CC BY
60
1 1
26 БИОТЕРАПИЯ
к УДК 57.083.3:616-006-085.277.3 P. K. Ivanov, A. S. Grinevich, A. A. Molodyk, E. F. Chmutin, O. N. Donskaya, N. V. Golubtsova, I. V. Chinareva, Yu. M. Larin, M. N. Kraeva, E. N. Zakharova NEW PRODUCTS OF LABORATORY OF MEDICAL BIOTECHNOLOGY OF THE RESEARCH INSTITUTE OF EXPERIMENTAL DIAGNOSTICS AND THERAPY OF TUMORS OF RUSSIAN CANCER RESEARCH CENTER N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow ABSTRACT Laboratory of Medical Biotechnology of the Research Institute of Experimental Cancer Diagnostics and Therapy of Blokhin Russian Cancer Research Center is engaged in development of scientifically complicated technologies aimed at production of targeted therapeutic and diagnostic agents, which can be applied in oncology and other fields. Besides, the laboratory develops new methods and ways of use of such agents. The laboratory maintains dozens of hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies (Mabs) to various human antigens, and develops methods of Mabs purification for diagnostic and therapeutic purposes. A panel of 36 Mabs (“Clonospectr”) used for immunofluorescence visualization of differentiation antigens of human lymphocytes has been approved for diagnostic use by Committee for New Medical Devices of the Russian Ministry of Health, and registered as a medicinal product at the Ministry of Health and Social Development. Mabs ICO-25 against a mucin-like antigen of human milk fat globules were used to develop a therapeutic agent Imuteran proposed for treatment of epithelial cell-originating cancers (breast cancer, intestinal cancer, ovarian cancer, lung cancer etc.). Ilnd phase clinical study of this agent is close to end now, and preliminary results suggest that Imuteran is a promising anticancer agent with tumor-stabilizing activity, but patients should be carefully monitored for signs of allergic reactions. Mabs IC0-90 against CD3-antigen of human T-lymphocytes were used to develop a therapeutic agent Atemonat proposed for treatment of acute transplant rejection reaction. At present IInd phase clinical study of this agent is over, and the results confirm the drug safety and efficacy for this indication. The drug is being registered at the Ministry of Health and Social Development, and transfer to serial production is expected shortly. Besides, the laboratory carries out systemic research aimed at development of immunomagnetic matrixes for biological and medical applications based on Mabs conjugated to different magnetic carriers. The following matrixes have been developed and undergo preclinical studies: FerroSil based on magnetite-containing silicon dioxide polymers, FerroPol based on magnetite-containing polystyrene polymers and FerroDex based on magnetite-containing dextran polymers. This work will be continued with the aim to use these products for separation and purification of bone marrow cell fractions in cancer patients undergoing bone marrow cell autotransplantation. Key words: targeted therapy, monoclonal antibodies, immunomagnetic matrix, oncology, transplantology. П. К. Иванов, А. С. Гриневич, А. А. Молодык, E. Ф. Чмутин, О. H. Донская, H. В. Голубцова, И. В. Чинарева, Ю. М. Ларин, М. Н. Краева, E. Н. Захарова НОВЫЕ РАЗРАБОТКИ ЛАБОРАТОРИИ МЕДИЦИНСКОЙ БИОТЕХНОЛОГИИНИИ ЭДиТО РОНЦ ИМ. Н. Н. БЛОХИНА РАМН ГУ РОНЦ им. НН Блохина РАМН, Москва РЕЗЮМЕ В лаборатории медицинской биотехнологии НИИ ЭДиТО РОНЦ РАМН разрабатываются наукоемкие технологии получения средств направленной терапии и диагностики онкологических и других заболеваний, а также новые методы применения таких средств в терапевтических и диагностических целях. В лаборатории поддерживаются десятки линий клеток-продуцентов моноклональных антител МКА к антигенам человека и осуществля- Ч
№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 1
1
БИОТЕРАПИЯ 27
>- ется выделение и очистка МКА, позволяющая использовать их в диагностических и терапевтических целях. Панель из 36 МКА, предназначенная для определения дифференцировочных антигенов лейкоцитов человека методом иммунофлюоресценции (набор “Клоноспектр”), рекомендована для диагностического применения Комитетом по новой медицинской технике М3 РФ и зарегистрирована как изделие медицинского назначения в М3 РФ. На основе МКА 1СО-25 к муциноподобному антигену мембран жировых глобул женского молока создан препарат Имутеран, предназначенный для лечения опухолей эпителиального генеза. В настоящее время завершается II фаза клинических испытаний, и можно сделать предварительный вывод, что Имутеран - перспективное противоопухолевое средство, оказывающее стабилизирующее действие на опухолевый процесс, но необходимо тщательное наблюдение за больными для купирования аллергических реакций. На основе антител 1СО-90 к СО3- антигену Т-лимфоцитов создан препарат Атэмонат, предназначенный для лечения реакции отторжения трансплантата. В настоящее время завершена II фаза клинических испытаний, которая показала эффективность и безопасность применения препарата по этому показанию. Препарат проходит регистрацию в МЗиСР РФ, и в ближайшее время ожидается переход на его серийный выпуск. Кроме того, в лаборатории ведется систематическая работа по созданию магнитоуправляемых сорбентов для биологического и медицинского применения на основе МКА, сорбированных на различных носителях. Созданы и проходят предклинические исследования сорбенты из магнетита и композитов на основе диоксида кремния (ФерроСил), из магнетита с оболочкой на основе полистирола и его сополимеров (ФеррПол), из магнетита и декстрана (ФерроДекс). Эта работа будет продолжена для продвижения этих сорбентов в клинику с целью выделения и очистки различных фракций клеток костного мозга у онкологических больных, подвергающихся аутотрансплантации клеток костного мозга. Ключевые слова: направленная терапия, моноклональные антитела, иммуномагнитные сорбенты, онкология, трансплантология. ВВЕДЕНИЕ поддерживаются десятки линий клеток-продуцентов С момента своего создания в 2002 г. лаборатория МКА и осуществляется выделение и очистка МКА, медицинской биотехнологии НИИ ЭДиТО РОНЦ позволяющая использовать их в диагностических ите-РАМН стала базой для разработки и практического рапевтических ц&их. Шнель из 36 МКА предназта-применения наукоемких технологий получения био- чеННая дЛя °предеЛШия диффереНциров°чНЫх аНтиге-препаратов - новых средств терапии и диагностики нов лейкоцитов чедовека методом иммунофлюорес-онкологических и других заболеваний на основе при- ценции (набор ‘^лот^текф’’^ ртюмшдотавд для родных биологически активных веществ. В лаборато- диагностического применшия Комитетом по нотот рии также разрабатываются новые методы и способы медицинской технике М3 РФ и зарегистрирована как применения биопрепаратов в терапевтических и диа- издеёие медицинского назнэтедия в М3 РФ. гностических целях. Работа ведется по следующим ос- ^а основе 2 МКА из этот панеди созданы и прохо-новньш направлениям: дят клинические испытания и регистрацию в М3 РФ 1. Разработка, производство и клинические ис- терапевтические препараты Имутеран и Атэмонат. пытания диагностических и терапевтических средств на основе моноклональных антител (МКА) к антиге- Имутеран нам чеёовека. Имутеран представляет собой лекарственную фор- 2. Создание и испытания иммуномагнитных му МКА ГСО-25 к муциноподобному антигену мем-сорбентов для селекции клеток. бран жировых глобул женского молока. Этот антиген, выделенный под руководством проф. Р. И. Якубовской МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА в Московском научно-исследовательском онкологичес-МКА - это высокоспецифичные антитела к опре- ком таституте им. П. А. Герцена М3 РФ (МНИ°И), деленному антигену, которые синтезируются специ- представёяет собой ГЛикопротеиН с моЛекуЛярНым ве-ально создаваемыми линиями клеток-продуцентов. сом боёее 250 кДа, который выявляется в аджадиых: Существуют разные технологии получения таких кле- мембранах этш^татсиых: кдеток нормальных ацину-ток; классической считается гибридомная, включаю- сов и протоков, а также доброкачественно измененного щая формирование гибридных клеток миеломы мыши, и малигнизированного жедезистого эпителия молот-слитых с клетками селезенки мышей, иммунизирован- ной жеёезы. Малигнюация сопровождается появлши-ных данным антигеном. ем значительного количества недогликозилированного НИИ ЭДиТО РОНЦ РАМН - одно из немногих на- антигена в цитоплазме клеток. Ряд данных свидетель-учных учреждений России, где под руководством ствуют о том, что примеНеНие МКА к муциНопоДОб-проф. А. Ю. Барышникова успешно внедрена и ис- ным антигенам может усиливать иммунные реакции пользуется гибридомная технология получения против опухоЛевых кЛеток, Несущих эти антигены, иёи МКА. По этой технологии в НИИ ЭДиТО к настояще- способствовать их развитию [2]. му времени получены МКА к различным антигенам Предкдинические иссдедования, проведенные человека. В лаборатории медицинской биотехнологии в МНИОИ показади возможность исподьзования этих ч
№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1
1 1
28 БИОТЕРАПИЯ
к МКА для торможения роста опухолей эпителиального внутримышечно, димедрол 1 %-ный - 1,0 мл внутри-генеза (рак яичника, толстой кишки, легкого, молоч- мышечно. На проведение II фазы испытаний получено ной железы и т.д.). В частности, внутривенное введе- разрешение М3 РФ. ние Имутерана мышам nude с гетеротрансплантатом В 2003 г. в 3 клиниках (РОНЦ РАМН, МНИОИ рака толстой кишки человека вызывало торможение и Институт Онкологии им. Н. Н. Петрова) была начата роста опухоли. При этом препарат не оказывал токси- II фаза клинических испытаний Имутерана для оценки ческого действия при остром и субхроническом введе- эффективности и безопасности применения препарата нии мышам и крысам в дозах, в 10 раз превышающих больным опухолями эпителиального генеза различной терапевтические дозы для человека. Основываясь на локализации (главным образом, раком молочной желе-этих данных, было принято решение о проведении зы). Согласно протоколу лечение препаратом должны клинических испытаний препарата [3]. получить 100 больных. К настоящему времени в ис-С этой целью в лаборатории медицинской биотех- следование включены 67 больных опухолями различ-нологии был оптимизирован способ выделения ной локализации (рак молочной железы, яичника, лег-и очистки МКА IC0-25 из асцитической жидкости мы- кого, толстой кишки и др.), у которых исчерпаны воз-шей, всесторонне изучены физико-химические и им- можности химио- и лучевой терапии. мунологические характеристики полученных антител, Лечебный эффект оценен у 50 больных. Из них разработана лекарственная форма на основе субстан- в 21 случае (42 %) достигнута стабилизация опухоле-ции МКА IC0-25 (препарат Имутеран). Совместно вого процесса длительностью от 3 до 9 мес, а в 1 слу-с сотрудниками МНИОИ была разработана необходи- чае при комбинированном применении Имутерана мая документация для получения разрешения М3 РФ и химиотерапии у больного раком толстой кишки дона проведение клинических испытаний, и такое разре- стигнут частичный регресс опухоли. В остальных слу-шение было получено. Работа по данной теме поддер- чаях наблюдалось прогрессирование заболевания. живается грантом Правительства г. Москвы в рамках Основной вид токсичности - связанные с приме-Научно-технической программы “Разработка и вне- нением Имутерана аллергические реакции, которые дрение в медицинскую практику новых методов отмечены у 6 из 67 больных (9 %). В 2 случаях аллер-и средств диагностики и лечения онкологических гические реакции 2-3-й степени потребовали прекра-и других заболеваний”, утвержденной Мэром г. Моск- щения лечения (анафилактический шок и бронхоспазм вы Ю. М. Лужковым, Министром Промышленности, с отеком Квинке); еще в 1 случае лечение было прекра-науки и технологий РФ А. Н. Дондуковым и Президен- щено из-за развития пареза кишечника. Остальные потом РАН Ю. С. Осиповым. бочные явления были 1-й степени тяжести (лихорадка, В 2001-2002 гг. в РОНЦ РАМН была проведена I болевой синдром, кожные реакции, артралгия, озноб, фаза клинических испытаний препарата Имутеран для повышение уровня креатинина) и проходили либо са-определения максимально переносимой дозы и дозо- мостоятельно, либо при использовании симптоматиче-лимитирующей токсичности Имутерана у больных ской терапии [10]. опухолями эпителиального генеза различной локали- В целом можно сделать предварительный вывод, зации. Препарат вводили внутривенно капельно со что Имутеран - перспективное противоопухолевое скоростью 5 мл/мин 4 раза с интервалом в 1 нед и про- средство, оказывающее стабилизирующее действие на водили эскалацию дозы Имутерана по модифициро- опухолевый процесс, но необходимо тщательное на-ванному методу Фибоначчи, начиная со стартовой до- блюдение за больными для купирования аллергичес-зы 5 мг. ких реакций. Окончательные выводы об эффективнос-По результатам лечения 6 больных установлено, ти препарата можно будет сделать только после завер-что Имутеран существенно не влияет на результаты шения исследования, которое планируется в конце клинического (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, 2006 г. гемоглобин) и биохимического анализа крови (общий РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН совместно белок, креатинин, билирубин, глюкоза, трансаминаза) с МНИОИ им. П. А. Герцена М3 РФ получен патент и анализа показателей свертываемости (протромбино- РФ на МКА IC0-25 как на противоопухолевое сред-вое время, фибриноген, РКМФ, этаноловый тест, толе- ство. Ни в России, ни за рубежом аналогов препарата рантность плазмы к гепарину). Основными побочны- Имутеран не существует. ми эффектами препарата были реакции гиперчувствительности (озноб, крапивница, отек Квинке, коллапс). Атэмонат При введении Имутерана в дозе 46,25 мг у 2 больных Вторым терапевтическим препаратом на основе развились реакции, потребовавшие прекращения лече- МКА стал Атэмонат на основе антител IC0-90 к CD3-ния [9]. антигену Т-лимфоцитов. CD3-антиген селективно экс-На основании результатов I фазы клинических ис- прессируется на поверхности зрелых Т- лимфоцитов следований была определена доза и режим введения и тимоцитов, и связывание антител с ним запускает Имутерана для II фазы испытаний: 35 мг при внутри- ряд процессов, которые в конечном итоге приводят венном капельном введении 4 раза с интервалом к гибели Т-клеток путем апоптоза и резкому угнете-в 1 нед. Отработана профилактическая премедикация нию клеточного иммунитета. Это свойство препарата реакций гиперчувствительности: дексаметазон 20 мг может быть использовано для лечения состояний, свя- Ч
№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 1
занных с активацией клеточного иммунитета, в част- Для снижения выраженности побочных эффектов,
ности, реакции острого отторжения трансплантата (РООТ) [7].
Предклинические исследования Атэмоната подтвердили, что он связывается со зрелыми Т-лимфоци-тами и тимоцитами и не связывается с другими типами клеток крови и культурами этих клеток. В результате связывания антител !С0-90 с СО3-рецептором происходит интернализация комплекса антиген-антитело внутрь клетки с дальнейшей активацией Т-лим-фоцитов. При этом анализ насыщения связывания показал, что Атэмонат имеет несколько меньшее сродство к С03-антигенам, чем другие антитела к антигену СЭ3: например, препарат ОКТ-3 производства компании Орто Фармасьютикал (США). Из литературы известно, что МКА, имеющие средний уровень аффинности к СЭ3-антигену, могут легче диссоциировать и повторно связываться с рецептором, что усиливает их способность вызывать активацию и последующую гибель Т-лимфоцитов. Это теоретически могло обеспечивать более высокий клинический эффект Атэмоната по сравнению с ОКТ-3, который давно и успешно применяется для лечения РООТ. Эти данные в сочетании с благоприятными результатами предклинических фармакологических и токсикологических исследований послужили основой для начала клинических испытаний Атэмоната.
Клиническое исследование являлось открытым исследованием в рамках объединенной 1-й и 2-й фаз клинических испытаний и имело целью изучение эффективности и безопасности применения Атэмоната для лечения РООТ после пересадки почки. Однако мы полагаем, что способность Атэмоната подавлять Т-клеточный иммунитет может иметь значение и для онкологических больных, нуждающихся в заместительной пересадке органов и тканей.
Для участия в исследовании было отобрано 20 больных, получавших лечение в Московском городском центре пересадки почки при 7-й городской клинической больнице г. Москвы (руководитель - проф. П. Я. Филипцев) и в отделении пересадки почки НИИ урологии М3 РФ (заведущий - д.м.н. Д. В. Перлин). Все больные имели диагноз РООТ или отсроченное восстановление функции трансплантата, позволяющее предположить наличие отторжения.
Больные получали Атэмонат в дозе 5 мг в/в 1 раз в день в течение 7-10 дней, в зависимости от клинического эффекта. Такая схема лечения является стандартной для всех существующих аналогичных препаратов - ОКТ3, кубинского препарата ЮЯТ3 и других. Во время применения Атэмоната больные продолжали получать стандартную иммуносупрессивную терапию микофенолятом-мофетилом, циклоспорином А, ме-тилпреднизолоном, при этом дозы базовых иммуносупрессоров снижались по усмотрению лечащего врача на основании оценки функций почек и клинического состояния больного. Больные также продолжали получать текущее лечение имеющихся у них сопутствующих заболеваний.
связанных с синдромом выброса цитокинов, и для снижения риска развития реакций гиперчувствительности за 1 час до первой инъекции Атэмоната внутривенно вводили метилпреднизолон и антигистамино-вые препараты. При последующих инъекциях Атэмоната за 30 мин до инъекции также вводили антигистаминовые препараты.
Поскольку в период проведения исследования существующие коммерческие препараты МКА к СЭ3-антигену в Россию не поставлялись, а применение плацебо при РООТ по этическим соображениям невозможно, в данном исследовании отдельная контрольная группа больных отсутствовала. В рамках исследования в НИИ Урологии был проведен ретроспективный анализ для сравнения эффектов моноклональных антител к антигену СЭ3 и поликлональных анти-Т-лим-фоцитарных антител.
Основным регистрируемым показателем эффективности Атэмоната являлось восстановление экскреторной функции трансплантата, которое оценивали по восстановлению диуреза, нормализации концентрации креатинина и мочевины в плазме крови. Эти показатели определяли ежедневно на протяжении курса терапии и не реже, чем 1 раз в 3 дня до восстановления функции трансплантата.
Кроме того, купирование отторжения оценивали путем ультразвукового исследования (У3И), допплерографии, пункционной биопсии трансплантата и/или ренографии.
Дополнительным показателем эффективности лечения являлось изменение содержания активированных Т-лимфоцитов и других фракций клеток периферической крови.
Безопасность применения Атэмоната оценивали путем регистрации неблагоприятных побочных явлений (НПЯ) до выписки больного из клиники.
Протокол исследования был одобрен независимым этическим комитетом, и на проведение исследования было получено разрешение М3 РФ. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской Декларацией прав человека, и до проведения каких-либо связанных с исследованием процедур от каждого больного было получено письменное информированное согласие.
В соответствии с протоколом исследования для участия в нем были отобраны 20 больных, в том числе 11 мужчин и 9 женщин, средний возраст - 39 лет (диапазон 25-57 лет). В ГКБ № 7 в исследование были включены 12 больных, в НИИ Урологии - 8. Все отобранные для участия в исследовании больные имели РООТ, подтвержденную путем лабораторного обследования, У3И и/или биопсии трансплантата, все имели различные сопутствующие заболевания и получали соответствующую терапию.
2 больных получали 2 курса лечения Атэмонатом:
1 больная имела отторжение трансплантата почки в анамнезе, и сразу после повторной трансплантации ей был проведен курс АТЭМОНАТ с профилактичес-
кой целью вне данного протокола. У больной было достигнуто восстановление функций трансплантата через 25 дней после трансплантации, однако функция трансплантата оставалась нестабильной, и еще через 20 дней у нее было обнаружено отторжение трансплантата, в связи с чем был проведен повторный курс применения Атэмоната с положительным результатом. Другому больному был проведен курс лечения Атэмо-натом в связи с подтвержденной РООТ типа 1а, и через 15 дней достигнут положительный результат, однако через 44 дня была диагностирована повторная РООТ типа 2а, в связи с чем был проведен повторный курс применения Атэмоната, опять с положительным результатом.
В целом у 18 из 20 больных (90 %) применение Атэмоната дало положительный результат по показателям восстановления экскреторной функции трансплантата (диурез, концентрации креатинина и мочевины в сыворотке крови) или нормализации УЗИ-карти-ны трансплантата. В 1 случае после применения Атэмоната УЗИ-признаки отторжения сохранились, и диурез в течение срока наблюдения (40 дней) не восстановился. В последующем у больного отмечались признаки восстановления кровотока в трансплантате по данным допплерографии, однако на 47-й день после начала лечения больной умер от острого инфаркта миокарда. Данный больной имел в анамнезе диализный перитонит и пневмонию, и, по мнению исследователя, смерть его не связана с применением исследуемого препарата. Еще в 1 случае после применения Атэмоната у больного восстановился диурез, однако при этом сохранились УЗИ-признаки РООТ, и вследствие отека трансплантата произошел разрыв капсулы, потребовавший удаления трансплантата. Остальные 18 больных были выписаны в удовлетворительном состоянии с функционирующим трансплантатом.
Как указывалось выше, в НИИ Урологии был проведен ретроспективный анализ для сравнения эффектов моноклональных и поликлональных анти-Т-лимфоци-тарных антител. При этом оценивали долгосрочное сохранение функций трансплантата и выживаемость больных, получавших Атэмонат и другие препараты моноклональных и поликлональных анти-Т-лимфоци-тарных антител для купирования РООТ. Эффекты Атэмоната и других МКА, включая ОКТ3 и ЮЯТЗ, были в целом очень близки, но малое количество больных, получавших разные МКА, не позволяло провести статистическое сравнение. Поэтому больные, получавшие разные МКА, были объединены в одну группу, которую ретроспективно сравнивали с больными, получавшими препараты поликлональных антител, в том числе ан-ти-Т-лимфоцитарный глобулин и антилимфоцитарный глобулин.
В результате показано, что применение моноклональных антител сопровождается низкой частотой рецидива РООТ в течение 1 г. после окончания лечения (8,7 %), высокой краткосрочной и долгосрочной выживаемостью трансплантатов (соответственно 91 % и 87 %) и высокой годичной выживаемостью больных
(91 %). При этом практически по всем изученным показателям МКА достоверно превосходят поликлональные антитела.
У всех 20 больных введение моноклональных антител вызывало быстрое падение содержания Т-лим-фоцитов в крови почти до 0. В последующем, несмотря на продолжение применения препаратов, содержание Т-лимфоцитов постепенно восстанавливалось и нормализовалось через 7-10 дней после начала лечения. Моноклональные антитела по сравнению с поликлональными вызывали более быстрое и глубокое снижение содержания Т-лифоцитов, хотя последующее восстановление содержания этих клеток происходило примерно одинаково (рис. 1).
Рис. 1. Изменение количества активированных Т-лимфоцитов (СЭ3+) при применении моно- и поликлональных антител
При этом параллельно снижалось содержание всех фракцией T-лимфоцитов, в частности, T-хелпе-ров/индукторов, оцениваемых по антигену CD4, и T-супрессоров/цитотоксических лимфоцитов), оцениваемых по антигену CDS. В то же время введение препарата ATЭMOHAT существенно не влияет на количество В-клеток, оцениваемых по антигену CD 19 или CD20; таким образом, Лтэмонат селективно воздействует на популяцию T-клеток, не затрагивая В-лим-фоцитов, обеспечивающих гуморальный иммунитет.
Нами не обнаружено какого-либо стабильного влияния Aтэмонaтa на содержание NK-клеток, оцениваемых по антигену CD 16, что подтверждает селективность иммуносупрессивного эффекта препарата и возможность сохранения неспецифического иммунитета больных. Aнaлогично мы не обнаружили какого-либо стабильного влияния Aтэмонaтa на фракции клеток крови, несущие антиген CD3S (это нелинейный антиген, экспрессированный на значительной части моноцитов), а также антигены CD25 (или рецептор интерлейкина-2), CD71 (или рецептор трансферрина), CD95 (или рецептор апоптотического Fas-лиганда), а также антиген HLA-DR.
Зарегистрированные в ходе исследования неблагоприятные побочные явления заключались в основном в повышении температуры тела, которое связано с развитием синдрома выброса цитокинов, вызванного раз-
н
1 1
БИОТЕРАПИЯ 31
>- рушением Т-лимфоцитов, и должно рассматриваться После регистрации препарата в М3 РФ планируют-как компонент фармакологического действия препара- ся дополнительные исследования для расширения пота. У 2 больных развились побочные эффекты, потребо- казаний к его применению. Так, в РОНЦ РАМН полу-вавшие дополнительного лечения: преходящая энцефа- чен предварительный положительный опыт примене-лопатия в виде вестибулярных расстройств и неадкват- ния Атэмоната для лечения реакции “трансплантат-ности поведения на фоне гипертермии в одном случае против-хозяина” у больного лейкозом, подвергавшего-и отек легких в другом случае. Однако у этих больных ся высокодозовой химиотерапии и аллогенной транскурс применения Атэмоната не прерывался, и криз от- плантации костного мозга. При применении Атэмоната торжения трансплантата был успешно купирован. продемонстрирована возможность некоторого ослаблена фоне применения Атэмоната сероконверсия ния тяжести этой реакции по показателю потребности с появлением антител к цитомегаловирусу (ЦМВ) об- больных в переливаниях тромбоцитарной массы. наружена у 2 больных (10 %). Такая низкая частота развития ЦМВ-инфекции подтверждает селектив- ИММУНОМАГНИТНЫЕ СОРБЕНТЫ ность действия препарата на клеточное звено иммуни- ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ КЛЕТОК тета. В целом Атэмонат хорошо переносился больны- Предпосылки ми, и ни в одном случае неблагоприятные побочные Один из наиболее перспективных методов приме-явления не потребовали досрочного прекращения ле- нения магнитных материалов в биологии и медицине -чения. магнитная сепарация, т.е. разделение смеси биологи-Полученные в результате исследования данные ческих объектов по магнитным свойствам в приложен-свидетельствуют о высокой эффективности и безопас- ном магнитном поле. Магнитная сепарация обладает ности применения Атэмоната для лечения РООТ у ре- рядом преимуществ перед традиционно используемы-ципиентов трансплантата почки. Добавление Атэмона- ми в биологии методами разделения: высокая произво-та в стандартную схему имму но супрессии позволяет дительность выгодно отличает ее от цитофлюоримет-подавить РООТ и достичь восстановления экскретор- рического разделения клеток, скорость и простота - от ной функции трансплантата у 90% больных. По боль- различных видов хроматографии, безопасность и ми-шинству показателей Атэмонат столь же эффективен, нимальное количество отходов - от экстракции с при-как импортные препараты-аналоги. Эффективность менением разнообразных растворителей. Оборудова-Атэмоната сохраняется при его повторном применении ние для магнитной сепарации дешевое и несложное у больных, ранее получавших препарат для купирова- в эксплуатации: в большинстве случаев достаточно ния РООТ и имеющих рецидив отторжения. постоянного магнита, а различные виды магнитных В отличие от существующих традиционных имму- сепараторов устроены гораздо проще по сравнению, носупрессоров Атэмонат селективно угнетает клеточ- например, с проточным цитофлюориметром или со-ное звено иммунитета, не влияя на гуморальный им- временной хроматографической системой. мунитет и неспецифические иммунные реакции. Бла- В качестве разделяемых биологических объектов годаря этому обеспечивается целенаправленное чаще всего выступают молекулы и клетки. Большин-воздействие на процесс отторжения трансплантата ство таких объектов не обладают собственными маи сохраняется защита организма против вирусных гнитными свойствами, и для придания таких свойств и бактериальных инфекций. их конъюгируют с магнитными частицами. Связать Наблюдавшиеся неблагоприятные побочные явле- молекулы с магнитоуправляемым сорбентом можно ния не требуют досрочного прекращения лечения и со- различными способами: обратимым или необратимым ответствуют спектру побочных эффектов других пре- химическим взаимодействием, адсорбцией или аб-паратов моноклональных антител к антигену СЭ3. сорбцией. При выделении клеток чаще всего исполь-Учитывая, что РООТ ведет к потере трансплантата зуется взаимодействие антиген-антитело. В отноше-и угрожает жизни больного, выгода от применения нии клеток может использоваться и другой метод: они Атэмоната значительно перевешивает риск от возмож- могут фагоцитировать частицы ферромагнетика (чаще ных неблагоприятных побочных явлений. всего магнетита), что вырабатывает у них способность Таким образом, препарат моноклональных анти- к взаимодействию с внешними магнитными полями. тел против С03-антигена Т-лимфоцитов человека Атэ- Ключевую роль в магнитной сепарации играют монат эффективен и безопасен для лечения РООТ магнитоуправляемые сорбенты. С одной стороны, они у реципиентов трансплантата почки. Атэмонат - пер- взаимодействуют с биологическими объектом, с дру-вый отечественный препарат этого типа, который при- гой - обладают выраженными магнитными свойства-зван заменить дорогостоящие импортные аналоги ми. Структура сорбента во многом обусловлена степе-и сделать препараты этой группы доступными россий- нью специфичности данного взаимодействия. В про-ским больным. Безусловно регистрация и дальнейшее стейшем случае магнитоуправляемый сорбент может медицинское применение Атэмоната будут способ- состоять из одного компонента, обладающего магнит-ствовать улучшению качества лечения больных, нуж- ными свойствами, на поверхности частиц которого дающихся в современных иммуносупрессорах для ку- происходит сорбция биообъектов (чаще всего моле-пирования угрожающего жизни состояния - реакции кул). Но обычно этого бывает недостаточно, и для отторжения трансплантата [1]. обеспечения специфичного взаимодействия требуют- —(
№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 1
1 1
32 БИОТЕРАПИЯ
к ся посредники между магнитовосприимчивым компо- ладающие высокой намагниченностью насыщения нентом и биообъектом. Один из них - оболочка или и низкой остаточной намагниченностью. Магнитоуп-матрица сорбента. Выбор магнитовосприимчивых равляемые сорбенты на основе магнетита способны компонентов весьма ограничен, в то время, как коли- к магнитофорезу в полях доступной напряженности чество возможных матриц очень велико. Это сущест- (до 4x105 А^м-1) и градиента (до 4x104 А^м-2), создава-венно расширяет сферу применения магнитоуправляе- емых постоянными магнитами. Сила взаимодействия мых сорбентов. Для высокоспецифичного взаимодей- магнитомеченого объекта со внешним полем в данном ствия с биообъектами требуется еще один посредник - случае в 106 раз превышает силу взаимодействия с по-биологически активный лиганд. лем диамагнетиков. Это позволяет в течение коротких Различают биологически совместимые и биодег- промежутков времени (от нескольких минут до полу-радируемые сорбенты. Первые не оказывают негатив- часа) выделять чистые фракции биообъектов с требуе-ного влияния на биологические объекты, вторые раз- мыми характеристиками. Частицы сорбентов на осно-рушаются в организме с помощью естественных мета- ве магнетита устойчивы к спонтанной агрегации в су-болических процессов. спензиях. Важной является и возможность получения В качестве магнитовосприимчивого компонента частиц магнетита различных размеров: от десятков на-используются металлы семейства железа (железо, ни- нометров (монокристаллы) до десятков микрометров кель, кобальт), их сплавы и соединения, в ряде случаев (поликристаллы и агрегаты поликристаллов). Это по-применяются и некоторые редкоземельные элементы зволяет получать широкий спектр сорбентов с разны-(самарий, неодим). Чаше всего применяются железо ми размерами частиц, что оказывается важным для и его оксиды. Это особенно важно в случае биодегра- различных областей применения: при пробоподготов-дируемых сорбентов, так как в организме существуют ке в лабораторной диагностике важна скорость выде-естественные механизмы утилизации железа. ления, простота и дешевизна технических средств, по-Магнитовосприимчивый компонент может фор- этому здесь могут использоваться частицы сорбентов мировать выраженное ядро (кор) или диффузно инкор- больших размеров (5...10 мкм). Для выделения клеток порироваться в матрицу. предпочтительно, чтобы частицы биосовместимых Оболочки магнитоуправляемых сорбентов чрезвы- сорбентов имели размеры от 1 до 5 мкм, а биодегради-чайно разнообразны. Они могут быть представлены руемые сорбенты, вводимые в организм вместе с выде-различными полимерами как биологического проис- ленными клетками, должны иметь размеры много хождения, так и полученными в результате химическо- меньшие (50...500 нм). Для биодеградируемых сорбен-го синтеза. В качестве первых широко применяются тов необходимым свойством является и то, что магне-белки (альбумин, желатин) и полисахариды (хитозан, тит может утилизироваться в организме посредством крахмал, декстрины, декстраны). Среди вторых наибо- нормальных метаболических процессов. лее часто используются полиэфиры, полиоксиалкены, Общим требованием, предъявляемым к матрицам, акрилаты, сополимеры на основе полистирола, компо- является наличие в их составе доступных, чаще всего зиты на основе диоксида кремния. поверхностных, функциональных групп, что опреде-Биоактивные лиганды обусловливают специфиче- ляет их способность либо напрямую взаимодейство-ское взаимодействие магнитоуправляемого сорбента вать с биологическими объектами, либо присоединять с биологическими объектами и в конечном итоге выде- биоактивные лиганды. К числу таких групп относятся ление последних по заданным характеристикам. гидроксильные, альдегидные, карбоксильные, гидра-На практике широко применяются моноклональные зидные, амидные, хлорметильные, эпоксидные, то-антитела (иммуносорбенты), аналоги субстратов для зильные и другие. выделения ферментов, система биотин-стрептавидин Другое необходимое свойство материала матри-(универсальные сорбенты). цы - минимальное неспецифическое взаимодействие К магнитоуправляемым сорбентам и их основным с биологическими объектами. компонентам предъявляется ряд требований как обще- В зависимости от области применения матрицы го характера, так и частных, определяемых областью могут быть биологически совместимыми или биодег-применения каждого конкретного сорбента. радируемыми. В первом случае также требуются меха-К общим требованиям относятся прежде всего ма- ническая прочность и химическая устойчивость мате-гнитные характеристики, такие, как намагниченность риалы матрицы. насыщения, обусловливающая способность частиц Область применения магнитоуправляемого сор-сорбента к направленному движению в приложенном бента обусловливает и характер используемого биоло-внешнем магнитном поле магнитофорезу, и остаточ- гически активного лиганда. Например, для выделения ная намагниченность, определяющая способность ча- суммарной фракции нуклеиновых кислот из образца стиц к спонтанному агрегированию, связанную с на- можно вообще обойтись без биоактивного лиганда, личием у них магнитного момента в отсутствие внеш- используя сорбенты с матрицей на основе диоксида него поля. Магнитные характеристики сорбента кремния. Для выделения специфических нуклеиновых определяются характером магнитовосприимчивого кислот используются олигонуклеотиды, для выделе-компонента. В качестве последнего предпочтительны ния растворимых и корпускулярных антигенов, а так-мягкие ферромагнетики, например, магнетит, как об- же клеток - поликлональные и моноклональные анти- Ч
№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 1
тела. В универсальных магнитоуправляемых сорбентах могут использоваться системы на основе пары биотин-стрептавидин.
Биоактивный лиганд может сорбироваться на материале матрицы, а может присоединяться посредством химических связей: хелатных или ковалентных. Химическое присоединение предпочтительнее, так как сорбенты, полученные таким путем, более стабильны при хранении, биоактивный лиганд в их составе меньше подвержен изменениям со временем, существует возможность присоединения лиганда в стериче-ски предпочтительной конфигурации, что позволяет обеспечить оптимальные условия взаимодействия биологического объекта с магнитоуправляемым сорбентом [4].
Исследования лаборатории медицинской биотехнологии
В лаборатории медицинской биотехнологии НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН в течение ряда лет ведется систематическая работа по созданию магнитоуправляемых сорбентов для биологического и медицинского применения. В их числе - сорбенты из магнетита и композитов на основе диоксида кремния (ФерроСил), магнетита с оболочкой на основе полистирола и его сополимеров (ФерроПол), магнетита и декстрана (ФерроДекс).
Ферросил
Магнитоуправляемые иммуносорбенты ФерроСил являются биологически совместимыми и характеризуются намагниченностью насыщения 35...45 кА^м-1, остаточной намагниченностью, не превышающей 1,5 кА^м-1, размеры частиц сорбента составляют 0,5...0,6 мкм (95 % общего объема), удельное содержание антител — 10...30 мкг на 1 мг носителя. Структура Ферросила показана на рис. 2.
Магнитоуправляемые сорбенты из магнетита с оболочкой из композита на основе диоксида кремния полу-
чали методом температурной поликонденсации крем-нийорганического олигомера на поверхности частиц магнетита в одной суспензии с последующей активацией тетрахлоридом титана и присоединением антител с образованием хелатного комплекса. В настоящее время путем иммобилизации моноклональных антител 1С0-90, 1С0-86,1С0-31,1С0-115,1С0-180 созданы магнитоупра-ляемые иммуносорбенты ФерроСил-90, ФерроСил-86, ФерроСил-31, ФерроСил-115, ФерроСил-180. Разработан лабораторный регламент их получения [6].
Ферропол
Магнитоуправляемые иммуносорбенты ФерроПол являются биологически совместимыми и характеризуются намагниченностью насыщения 15...20 кА^м-1, остаточной намагниченностью, не превышающей
0,5 кА^м-1, размеры частиц сорбента составляют
1,8...2,2 мкм (90 % общего объема), удельное содержание антител — 10...30 мкг на 1 мг носителя. Структура Ферропола показана на рис. 3.
Магнитоуправляемые сорбенты из магнетита с оболочкой из полистирола и сополимеров на основе полистирола получали методом радикальной эмульсионной полимеризации коллоидной системы, представляющей собой эмульсию смеси мономеров в водной фазе, где эмульсионные капли, в свою очередь, являются суспензией частиц магнетита в смеси мономеров. В качестве мономеров выступают стирол, диви-нилбензол (сшивающий агент), малеиновый ангидрид или метакриловая кислота (источники карбоксильных групп). Далее матрицу из полистирола или сополимера стирола с дивинилбензолом активируют толуол-сульфонилхлоридом, а матрицу из сополимера стирола с малеиновым ангидридом или метакриловой кислотой 1 -этил-3 -(3 -диметил-аминопропил)-карбоди-имидом, после чего присоединяют антитела. В настоящее время на основе носителей из магнетита с оболочкой из полистирола и его сополимеров и моноклональных антител 1С0-90,1С0-86,1С0-31,1С0-115,1С0-180
Рис. 2. Структура магнитоуправляемого иммуносорбента ФерроСил:
1 — магнитовосприимчивый компонент;
2 — матрица.
Рис. 3. Структура магнитоуправляемого носителя ФерроПол:
1 — магнитовосприимчивый компонент;
2 — матрица;
3 — оболочка.
получены магнитоупраляемые иммуносорбенты ФерроПол-90, ФерроПол-86, ФерроПол-31, ФерроПол-115, ФерроПол-180. Разработан лабораторный регламент их производства [8].
Ферродекс
Магнитоуправляемые иммуносорбенты ФерроДекс являются биодеградируемыми и характеризуются намагниченностью насыщения 18...22 кА^м-1, остаточной намагниченностью, не превышающей 0,7 кА^м-1, размеры частиц сорбента составляют 70...90 нм (90 % от общего объема), удельное содержание антител —
10...20 мкг на 1 мг носителя. Структура Ферродекса показана на рис. 4.
Магнитоуправляемые сорбенты на основе магнетита и декстрана получали путем адсорбции декстра-на на поверхности частиц магнетита в водной суспензии, стабилизированной цитрат-фосфатной буферной системой с последующей сополимеризацией с эпи-хлорогидрином для предотвращения десорбции декстрана. Матрицу активируют периодатным окислением, после чего проводят иммобилизацию антител. В настоящее время на основе магнетит-декстранового носителя и моноклональных антител 1С0-115 получен магнитоуправляемый иммуносорбент ФерроДекс-115. Проведенные токсикологические исследования препарата магнитоуправляемого иммуносорбента ФерроДекс-115 показали, что он не влияет на физико-химические свойства крови, хорошо переносится животными (мышами, кроликами), не оказывает местнораздражающего действия, не обладает пирогенны-ми свойствами [5].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В лаборатории медицинской биотехнологии НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН ведутся активные работы по созданию терапевтических препаратов на основе моноклональных антител, и в этом направлении достигнуты большие успехи. В ближайшее
Рис. 4. Структура магнитоуправляемого сорбента (ФерроДекс):
1 — магнитовосприимчивый компонент;
2 — матрица;
3 — биоактивный лиганд (антитело)
время ожидается регистрация в М3 РФ 2 препаратов -Атэмоната и Имутерана, и список этих препаратов планируется расширять. Также достигнут значительный успех в создании различных типов иммунома-гнитных сорбентов, и эта работа будет продолжена для продвижения этих сорбентов в клинику с целью выделения и очистки различных фракций клеток костного мозга у онкологических больных.
3а период с 2002 по 2006 гг. сотрудниками лаборатории опубликовано более 40 научных работ в периодических журналах (в том числе за рубежом), тематических сборниках статей и сборниках российских и зарубежных научных конференций.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барышников А. Ю., Иванов П. К. Создание, экспериментальное и клиническое изучение препарата Атэма: Экспериментальная онкология на рубеже веков. - Под ред. М. И. Давыдова, А. Ю. Барышникова. - М., 2003. - С. 319-344.
2. Барышников А. Ю., Иванов П. К., Чмутин Е. Ф. Создание противоопухолевых препаратов на основе моноклональных антител: предпосылки и достижения // Вестник РАМН. - 2004. - 12. - С. 10-16.
3. Барышников А. Ю., Иванов П. К., Чмутин Е. Ф. Новейшие подходы в терапии рака. Моноклональные антитела в диагностике и терапии рака. - Энциклопедия противоопухолевых средств. Под ред. Давыдова М. И. - М., 2004.
4. Блохин Д. Ю., Голенкина Е. А., Иванов П. К. и др. Иммуномагнитная сепарация в онкологии: Экспериментальная онкология на рубеже веков. - Под ред. М. И. Давыдова, А. Ю. Барышникова. - М., 2003. - С. 439-464.
5. Блохин Д.Ю., Иванов П. К., Ларин М. Ю. и др. Биодеградируемые имуномагнитные сорбенты в онкологии // РБЖ. - 2005. - Т. 4, № 3. - C. 24-29.
6. Буркова А. А., Голенкина Е. А., Филиппов В. И. и др. Иммуномагнитные сорбенты в селекции Т-лим-фоцитов человека // РБЖ. - 2002. - Т. 1, № 3. - С. 41-48.
7. Иванов П. К. Терапевтические моноклональные антитела // РБЖ. - 2002. - Т. 1, № 2. - C. 48-54.
8. Blokhin D., Golenkina E., Ivanov P. et al. Development of immunomagnetic reagents for human hemapoietic cell sorting // Mat. 4th Intl.Conf. “Scientific and clinical applications of magnetic carriers”, Tallahassee, USA, 9-11 May, 2002. - P. 174-176.
9. Chmutin E. F., Grinevich A. S, Ivanov P. K. et al. Phase I clinical trial of anti-MUC1 monoclonal antibody //Proc.12th Intl. Congr. on Anti-Cancer Treatment, Paris (France), 4-7 February, 2002. - P. 108.
10. Chmutin E. F., Ivanov P. K., Yakubovskaya R. I. et al. Therapeutic monoclonal anti-MUC1 antibodies (IMUTERAN): interim analysis of the results of the phase
II clinical trial // Proc. 3rd Intl. Symp. Targeted Anticancer Therapies, Amsterdam, The Netherlands, March 3-5, 2005. - P. 802.
Поступила 15.09.2006.
