнит-ных частиц и биоактивных макромолекул. В свою очередь, микромагнитные частицы являются собственно микродисперсным ферро(суперпара (магнетиком, инкапсулированным в полимерную матрицу [6].
Общие требования, предъявляемые к микромаг-иитным частицам:
1) высокая намагниченность насыщения, обеспечивающая их надежное удерживание в неоднородном магнитном поле с минимально возможной величиной магнитной индукции;
2) минимальная величина остаточного магпетиз-ма. приводящего к нежелательной агрегации частиц после воздействия магнитного поля:
3) материал матрицы и архитектура микрочастиц, стабильные в физиологических условиях применения и хранения, исключающие «вытекание» и химическое разрушение их ферро(суперпара)магнитного компонента:
4) невысокая плавучая плотность и гидрофильная поверхность микрочастиц, необходимые для манипуляций с ними в физиологических средах;
5) форма микрочастиц, приближенная к сферической. и их узкий фракционный состав, поскольку стабильность специфических свойств определяется равенством соотношения объема частицы (магнитныесвойства) к ее поверхности (количество биоактивного лиганда);
6) стабильные специфические свойства поверхности частиц в отношении связывания целевого биологического продукта.
Два первых требования определяют выбор собственно магниточувствительного компонента матрицы. Удовлетворите.тьные результаты получаются при использовании в качестве магнитомягкого ферромагнетика гамма-оксида железа (у-Ре,0}), магнетита (окись-закись железа РеО Ре.О.), а также восстановленного альфа-железа, получаемого плазмохимическим испарением.
Основными условиями выполнения следующих 3 требований являются выбор полимерного компонента матрицы и способ инкорпорации в него ферромагнетика. В качестве материалов могут рассматриваться органические синтетические (полистирол, полиуретан)
или природные (декстран. хитозан, пектин) полимеры, неорганические (силикагели, кремнеземы, силикаты) пространственные псевдойолимеры. Важное значение имеет технология формирования микро- и наногранул из магниточувствителыюго композита. Дтя большинства использованных нами материалов оптимальным оказался метод эмульсионной или суспензионной полимеризации в водной фазе.
Наконец, последнее требование наиболее специфично и определяется материалом микромапштной матрицы, типом используемого биоактивного лиганда и способом его иммобилизации на поверхности.
Требования, которым должен отвечать биомагнит-ный препарат для выполнения конкретной медико-био-логической задачи, дополняются специфическими требованиями к свойствам материала и технологии производства. Такими характеристиками являются: средневзвешенный размер частнц, степень развитости их поверхности, тип и способ иммобилизации лиганда, плотность его «посадки» и относительная ориентация макромолекул на поверхности частнц. способность частиц или лигандов к контролируемой деградации, и некоторые другие
Уже сегодня для научно-исследовательских, диагностических и лсчебно-профнлактических целен биомагнитные препараты могут использоваться в следующих областях:
специфическая ПЦР-диат ^'тнка опухолевого процесса, в том числе протоонкогенных и онкогенных вирусов; поиск генных мутаций, определяющих к/ил и сопровождающих развитие опухолей, диагностика хромосомных абберраций. возникающих в процессе прогрессии опухоли: диагностика гематогенных микрометастазов опухолей (в частности меланомы) [2:11]: негативная и позитивная нммуномапштная сепарация клеток, в том числе выделение стволовых гемо-поэтическнх клеток для последующей аутотранстан-ташш с целью восстановления гемоаотза после массированной химно- и лучевой терапии опу холей [10; 12]; выделение целевых клеточных популяций для экспериментальных исследований [". 8. 15}.
исследования рецепторно-лигандных взаимодействий на поверхности опухолевых и нормальных клеток. приводящих к инду кции и передаче сиг налов клеточного роста, дифференцнровки. остановки пролиферации и программированной клеточной : ибели [1].
П ЦР-лит носI и ка
За последнее десятилетне аналитический метод полимеразной цепной реакции < ПЦР-аналт) получил повсеместное распространение как чре¡вычанно чувствительный, специфичный и относительно нетрудоемкий способ выявления и анализа специфических поли-
н> клеотидпых последовательностей, точечных мутации. хромосомных аберраций, экспрессии отдельных ; снов. Наиболее трудоемкой и критичной с точки зрения получения артефактных результатов в ПЦР-ана-'и «г является процедура подготовки биологических оразиов к полимеразной реакции — выделение дел* ро геинизированных препаратов нативных нуклеиио--*ь;х кислот. На практике используются различные варианты пробоподготовки: фенольная депротеиииза-иия. ферментный протеолиз, солевая депротеинизация и лр. Все эти методы достаточно трудо- и матсриало-cvkh и практически не поддаются автоматизации, по-. кольку сочетают последовательные экстракции с техникой вихревого встряхивания и центрифугирования.
Бмомагнитные сорбенты формируют новую, менее громоздкую и более эффективную, чем прежде, техно-ъ : ию работы с биоматериалами [3:5]. По сравнению . традиционными способами выделения специфических биомолекул они:
а) избавляют от необходимости использовать до-рогу ю. сложную и тру доемкую технику седиментации, гздеияя ее магнитным осаждением;
б) сокращают время подготовки образцов и повышают выход биомолекул [14; 18];
в) дают возможность сконцентрировать бноматериал *! счхтьших объемов сильно разбавленных растворов [3; 5];
г) позволяют провести последовательные ферментативные реакции в одной пробирке [3].
Данная технология находит различное применение в зависимости от типа биомагнитных сорбентов:
а) сорбенты, специфичные к поверхпостным мар-■ерам. применяются для избирательной сорбции целевых клеточныхсубпопуляннй (В- и Т-лимфоциты. Т-влетки CD4* и CD8‘, моноциты, NK и др.) и субкле-г чных компонентов;
б) сорбенты, содержащие стрептавидин, связывает биотинилированные молекулы: одно- и двунитевые ДНК. РНК. сахара и лектины [3; 13]:
в) специфические поли- и олигонуклеотиды применяются для анализа ДНК-белковых взаимодействий и выделения регуляторных белков [3];
г) последовательности олиго-(ёТ) специфически связывают мРНК и применяются дтя создания библиотек к ДНК.
Перспективной матрицей для производства ПЦР-бномагни тных сорбентов являются магнитные материалы на основе силикатов, получаемые обработкой коллоидной суспензш! магнетита или альфа-железа кремшш-органическими соединениями (силиконами, енланами). Взаимодействие кремнийорганических соединений с ак-ватированными ферромагнитными доменами магнетита осуществляется через молекулы «связанной» воды.
Результатом реакции полимеризации сштанов является трехмерный псевдополимер, обладакяшш тетраэдрической структурой, с развитой поверхностью, несущей многочисленные гидрокси-груипы. Подобно силикагелям, такая матрица гидрофильна, обладает значительной удельпой поверхностью, большими объемами внутренних пор, химически инертна, устойчива к механическим нагрузкам, т.е. отвечает большинству требований, предъявляемым к матрицам микромагнитных носителей.
Структура и физико-химические свойства поверхности ферросиликатных частиц подобна кремнеземам, в связи с чем полученный материал обладает выраженной способностью количественно сорбировать нуклеиновые кислоты из водных растворов высокой ионной силы, в частности, из раствора гуанидина тиоциа-ната, т.е. в условиях стандартной обработки образцов для последующего ПЦР-анализа ДНК и РНК.
По описанной технологии нами синтезированы несколько партий сорбент ов с различным содержанием магнетита и разным фракционным составом. Условное обозначение сорбентов такого рода—Ферросилы.
С целью испытания пригодности Ферросилов для подготовки образцов перед ПЦР-анализом ДНК и РНК. нами проведено его сравнительное изучение с
Г» 1 ).юсI р<»форсшчеекое разделение продуктов амплификации ДНК виру са гепатита В, изолированною из сы-•-«* I: к»! больншо с применением:
А - ♦ерроо1ла-1; В - Ферросила-4; С - магнитных сорбентов производства Мсгск; О - магнитных сорбентов фирмы ЬаЬьу^еп«. вь> ех »арнантах - последовательные десятикратные разведения исходной плазмы крови слева направо. Верхняя стрелка — —14 ~с внутреннего конгрольного образца (770 п.п.); нижняя стрелка — положение ампликона вируса гепатита В (470 п.н.)
34
ЭКСПЕРИМЕН ТАЛЬНАЯ БИО ТЕР А ПИЯ
подобными коммерческими продуктами ряда зарубежных фирм (Merck. Labsvstems. Micromod. CPG) в системе автоматизированной пробоподготовки KingFisher (Termo Labsystems). Биологическим материалом служила плазма крови больного вирусным гепатитом В с высоким содержанием вируса. ПЦР-ана-лиз проводили с использованием набора реагентов «АмплиСеис HBV-470s/BKO-770» (ЦНИИЭ М3 РФ. Россия). Для оценки сорбционной емкости сорбента в отношении вирусной ДНК применяли десятикратное разведение исходной плазмы с помошыо плазмы, не содержащей ДНК вируса гепатита В. Выделенную ДНК амплифицировали. используя специфические олнгонуклеотидныепраймеры (размер ампликона 470 пар оснований). Продукты амплификации анализировали методом электрофореза в агарозном геле. Результаты ПДР-анализа представлены на рис. 1.
Использование сорбентов cepini Ферросил не ингибирует ПЦР: по специфической емкости в отношении вирусной ДНК сорбенты Ферросил не уступают лучшим зарубежным аналогам (Merck. Micromod), превосходя по этому показателю продукцию других фирм [5].
Технологическая простота получения Ферросилов. доступность и невысокая стоимость компонентов синтеза, воспроизводимость их физико-химических характеристик. удобство хранения и применения делают серийное производство таких мнкромагнитных сорбентов достаточно привлекательным, а при расширении спроса на них после налаживания промышленного производства соответствующего оборудования для автоматизированной пробоподготовки к ПЦР-аиали-зу — весьма рентабельным.
Обилие гидроксильных групп на развитой поверхности Ферросилов дает возможность ее простой химической модификации с целью иммобилизации на ней специализированных биоактивных лигандов, в результате чего могут быть получены аффинные сорбенты.
Мы использовали метод химической активации поверхности Ферросила тетрахлоридом титана. В результате спонтанного гидролиза этого соединения образуется высоко реакционные оксиды титана (конечный продукт—химически инертный диоксид титана), «достраивающие» пространственную сетку типа -Si-O-Si- пространственной структурой -Ti-0-Ti-.
Являясь переходным металлом, четырехвалентные атомы диоксида титана, встроенные в тетраэдрическую структуру псевдополимера, сохраняют способность к акватации и формированию еше двух (на каждый атом Ti) координационных связей с карбоксильными. гидроксильными, сульфгидрильными и первичными аминогруппами биомакромолекул.
Точная природа этих связей до сих пор не выяснена (их называют хелатоподобными), однако первичное взаимодействие активированной поверхности сорбента с белками необратимо в физиологических условиях. При этом иммобилизация белков на поверхности сорбента посредством таких связей не приводит к драматическим изменениям их конформации и утрате ими специфической активности.
Так. иммобилизованный стрептавидин сохраняет способность образовывать аффинные комплексы с биотинилированными лигандами. Это видно па при-
мере связывания таким сорбентом биотинилированной пероксидазы. выявляемой по специфической цветной реакции с хромогенным субстратом. Очевидно, что полученный по описанной технологии аффинный сорбент является универсальным полупродуктом для конструирования различных биомагнитных сорбепов. В частности, иммобилизация на поверхности микрочастиц биотнннлированных олигонуклеотидов позволяет получать сорбенты, пригодные для гибридизации с нуклеиновыми кислотами и специфического распознавания определенных нуклеотидных последовательностей. а «нагрузка» биотинилированных антител заданной специфичности Дает целую серию иммуномаг-нитиых препаратов дня позитивной и негативной селекции антигенов.
Иммуномагннтиая сепарация
Проблеме иммуномагнитной селекции кроветворных клеток костного мозга за последнее десятилетие уделялось достаточно много внимания, в настоящее время налажено серийное производство автоматизированных установок марки 1SOLEX и CLINIM ACS фирм Baxter и Macs соответственно (обе — СШ А) для клинического использования данного метода, который уже давно получил практическое признание. В России также ведутся работы по созданию собственного нммуно-мапштного сепаратора клеток крови и костного мозга марки МСК-1 (головной разработчик — ЦННИТОЧ-МАШ), защищенного Патентом РФ. экспериментальный образец которого получил Золотую медаль Международного Салона Изобретении «Эврика-95» (Брюссель. ЕС). В этой связи проблема выделения, очистки, криоконсервации и аутотрансплантации стволовых кроветворных клеток представляет не столько научную, сколько технологическую задачу [4; 9: 16: 17].
Однако развитие биомагнитной. в том числе им-муномагнитной сепарации ставит новые задачи и открывает новые горизонты вчера еще неразрешимых проблем. Так. в ноябре 2002 г. в Москве на базе Института биохимической физики им. Н.М.Эмануэля PAI1 состоялся Первый Симпозиум «Применение биомагнитных носителей в медицине». Среди прочих работ в разряде наиболее перспективных был представлен метод ненивазивной пренатальной молекулярной диагностики плода [3].
Известно, что некоторые типы эмбриональных клеток плода проходят через плацентарный барьер и циркулируют в периферической крови матери: лейкоциты, эритроциты, трофобласты. В зависимости от сроков беременности, содержание эмбриональных клеток составляет от 20 до 2000 клеток на 100 мл венозной крови. Столь незначительное содержание эмбриональных форменных элементов делает невозможным использование крови матери для прямого молекулярно-генетического анализа плода и требует предварительного обогащения биоматериала. Использование флуоресцентно активируемых лазерных сортировщиков ( fluorescence activated cell sorting — FACS) достаточно дорого и недоступно широкому кругу медицинских учреждений, в то время как иммуномагнитное обогащение образца позволяет. используя простейшее оборудование (магнитный штатив) и минимум расходного материала (имму-
Н9 Л J RFC АТ .1 и/А. 4
♦ ♦♦ - ■«» ♦
C'asp-S тм ¡. - 47ЬС
- 32К
- 2 5 KL
FADD - 25К
Fas М W -47К
- 3 2 К.
Рис. 2. Иммуноблоттииг компонентов комплекса DISC, изолированных из лизатов клеток линий Н-9, Jurkat и Jurkat/ Л4 aHTH-Fas-iiMMjHOManiHTHbiMn микрочастииами:
справа - маркеры молекулярной массы (кДа).
немагнитный сорбент), решить задачу выделения эмбриональных клеток практически в любой лаборатории.
Наиболее удобным дтя выделения и последующего анализа объектом оказались фетальные ядерные эритроциты, поскольку по своим антигенным маркерам они в большей мере, чем другие эмбриональные клетки, циркулирующие в крови беременной женщины, отличаются от тканей взрослого человека. Характерный и наиболее удобный клеточный маркер ядерных эритроцитов — трансмембранный белок Гликофорин А.
Для выделения эритроцитов эмбриона используют стрептавидип-содержащие микромагнитные частицы. несущие на своей поверхности моноклональные антитела к Гликофорнну А. Применение такого сорбента делает возможным в течение 1-1,5 ч не только изолировать фетальные клетки из крови матери, но и произвести депротеинизашпо содержащейся в них ДНК, т.е. осуществить процедуру пробоподготовки для ПЦР-анализа.
Видимо, по мере расширения арсенала биомаппгг-ных препаратов будут расширяться практические возможности их использования.
Экспериментальные исследования
Бномагнитиые препараты занимают свое достойное место в практике лабораторных исследований, создавая новые инструменты для биологических экспериментов.
Используя технологию активации Ферросила тетрахлоридом титана с иммобилизацией на его поверхности моноклональных антител к Ра.ч-рецептору Т-лимфоцитов человека, нам удалось получить имму-номагнитный препарат, не только сохранивший специфичность иммобилизованных антител в отношении антигена, но и изменивший биологическую активность этих антител [1]. Исходные нативные антитела. являясь бивалентным мономером (класс 1§С2а), способны связаться одновременно не более, чем с двумя антигенными эпитопами, чего в случае Иах-рецептора достаточно для его визуализации, но совершенно недостаточно для активации специфичес-
кого сигнала программированной клеточной гибели: минимальным событием дтя возбуждения сигнала апоптоза является тримеризаиия Fas-рецептора. Использование Fas-специфичного нммуномагнитного препарата при инкубации с Fas-позитивными клетками линий Jurkat и Н-9 вызывает необходимую олигомеризацию рецептора с последующим образова1шем сигнального комплекса DISC, индуцирующего каскад каспаз — ферментов, запускающих механизм апоптоза. Доказательство формирования комплекса DISC — его извлечение нз клеточного лизата с помощью магнитного стержня с последующим анализом его компонентов (рецептора Fas, адаптора FADD и прокаспазы-8) методом электрофореза и иммуноблот-тинга (рис. 2). Таким образом, моноклональные антитела. иммобилизованные на поверхности микроносителя. не только сохраняют специфическую активность, по и создают архитектурный ансамбль, стери-чески корректный для олигомеризации антигена.
Поскольку Fas-реиептор — лишь один из представителей обширного суперсемейства TN F-подобных рецепторов, каждый из которых для проявления активности требует олигомеризашш, описанная технология по-лучения биологически активного нммуномагнитного препарата может стать удобным инструментом для изучения клеточных сигналов пролиферации, днфферен-пировки, апоптоза и других регуляторных стимулов.
Таким образом, создание широкого спектра био-магннтных препаратов способствует осуществлению технологического прорыва в биомедицинских областях, особенно связанных с нанобиотехнологиями.
ЛИТЕРАТУРА
1. Блохин Д. Ю.. Иванов ПК.. Соколовская A.A. идр. Имму-номагнитлыс анти-FAS микрочастицы для активации и выделения апоптоз-илдуцируюшего сигнального комплекса DISC // Применение бномагнитных носителей в медицине. Материалы симпозиума. — Москва: ИБХФ РАН. 2002. — С 82-6.
2. Головин К В , Голенкина Е.А.. Полосухина Е Р. идр. Использование иммуномагнитиой сепарации меланомных клеток из крови для проведения ПЦР-лиагностики мик-
рометастазов меланомы и последующего шгтоморфо-логического подтверждения метастазировапия // Генодиагностика в современной медицине Сборник тезисов докладов 3-й Всероссийской научно-практической конференции. — Москва, 2000. — С. 161.
3. Жигулин А О. Использование магнитных частиц покрытых стрептавиднном для повышения чувствительности и специфичности методов исследования: нммуномагнит-ное выделение клеток и выделение мРНК // Применение биомагшггных носителей в медицине. Материалы симпозиума. — Москва: ИБХФ РАН. 2002. — С. 76-82.
4 Печное П. К Моноклональные антитела в онкологии II Автореф. Днсс. докт. мед. наук. — Москва. 2001.
5. Филиппов В. //., Иванов ПК., Блохин Д. Ю. и др. Ферросн-ликатные магнитные порошки для выделения и очистки нуклеиновых кислот II Сб. трудов 10-й Международной Плесской конференции по магнитным жидкостям. Сентябрь 2002, Плес. Россия. — С.305-7.
6. Филиппов В.И., Кузнецов А.А., Гончаров.!.А. и др. Микросферы для биомедицинского применения. Области применения и способы получения II Применение бномаг-нитных носителей в медицине. Материалы симпозиума. — Москва: ИБХФ РАН. 2001. — С. 15-20.
7. Anderson G., Owen J J.T.. Moor N.C.. Jenkinson E.J. Characteristics of an in vitro system of thymocyte positive selection II i Immunol. — 1994. — Vol. 153. — P. 1915.
8. Вrugger It',, Mock!in W., Heimfeld S. et at. Ex vivo expansion of enriched peripheral blood CD34+ progenitor cells by stem cell factor, interleukin-1 beta (IL-1 beta). IL-6. IL-3, interferon-gamma and ervthropoietin // Blood. — 1993.— Vol. 81, —P. 2579.
9. Brugger W„ Henschler R.. Heimfeld S. el al. Positively selected autologous blood CD34+ cells and unseperated peripheral blood progenitor cells mediate identical hematopoietic engraftment after high-dose VP16, ifosfamide, carboplatin, epirubicin//Blood.— 1994.—Vol. 84. — P. 1421-6.
10.Ilandgretinger R.. GreilJ., Schumann U. et al. Positive selection and transplantation of CD34+ progenitor
cells: feasibility and purging efficacy in pcdiatric patients with neuroblastoma II J. Hematother. — 1997. — Vol. 6(3), P. 235-242.
11. MaasR.A.. Bruiting P.F, Breedijk A.P etal. Immunomagnelic purification of human breast carcinoma cells allows tumor-specific detection of multidrug resistance gene 1 mRNA by reverse transcriptase polymerase chain reaction in fine-needle aspirates II Lab. Invest. — 1995. — Vol. 72. — P. 760.
12. Ogura M. Kagami Y. Suzuki R etal. Phase I/II trial of cure-oriented high-dose chemoradiotherapy with transplantation of CD34+ peripheral blood cells purified by the immunomagnetic bead method for refractory hematological malignancies // Cancer Chemother. Pharmacol. — 1997. — Vol. 40. — Suppl. — P. 51-7.
13. Olsvik O . Popovic T.. Skjerve E. etal. Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology // Clin. Microbiol. Rev. — 1994.— Vol. 7(1). P. 43.
14. Porter J. Robinson J.. Pickup R. EdvardsC. An evaluation of lectin-mediated magnetic bead cell sorting for the targeted separation of enteric bacteria// J. Appl. Microbiol. — 1998.
— 84(5).— P. 722.
15. Schmitz B . Radbruch A.. Kummel T. etal. Magnetic activated cell sorting (MACS) — a new immunomagnelic method for mcgakaryocytic cell isolation: comparison of different separation techniques II Eur. J. Haematol. — 1994. — Vol. 52(5). — P. 267-275.
16. Servida F.. Soligo D . Caneva L. et al. Functional and morphological characterization of immunomagnetically selected CD34+ hematopoietic progenitor cells // Stem Cells.
— 1996. — Vol. 14. №4. — P. 430-8.
17 Servida F.. Soligo D , Caneva L. et al. Functional and morphological characterization of immunomagnetically selected CD34+ hematopoietic progenitor cells II Stem Cells
— 1996. — Vol. 14. № 4. — P 430-8
18. Wright D J.. Chapman P A , SiddonsC. A. Immunomagnetic separation as a sensitive method for isolation Escherichia coli 0157 from food samples II Epidemiol. Infect. — 1994.
— Vol. 113(1). —P. 31
