CC BY
10
УДК 616.9
А.Н.Мокриевич, Г.М.Вахрамеева, Р.И.Миронова, Т.И.Комбарова, И.В.Бахтеева, Г.М.Титарева,
Т.Б.Кравченко, И.А.Дятлов, В.М.Павлов
СОЗДАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ВАРИАНТОВ ВАКЦИННОГО ШТАММА FRANCISELLA TULARENSIS
БЕЗ ГЕНОВ Ю1.С. СООБЩЕНИЕ 2
ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Оболенск,
Российская Федерация
Делеция одной копии гена iglC в вакцинном штамме Е їиіагєтіі' 15 не влияет на его способность размножаться в организме мышей, приводит к задержке выработки антител к суммарному антигену туляремийного микроба, не изменяет уровень продукции гамма-интерферона в ответ на стимуляцию ультразвуковым дезинтегратом штамма Е їиіагєтіі' 15, увеличивает LD50 для мышей линии ВАЬВ/с на порядок при сохранении протективных свойств. Штамм 15 без двух копий гена iglC не способен размножаться в организме мышей, индуцирует выработку слабого гуморального ответа, отличается сниженной на порядок способностью формировать спленоци-ты, активирующиеся при добавлении туляремийного антигена, полностью авирулентен и обладает сниженной протективной активностью. Введение мышам сывороток, взятых через 49 сут от животных, иммунизированных как исходным штаммом Е їиіагєтіі' 15, так и его вариантами с одним и двумя инактивированными генами iglC, обеспечивало их стопроцентную защиту от последующего заражения 200 DCL штамма Е їиіагєтіі' 15. Однако при заражении вирулентными штаммами Е їиіагєтіі' 503 и Е їиіагєтіі' Schu (50 DCL и 25 DCL, соответственно) мышей линии ВАЬВ/с, которым за 24 ч были введены иммунные сыворотки, имело место только увеличение средней продолжительности жизни.
Ключевые слова: Егапєіі'вііа їиіагєтіі', ген iglC, протективность, антитела.
A.N.Mokrievich, G.M.Vakhrameeva, R.I.Mironova, T.LKombarova, LV.Bakhteeva, G.M.Titareva, T.B.Kravchenko, I.A.Dyatlov, V.M.Pavlov
Construction and Investigation of the Variants of the Vaccine Strain Francisella tularensis Lacking iglC Genes. Communication 2
State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Russian Federation
Single copy deletion of the iglC gene in the vaccine Francisella tularensis strain 15 has no impact on its ability to replicate in mice organism, factors into the delay of antibody production to total tularemia microbe antigen, does not affect gamma interferon production levels in response to stimulation by ultrasound disintegrator. It also increases LD50 for BALB/c mice by an order while retaining protective properties. Strain Francisella tularensis 15 lacking two copies of the iglC gene cannot replicate in mice organism, induces weak humoral response, is fully avirulent, and has decreased protective activity. Treatment of mice with sera obtained from the animals immunized on day 49 post immunization both with the stock F. tularensis 15 strain and its variants with one or two inactivated iglC genes has provided for 100 % protection from challenge with 200 DCL of F. tularensis 15 strain. However in case of BALB/c mice exposure to virulent F. tularensis 503 and F. tularensis Schu strains (50 DCL and 25 DSL, respectively), treated with immune sera 24 hours before, registered has been only mean lifetime increase.
Key words: Francisella tularensis, iglC gene, protective activity, antibodies.
Ранее было показано, что инактивация двух копий гена iglC как в варианте экспериментального вакцинного штамма LVS (принадлежащему к голарктическому подвиду), так и в вирулентном штамме Schu неарктического подвида приводит к утрате их протективных свойств и, соответственно, неспособности защитить мышей от заражения вирулентными штаммами Е tularensis [3, 4, 6]. Однако в этих работах не проведено детального изучения гуморального и клеточного звена противотуляремийного иммунитета у мышей, вакцинированных дефектными по гену iglC штаммами.
Целью данной работы являлось изучение иммунобиологических свойств вариантов вакцинного штамма Е tularensis 15 без одной и двух копий гена iglC.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы. В работе использова-
ли штаммы из Государственной коллекции «ГКПМ-Оболенск»: вакцинный штамм F. tularensis subsp. ho-larctica 15 НИИЭГ; его нокаутные мутанты - F. tularensis 15/23-1 (с инактивированной одной копией гена iglC) и F. tularensis 15/23-2 (с инактивированными двумя копиями гена iglC); тест-заражающие вирулентные штаммы F. tularensis subsp. holarctica 503 и F. tularensis subsp. tularensis Schu.
Лабораторные животные. В работе использовались инбредные мыши линии BALB/c обоего пола (ФИБХ Питомник «Пущино», МО, г. Пущино). Вес мышей составлял 18-20 г, возраст - 6-8 недель. Содержание и манипуляции с животными выполняли в виварии, соответствующем требованиям GAC (Good Animal Care) и протоколу № P03-20 комитета по биоэтике ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии.
Условия культивирования. Штаммы F. tularensis выращивали при температуре 37 °С на плотной (FTA) и жидкой (FTB) питательной средеах Состав
FTA: 3,8 % эритрит-агар, 1 % высушенная кровь крупного рогатого скота, 1 % глюкоза, 0,05 % ци-стеин, 0,0025 % тиамин хлорид, pH 7,2 (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Московская обл.), Состав FTB [2]: 2 % ферментативный гидролизат казеина, 1 % дрожжевой экстракт, 1,2 % KH2PO4, 1 % глюкоза, 0,001 % цистеин, 0,001 % FeCl2, p H 7,2 (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Московская обл.). При необходимости в среду добавляли 100 мкг/мл полимиксина B.
Вирулентность. Мышам (по 5 в группе) вводили подкожно по 0,2 мл 10-кратных разведений бактериальной суспензии (5409 КОЕ/мл) в забуференном физиологическом растворе, pH 7,4 (ЗФР), полученной из ночной агаровой культуры. За животными наблюдали в течение 28 дней. Погибших мышей вскрывали и подвергали бактериологическому исследованию. Расчет величины LD50 проводили по методу Кербера в модификации И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева [1].
Приживаемость штаммов F. tularensis в организме мышей. Экспериментальных животных вакцинировали подкожно клетками исследуемых штаммов F. tularensis в дозе Ы02 КОЕ для штаммов 15 и 15/23-1 и в дозе 1-106 КОЕ для штамма 15/23-2. На 4, 7, 14-е и 21-е сутки проводили эвтаназию животных, селезенки гомогенизировали и суспендировали в 5 мл ЗФР. Из полученной взвеси готовили десятикратные разведения. Высевы проводили на плотную питательную среду и инкубировали при температуре 37 °С. Результаты учитывали через 72 ч.
Протективность. Оценку способности исследуемых штаммов защищать животных (ED50) от подкожного заражения вирулентными штаммами F. tularensis проводили по количеству бактерий, защищающих 50 % вакцинированных мышей от заражения дозами 1000 DCL (Dosis certa letalis).
Определение уровня синтеза гамма-интерферона спленоцитами иммунизированных мышей. Мышей на 28-е сутки после иммунизации эвтаназирова-ли ингаляцией СО2. Стерильно вскрывали брюшную полость и забирали селезенку, гомогенизировали через капроновый фильтр в среде RPMI-1640 (Панэко, Россия). Суспензию спленоцитов дважды промывали в среде RPMI-1640, после каждой промывки клетки осаждали центрифугированием при 250 g в течение 10 мин. Отмытые клетки суспендировали до конечной концентрации 5-106 клеток/мл в питательной среде на основе RPMI-1640 с добавлением 10 % фетальной сыворотки теленка, 2 мМ глутамина, 5 мМ меркаптоэтанола, 20 мкМ Hepes. Для индукции синтеза гамма-интерферона в среду культивирования вносили ультразвуковой дезинтеграт (УЗД) суспензии клеток F. tularensis (концентрация суспензии -1-108 м.к./мл). Митоген конканавалин А (Sigma) в концентрации 5 мкг/мл применяли в качестве положительного контроля. Спленоциты культивировали при температуре 37 °С, 5 % СО2 и 100 % влажности в течение 72 ч. Затем из лунок отбирали супернатант и определяли в нем концентрацию гамма-интерферона иммуноферментным методом, используя наборы
фирмы eBioScience (Австрия), согласно инструкции производителя.
Получение мышиных сывороток, специфичных к возбудителю туляремии. Мышам вводили подкожно клетки штаммов F tularensis 15, F tularensis 15/23-1 и F. tularensis 15/23-2. В разные сроки наблюдения животных эвтаназировали и проводили тотальный забор крови (от каждой мыши - отдельно). На следующий день сыворотки объединяли по группам, прогревали при температуре 55 °С в течение 30 мин для инактивации комплемента и определяли титр противотуляремийных антител с использованием УЗД клеток штамма F. tularensis 15.
ИФА. На 96-луночные планшеты фирмы Greiner Bio-One (Германия) средней сорбции адсорбировали УЗД F. tularensis (концентрация суспензии -1-108 м.к./мл) в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,6. Адсорбцию антигенов проводили в течение ночи при температуре 4 °С. Для инактивации свободных центров связывания в лунки добавляли раствор 3 % сухого обезжиренного молока (Fluka, Швейцария) и инкубировали при температуре 37 °С в течение 30 мин.
Сыворотки титровали с шагом 1:2 и инкубировали с антигеном в течение 1 ч при температуре 37 °С. После удаления сыворотки и трехкратной отмывки карбонат-бикарбонатным буфером в лунки вносили раствор коньюгата козьих антимышиных поливалентных антител к иммуноглобулинам мыши (IgG, IgA, IgM) - пероксидаза хрена (Amersham, США) в рабочем разведении 1:10000 и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 °С.
Ферментативную реакцию проводили с использованием в качестве хромогена о-фенилендиамина (ОФД) (4 мг/мл). Планшет инкубировали в течение 20 мин в темноте и реакцию останавливали внесением 0,1 мл 0,1 М соляной кислоты. Оптическую плотность (ОД) в лунках измеряли при длине волны 492 нм. За титр антител принимали максимальное разведение сыворотки, в которой ОД хромогена превышало двойное значение фоновой оптической плотности.
Оценка гуморальной пассивной защиты. Чистым мышам (по 8 животных в группе) внутри-брюшинно вводили по 200 мкл сыворотки и через 24 ч животных заражали подкожно бактериальными суспензиями штаммов F. tularensis 15, F. tularensis 503 и F. tularensis Schu. За животными наблюдали в течение 21 дня. В качестве контроля использовали мышей, которым внутрибрюшинно вводили сыворотку, полученную от чистых животных.
Результаты и обсуждение
Персистенцию бактерий вакцинного штамма F. tularensis и его производных в организме экспериментальных мышей оценивали по концентрации туляремийного микроба в селезенках на 4, 7, 14-е и 21-е сутки после инфицирования (рис. 1).
Из данных рис. 1 следует, что наличие гена iglC
Рис. 1. Влияние гена iglC F. tularensis на способность к перси-стенции в организме мышей линии BALB/c. Результаты показаны как значение Lg КОЕ/орган с доверительным интервалом (Р < 0,05)
позволяет штаммам F. tularensis 15 и 15/23-1, вводимым мышам в дозе 1-102 КОЕ/мышь, не только сохранять жизнеспособность, но и размножаться в организме мышей в течение первых 7 сут. Количество бактерий штаммов 15 и 15/23-1 в селезенках на 14-е сутки уменьшалась в 1000 раз.
Модифицированный штамм F. tularensis без двух генов iglC даже при введении мышам бактериальных клеток в количестве 1-106 КОЕ/мышь хотя и обнаруживался в организме животных вплоть до 21-х суток, но, видимо, не размножался.
У вакцинированных мышей была определена динамика нарастания концентрации антител к антигенам F. tularensis. Сыворотки были получены в период с 4-го по 28-й день после начала эксперимента и объединены по группам. Реципрокные титры антител в объединенных сыворотках различных групп мышей приведены на рис. 2, данные которого показывают, что иммунизация штаммом F. tularensis 15 (доза - 1-102 КОЕ) приводила к более раннему (на 7-е сутки) появлению наибольшего уровня антител к суммарному антигену туляремийного микроба в титре 1:1200 по сравнению со штаммом F. tularensis
Рис. 3. Влияние гена iglC Е. tularensis на индуцированный синтез гамма-интерферона спленоцитами мышей
15/23-1 (доза 1-102 КОЕ), введение которого приводило к индукции наибольших значений титров антител 1:800 на 14-е сутки. Штамм Е tularensis 15/23-2 (доза 1-106 КОЕ) индуцировал выработку слабого гуморального ответа - титры антител достигали наибольших значений 1:100 только на 21-е сутки.
Напряженность клеточного звена иммунитета у вакцинированных мышей оценивали по продукции гамма-интерферона спленоцитами в ответ на стимуляцию УЗД штамма Е tularensis 15 (рис. 3).
В группах мышей, вакцинированных штаммами Е tularensis 15 и 15/23-1 (дозы 1-102 КОЕ), продукция гамма-интерферона превышала более чем в 10 раз продукцию гамма-интерферона спленоцитами, взятыми у мышей, вакцинированных штаммом Е шШг-ensis 15/23-2 (доза Ы06 КОЕ). Это позволяет предполагать, что инактивация одной копии гена iglC не влияет на способность бактерий формировать спленоци-ты, активирующиеся при добавлении туляремийного антигена. В то же время отсутствие обеих копий гена iglC значительно снижает эту способность, что следует из низкого уровня синтеза гамма-интерферона. Величины LD50 и ED50 для мышей линии BALB/c исследуемых штаммов приведены в таблице.
Делеция одной копии гена в вакцинном штамме Е tularensis 15/23-1 при подкожном заражении мышей снижала вирулентность только в 10 раз, тогда как делеция обеих копий гена iglC делала штамм полностью авирулентным.
Вакцинный штамм без одной копии гена iglC защищал мышей от заражения вирулентными штаммами туляремийного микроба с эффективностью, характерной для родительского вакцинного штамма
7 14
Время, сутки
Рис. 2. Влияние гена iglC Е. tularensis на динамику уровня индукции специфических иммуноглобулинов у вакцинированных мышей
Штаммы F. tularensis LD50 ED50 для штамма F tularensis 503 ED50 для штамма F. tularensis Schu
15 НИИЭГ 79,0 (40^110) 8,5 (1,8^53,7) 34,5(13,8^102,7)
15/23-1 794,0 (25Н3162) 10,9 (2,8^43,6) 45,9 (18,8^124,6)
15/23-2 >109 Нет защиты Нет защиты
Величины LD50 и ED50 на модели мышеи линии BALB/c
Е tularensis 15. Удаление обеих копий гена из вакцинного штамма приводило к исчезновению протек-тивности, хотя наблюдалось удлинение средней продолжительности жизни (СПЖ) животных до 9,3 сут в случае заражения штаммом Е tularensis 503 и до 8,7 сут при заражении штаммом Е tularensis Schu по сравнению с контрольной группой (СПЖ - 5,6 и 5,2 сут соответственно).
Введение мышам сывороток, взятых через 49 сут от животных, иммунизированных как исходным штаммом Е tularensis 15 (3,5-Ю1 КОЕ/мышь), так и его вариантами с одним (8-101 КОЕ/мышь) и двумя (1,3-106 КОЕ/мышь) инактивированными генами iglC, обеспечивало их стопроцентную защиту от последующего заражения 200 DCL штамма Е Ш1агеп-sis 15. Однако в случае заражения мышей, которым предварительно были введены иммунные сыворотки, вирулентными штаммами - 50 DCL Е tularensis 503 и 25 DCL Е tularensis Schu - имело место только увеличение СПЖ. В случае введения сывороток от животных, вакцинированных штаммом Е tularensis 15/23-2, эта величина составляла 8 и 7,14 сут соответственно, тогда как для животных, обработанных нормальной сывороткой СПЖ, равнялась 6,75 и 6,3 сут, а чистых животных - 6,0 и 5,8 сут соответственно.
Результаты проведенных нами экспериментов по оценке протективности вариантов вакцинного штамма Е tularensis 15 без одной и двух копий генов iglC согласуются с высказанным ранее мнением о том, что для формирования протективного иммунитета необходимо размножение туляремийного микроба в клетках иммунной системы [5]. Нами показано, что штамм Е tularensis 15 без двух копий генов iglC практически не способен к размножению в макрофагах, а также не способен индуцировать клеточный иммунитет и, как следствие, защищать животных от заражения вирулентными штаммами туляремийного микроба. Введение высоких концентраций (1-107 КОЕ) бактерий штамма Е tularensis 15/23-2 мышам индуцировало формирование протективных специфических антител, которые позволяли животным выживать после заражения вакцинным штаммом, но не защищали их от природных изолятов туляремийного микроба. Полученные результаты дополнительно подтверждают положение о ключевой роли клеточного иммунитета в защите от туляремийной инфекции.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз; 1962. 58 с.
2. Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Домотенко Л.В., Храмов М.В. Простая жидкая питательная среда для молекулярно-генетических исследований Francisella tularensis. Пробл. особо опасных инф. 2009; 4(102):66-7.
3. Conlan J.W., Shen H., Golovliov I, Zingmark C., Oyston P.C.F., Wangxue C., House R.V, Sjostedt A. Differential ability of novel attenuated targeted deletion mutants of Francisella tularensis subspecies tularensis strain SCHU S4 to protect mice against aerosol challenge with virulent bacteria: Effects of host background and route of immunization. Vaccine. 2010; 28:1824-31.
4. Golovliov I., Sjostedt A., Mokrievich A., Pavlov V. A method for allelic replacement in Francisella tularensis. FEMS Microbiol. Lett. 2003; 222:273-80.
5. Pechous R.D., McCarthy T.R., Zahrt T.C. Working toward the Future: Insights into Francisella tularensis Pathogenesis and Vaccine Development. Microbiol. Molec. Biol. Rev. 2009; 73(4):684-711.
6. Twine S.M., Bystrom M., Chen W., Forsman M., Golovliov I.R., Johansson A., Kelly J., Lindgren H., Svensson K., Zingmark C., Conlan W., Sjostedt A. A mutant of Francisella tularensis strain SCHU S4 lacking the ability to express a 58 kDa protein is attenuated for virulence and an effective live vaccine. Infect. Immun. 2005; 73(12):8345-52.
References
1. Ashmarin I.P., Vorob’ev A.A. [Statistical Methods in Microbiological Investigations]. L.: Medgiz; 1962. 58 p.
2. Lapin A.A., Pavlov V.M., Mokrievich A.N., Domotenko L.V, Khramov M.V. [Simple liquid nutrient medium for molecular-genetic investigations of Francisella tularensis]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2009; 4(102): 66-7.
3. Conlan J.W., Shen H., Golovliov I, Zingmark C., Oyston P.C.F., Wangxue C., House R.V., Sjostedt A. Differential ability of novel attenuated targeted deletion mutants of Francisella tularensis subspecies tularensis strain SCHU S4 to protect mice against aerosol challenge with virulent bacteria: Effects of host background and route of immunization. Vaccine. 2010; 28:1824-31.
4. Golovliov I., Sjostedt A., Mokrievich A., Pavlov V. A method for allelic replacement in Francisella tularensis. FEMS Microbiol. Lett. 2003; 222:273-80.
5. Pechous R.D., McCarthy T.R., Zahrt T.C. Working toward the Future: Insights into Francisella tularensis Pathogenesis and Vaccine Development. Microbiol Molec. Biol Rev. 2009; 73(4):684-711.
6. Twine S.M., Bystrom M., Chen W., Forsman M., Golovliov I.R., Johansson A., Kelly J., Lindgren H., Svensson K., Zingmark C., Conlan W., Sjostedt A. A mutant of Francisella tularensis strain SCHU S4 lacking the ability to express a 58 kDa protein is attenuated for virulence and an effective live vaccine. Infect. Immun. 2005; 73(12):8345-52.
Authors:
Mokrievich A.N., Vakhrameeva G.M., Mironova R.I., Kombarova T.I., Bakhteeva I.V., Titareva G.M., Kravchenko T.B., Dyatlov I.A., Pavlov V.M. State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology. Obolensk, Moscow Region, 142279, Russian Federation. E-mail: info@obolensk.org
Об авторах:
Мокриевич А.Н., Вахрамеева ГМ., МироноваР.И., Комбарова Т.И., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Кравченко Т.Б., Дятлов И.А., Павлов ВМ. Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. Российская Федерация, 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск. E-mail: info@obolensk.org
Поступила 15.08.13.
