CC BY
10
УДК 616.993:615.373
А.Н.Мокриевич, Г.М.Вахрамеева, Р.И.Миронова, Т.И.Комбарова, Г.М.Титарева, Т.Б.Кравченко,
И.В.Бахтеева, И.А.Дятлов, В.М.Павлов
создание и изучение вариантов вдкцинного штамма РГАПС&ЕНА TULARENSIS БЕз генов ідІС.
Сообщение 1
ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», п. Оболенск,
Российская Федерация
Получены варианты вакцинного штамма К їиіагєтіі' subsp. коїагсґіса 15 с делетированными генами iglC. Показано, что в геноме штамма 15 содержится две копии гена iglC. Удаление одной копии гена практически не влияет на культурально-морфологические и ростовые свойства микроба. Бактерии без одной копии гена iglC размножаются в мышиных макрофагах медленнее по сравнению с исходным штаммом, в то время как инактивация двух копий гена iglC в штамме 15 приводит к полной потере способности размножаться в макрофагах.
Ключевые слова: Кrancisella tularensis, аллельный обмен, ген і§1С, фагоцитоз.
A.N.Mokrievich, G.M.Vakhrameeva, R.I.Mironova, T.LKombarova, G.M.Titareva, T.B.Kravchenko, LV.Bakhteeva, I.A.Dyatlov, V.M.Pavlov
Construction and Investigation of the Vaccine Strain Francisella tularensis without iglC genes. Communication 1
State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Russian Federation
Using site-specific mutagenesis constructed were the variants of the vaccine strain F. tularensis subsp. holarctica 15 with the deleted iglC genes. Identified was the fact that genome of the strain 15 contained two copies of iglC gene. Deletion of one of them as well as both had little effect on the cultural-morphological and growth properties of the microbe. At the same time F. tularensis 15 lacking one copy of the iglC gene propagated in mice macrophages several times slower, than the original strain. Inactivation of both of the copies in the chromosome leaded to the emergence of a variant incapable of intracellular reproduction. This capacity in F. tularensis 15/23-2 with two inactivated iglC gene copies was partially recovered after integration of a complementing plasmid. Therewith the data mentioned above testifies to the significance of iglC gene for the process of reproduction in macrophages.
Key words: Francisella tularensis, allele translocation, iglC gene, phagocytosis.
Возбудитель туляремийной инфекции Francisella tularensis является внутриклеточным паразитом и способен размножаться в широком спектре эукариотических клеток [12]. Для внутриклеточного паразитирования бактерии F. tularensis содержат целый комплекс белков, кодируемых генами, расположенными на острове патогенности (ТОП - туля-ремийный остров патогенности, или FPI - Francisella Pathogenicity Island). Одним из ключевых генов этого региона является ген iglC. Белок размером 23 кДа, кодируемый геном iglC, начинает интенсивно накапливаться в бактериальных клетках при попадании туляремийного микроба в макрофаги [6].
Разработанный нами ранее метод сайт-направ-ленного мутагенеза F. tularensis позволил показать, что в геноме штамма LVS содержатся две копии гена iglC [7], что впоследствии было подтверждено прямым секвенированием полного генома штамма F. tularensis LVS [10]. Штамм LVS (Live Vaccine Strain) был отобран в США из изолированных колоний при рассеве лиофильно высушенных бактерий F. tularensis штаммов 15 и 155, переданных из СССР [5]. Анализ нуклеотидных последовательностей геномов штаммов F. tularensis Schu и LVS показал, что в них присутствуют не только две копии гена iglC, но и две копии ТОП. Штамм LVS без двух копий гена
iglC практически не размножается в макрофагах [7], однако, в литературе отсутствуют данные о влиянии делеции гена iglC в геноме вакцинного штамма F tularensis 15 на его способность индуцировать про-тективный иммунитет.
Целью данной работы являлось получение вариантов вакцинного штамма F. tularensis 15 с делетиро-ванными одной и двумя копиями гена iglC и изучение их иммунобиологических свойств.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы и плазмиды. Штаммы и плазмиды, использованные в работе, представлены в таблице.
Праймеры для контроля за определением участка интеграции плазмиды pPVAiglC в хромосому F. tularensis: для встраивания перед геном iglC -23SalL25 5-ACGCGTCGACAAACACTAATAAAGC C-3’ и 23SalR15 5-GCGTGTCGACTTAGCCGTGCC AATTACCA -3’; для встраивания после гена iglC -23SalL15 5’-ACGCGTCGACTACAATGCTAGAAAC CTT-3’ и 23SalR25 5’-GCGTGTCGACACAAGAAGC TGCTAATGCT-3’ [7].
Условия культивирования. Штаммы E. coli выращивали при температуре 37 °С на плотной и жид-
Бактериальные штаммы и плазмиды
Название
Характеристика
Источник или ссылка
F tularensis 15 НИИЭГ F. tularensis 15/23-1 F. tularensis 15/23-2 F tularensis 15/23-2com E. coli S17-1 Xpir
E. coli S17(pPV)
E. coli S17(pPVAiglC)
E. coli DH5a
E. coli DH5a(pHV33')
E. coli DH5a(pHV33'iglC)
pPVAiglC
pHV33'
pHV33'iglC
subsp. holarctica, вакцинный штамм
F. tularensis 15 НИИЭГ с инактивированной одной копией гена iglC
F. tularensis 15 НИИЭГ с инактивированными двумя копиями гена iglC
F. tularensis 15/23-2 с интегрированной плазмидой pHV33'iglC
(thi pro hsdR- hsdM+ recA RP4-2-Tc::Mu-Km::Tn7(TpR SmR)); лизогенное производное S17-1, продуцирующее п-белок, необходимый для репликации плазмид, содержащих
ori6K
Производный штамма S17-1 Xpir, содержащий плазмиду pPV, AmpR, CmR
Производный штамма S17-1 Xpir, содержащий плазмиду pPVA23, AmpR , CmR
F- ($80dlacZAM15) recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17(r~ m.+) supE44 relAl deoR AflacZYA-
argF) U169
Производный штамма DH5a, содержащий плазмиду pHV33', AmpR, CmR, TcR
Производный штамма DH5a, содержащий плазмиду pHV33'iglC, AmpR, CmR, TcS
AmpR, CmR, sacB, mob, 3.0 п.о. область генома F. tularensis 15 с делецией в гене iglC
Фенотип в E. coli AmpR, CmR , TcR
Фенотип в E. coli AmpR, CmR, TcS 3.6 п.о. область генома F. tularensis 15 с геном iglC
«ГКПМ-Оболенск» Данная работа Данная работа Данная работа «ГКПМ-Оболенск» [11]
«ГКПМ-Оболенск» [7] «ГКПМ-Оболенск» [7] «ГКПМ-Оболенск» [13]
Данная работа Данная работа [7]
Данная работа Данная работа
кой питательной среде Лурия-Бертани (ЛБ) [3], при необходимости в присутствии антибиотиков (100 мкг/мл ампициллина или 20 мкг/мл хлорамфе-никола). Штаммы F tularensis выращивали при температуре 37 °С на плотной (FTA) и жидкой (FTB) питательной среде. Состав FTA: 3,8 % эритрит-агар,
1 % высушенная кровь крупного рогатого скота, 1 % глюкоза, 0,05 % цистеин, 0,0025 % тиамин хлорид, pH 7,2 (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск), Состав FTB [1]: 2 % ферментативный гидролизат казеина, 1 % дрожжевой экстракт, 1,2 % KH2PO4, 1 % глюкоза, 0,001 % цистеин, 0,001 % FeCl2, pH 7,2 (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск). При необходимости в среду добавляли 100 мкг/мл полимиксина B и 3 мкг/мл хло-рамфеникола.
Выделение ДНК. Выделение плазмидных ДНК из клеток E. coli проводили по методике, изложенной в работе [2]. Выделение ДНК из клеток F. tularensis выполняли, как описано ранее [8].
Межвидовая конъюгация. Перенос плазмид из клеток E. coli S17-1(pPVAiglC) в клетки F. tularensis проводили методом межвидового скрещивания, как описано ранее [7], с рядом модификаций. 50 мкл суспензии донорного штамма E. coli S17-1(pPVAiglC) (1-108 клеток) смешивали с 50 мкл реципиентного штамма F. tularensis (3-1010 клеток) и полученную смесь наносили пятнами на агар ЛБ. Скрещивание проводили при температуре 25 °С в течение 18 ч. Подросшую бактериальную культуру суспендировали в забуференном физиологическом растворе, pH 7,2 (ЗФР). Высев конъюгантов проводили на плотную питательную среду FTA, содержащую 100 мкг/мл по-лимиксина B для контрселекции донорного штамма
E. coli и 3 мкг/мл хлорамфеникола, и инкубировали при температуре 37 °С. Учет результатов проводили через 120 ч.
Аллельный обмен. Конъюгант F. tularensis с интегрированной плазмидой pPVAiglC суспендировали в
ЗФР до концентрации 5-109 м.к./мл, титровали с шагом 10 до седьмого разведения и высевали по 0,2 мл из каждого разведения на среду FTA, содержащую 100 мкг/мл полимиксина B и 5 % сахарозы. Чашки инкубировали при температуре 37 °С в течение 72 ч. Среди клонов с фенотипом SucR отбирали варианты с фенотипом CmSSucR на среде FTA, содержащей 100 мкг/мл полимиксина B и 5 % сахарозы. Методом ПЦР среди клонов CmSSucR отбирались варианты
F. tularensis с делецией в одном или двух генах iglC. Для проведения ПЦР использовали проверочные праймеры: 23CF - 5’-AAGGATAAGACCTGTCTG-3: и 23 CR - 5’-TTGAAACCATACCGGGTA-3\
Комплементация. Для комплементации гена iglC в мутантном штамме F. tularensis была создана плазмида pHV33'iglC, состоящая из вектора pHV33' (делеционное производное плазмиды pHV33 [4]) и ампликона, содержащего фланкированный ~1,5 т.п.о. участками хромосомной ДНК F. tularensis нативный ген iglC (629 п.о.). Ампликон размером 3558 п.о. был получен с помощью праймеров 23SalL15 и 23SalR15 на матрице штамма F. tularensis 15. Ампликон был встроен в Sali сайт плазмиды pHV33'. В результате электропорации плазмиды pHV33'iglC был получен штамм E. coli DH5a(pHV33'iglC).
Клоны, содержащие плазмиду, имели фенотип ApRCmRTcS. Препарат ДНК pHV33'iglC, выделенный из клеток E. coli, переносили методом электропорации [9] в клетки F. tularensis с целью аллельного замещения одного из делетированных генов iglC на интактный вариант.
Фагоцитоз. В работе использовали клетки линии J774A.1 (полученные из Российской Коллекции Клеточных Культур) и перитонеальные макрофаги, выделенные из мышей линии BALB/c. Макрофаги (J774A.1 или перитонеальные) вносили в 24-лу-ночные планшеты для клеточных культур (Costar) в концентрации 105 клеток в лунку и инкубировали в
полной питательной среде Dulbecco Eagle (10 % фетальной сыворотки теленка, 2 мМ глутамина), при температуре 37 °С, в атмосфере 5 % СО2 и 100 % влажности в течение 24 ч. Бактериальные суспензии F tularensis, мутантных и исходных штаммов, вносили в лунки c монослоем макрофагов в соотношении 100:1 и выдерживали при температуре 37 °С и 5 % CO2 в течение 2 ч. От внеклеточных бактерий освобождались, добавляя в культуральную среду 2 мкг/ мл гентамицина на 1 ч. Для определения количества бактерий, захваченных макрофагами, через 3 ч после внесения бактерий в лунки добавляли по 0,5 мл 0,05 % раствора дезоксихолата натрия, чтобы лизи-ровать макрофаги. Через 15 мин из лизатов делали высевы на среду FTA. Ту же операцию повторяли через 24 и 48 ч инкубирования бактерий с макрофагами. Подсчет числа живых клеток после посева проводили через 72 ч инкубации при температуре 37 °С. Эффективность размножения оценивали по десятичным логарифмам количества колоний, полученных при высеве лизатов макрофагов через 3, 24 и 48 ч после инфицирования штаммами F. tularensis.
Устойчивость к действию нормальной кроличьей сыворотки (НКС). Нормальную кроличью сыворотку получали по стандартной методике, разделяли на аликвоты и хранили при температуре -18 °С. Из свежей агаровой культуры готовили суспензию клеток в ЗФР, с использованием стандарта мутности (ОСО 42-28-85-2012 ФГБУ НЦЭСМП).
Микробные клетки вносили в неразведенную сыворотку до концентрации 2-106 м.к./мл (1/10 часть клеточной суспензии от конечного объема) и инкубировали при 37 °С в течение 24 ч. Концентрацию выживших клеток определяли высевом из соответствующих разведений на среду FTA, содержащую 100 мкг/мл полимиксина B.
Результаты и обсуждение
Ранее нами был разработан метод аллельного обмена в геноме туляремийного микроба [7]. Применение данного метода для делеции гена iglC в геноме F. tularensis LVS позволило не только получить варианты штамма F. tularensis LVS без гена iglC, но и показать, что в хромосоме штамма LVS содержатся две копии гена iglC [7]. Применение метода аллельного обмена позволило нам получить также два варианта штамма F. tularensis 15: F. tularensis 15/23-1 - с одной инактивированной копией гена iglC и F. tularensis 15/23-2 - двумя инактивированными копиями гена iglC. На присутствие двух копий гена iglC в штамме 15 указывает тот факт, что в штамме 15/23-1 ПЦР анализ с помощью проверочных праймеров 23CF и 23CR выявляет два ампликона размерами ~990 и ~450 п.о., тогда как в штамме 15/23-2 -только ампликон ~450 п.о. (рис. 1).
Для изучения влияния гена iglC на микробиологические и иммунологические свойства туляремий-ного микроба, нами была проведена комплементация
инактивированного гена iglC в штамме F. tularensis 15/23-2. Для этой цели была использована плазмида pHV33 'iglC, созданная на основе бактериального вектора pHV33'. Особенностью плазмиды pHV33' является то, что ее можно вводить в клетки туляремийного микроба методами криотрансформации или электропорации, но она крайне нестабильна в этих клетках, вероятно, из-за низкой скорости репликации. Частота интеграции плазмиды pHV33'iglC в хромосому штамма F. tularensis 15/23-2 при электропорации составляла 4-10-4 (4 клона на 104 трансформантов). Клоны с интегрированной плазмидой отличались от клонов с автономной плазмидой размером колоний и способностью к пересеву: единичные крупные колонии среди микроколоний, хорошо растущие при пересеве на среду с хлорамфенико-лом. Клоны с фенотипом CmR были проверены в ПЦР с использованием клонирующих праймеров 23SalL15 и 23SalR15. Комплементированные клоны давали синтез двух ампликонов размером 3,0 и 3,6 т.п.о., что соответствует наличию в геноме как делетированного, так и интактного вариантов гена iglC. Один из отобранных клонов был обозначен как штамм F. tularensis 15/23-2com. При электрофоретическом анализе в ПААГ-SDS геле лизатов клеток штамма F. tularensis 15/23-2-com выявлено усиление интенсивности окраски полосы, соответ-стующей по подвижности белку с молекулярной массой 23 кДа (т.е. молекулярной массе белка IglC) по сравнению с полосой штамма F. tularensis 15/23-
2 (данные не приведены).
При выращивании на плотной питательной среде FTA штаммов F. tularensis 15 и вариантов с одной и двумя делетированными копиями гена iglC видимых отличий в скорости роста и морфологии колоний отмечено не было. Также не были отмечены различия в динамике роста бактерий при культивировании на жидкой питательной среде FTB. Время удвоения клеток составляло около 2 ч и лимитировалось содержанием кислорода в культуральной среде.
Инактивация одной и двух копий гена iglC в геноме вакцинного штамма туляремийного микроба не изменила его способности сохранять жизнеспособность в НКС по сравнению с исходным штаммом, свидетельствуя о том, что внесенной мутацией не
12 3 4 5
Рис. 1. Электрофореграмма ампликонов, полученных с праймерами 23CL и 23CR и ДНК штаммов F. tularensis:
2 - F. tularensis 15; 3 - F. tularensis 15/231; 4 - F. tularensis 15/23-2; 1, 5 - маркер GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas, Литва)
Рис. 2. Влияние гена iglC F. tularensis на процесс фагоцитоза на моделях макрофагоподобных клеток линии J774.1A и перитонеальных макрофагах мышей линии BALB/c. Макрофаги инфицировались в соотношении 100:1, количество бактерий в макрофагах определялось через 3, 24 и 48 ч после инфицирования; результаты показаны как значение Lg КОЕ/мл ± доверительный интервал (р<0,05) по результатам трех независимых экспериментов
были затронуты молекулярные структуры, обеспечивающие устойчивость туляремийного микроба к бактерицидным свойствам сыворотки.
Поскольку в хромосоме штамма К. tularensis LVS были выявлены две копии iglC гена и было показано, что модифицированные штаммы LVS без одной и двух копий гена iglC по-разному размножались в макрофагах [7], то нам представлялось интересным изучить влияние данной мутации на способность штамма К tularensis 15 захватываться, выживать и размножаться в клетках линии J774.1A и перитонеальных макрофагах. С этой целью клеточные линии J774.1A и перитонеальные макрофаги были инфицированы штаммами К. tularensis 15, 15/23-1, 15/23-2 и 15/23-2сот и через 24 и 48 ч было определено количество живых микробных клеток, находящихся в макрофагах (рис. 2).
Данные диаграммы показывают, что вакцинный штамм без одной копии гена iglC размножался в клетках J774.1A в 8-10 раз хуже, чем исходный штамм. Инактивация обеих копий гена iglC в хромосоме К tularensis 15 привела к появлению варианта, неспособного к внутриклеточному размножению. Способность к внутриклеточному размножению варианта К. tularensis 15/23-2 с двумя инактивированными копиями iglC гена была частично восстановлена после введения комплементирующей плазмиды, что свидетельствует о важной роли гена iglC в процессе размножения в макрофагах (рис. 2).
Для перитонеальных макрофагов был характерен более активный захват бактериальных клеток по сравнению с макрофагоподобными клетками J774.1A, на что указывают результаты высевов бактерий из макрофагов через 3 ч после инфицирования (рис. 2). Скорость размножения штаммов К ШШ-гєшіи 15 и К. tularensis 15/23-1 в перитонеальных макрофагах через 24 и 48 ч практически не отличалась. Вакцинный штамм без генов iglC не размножался в
макрофагах.
Полученные данные подтверждают ранее сделанный вывод о важности гена iglC для внутрима-крофагального размножения штамма LVS и на примере вакцинного штамма F tularensis 15 НИИЭГ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Домотенко Л.В., Храмов М.В. Простая жидкая питательная среда для молекулярно-генетических исследований Francisella tularensis. Пробл. особо опасных инф. 2009; 4(102):66-7.
2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1984. 479 с.
3. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир; 1976. 440 с.
4. Ehrlich S.D. DNA cloning in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978; 75:1433-6.
5. Ellis J., Oyston P.C.F., Green M., Titball R.W. Tularemia. Clin. Microbiol. Rev. 2002; 15(4):631-46.
6. Golovliov I., Ericsson M., Sandström G., TärnvikA., Sjöstedt A. Identification of proteins of Francisella tularensis induced during growth in macrophages and cloning of the gene encoding a prominently induced 23-kilodalton protein. Infect Immun. 1997; 65(6):2183-9.
7. Golovliov I., Sjostedt A., Mokrievich A., Pavlov V. A method for allelic replacement in Francisella tularensis. FEMS Microbiol. Lett. 2003; 222:273-80.
8. Pavlov V.M., Mokrievich A.N., Volkovoy K. Cryptic plasmid pFNL10 from Francisella novicida-like F6168: The base of plasmid vectors for Francisella tularensis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996; 13:253-56.
9. Pomerantsev A.P., Golovliov I.R., Ohara Y., Mokrievich A.N., ObuchiM., Norqvist A., KuoppaK., Pavlov V.M. Genetic organization of the Francisella plasmid pFNL10. Plasmid. 2001; 46(3):210-22.
10. Rohmer L., Brittnacher M., Svensson K., Buckley D., Haugen E., Zhou Y., Chang J., Levy R., Hayden H., Forsman M., Olson M., Johansson A., Kaul R., Miller S.I. Potential Source of Francisella tularensis Live Vaccine Strain Attenuation Determined by Genome Comparison. Infect. Immun. 2006; 74(12):6895-906.
11. Simon R., Priefer U., Puhler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram-negative bacteria. Biotechnology. 1983; 1:784-91.
12. Sjöstedt A. Tularemia: history, epidemiology, pathogen physiology, and clinical manifestations. Ann. NY Acad. Sci. 2007; 1105:1-29.
13. Woodcock D.M., Crowther P.J., Doherty J., Jefferson S., DeCruz E., Noyer-Weidner M., Smith S.S., Michael M.Z., Graham M.W. Quantitative evaluation of Escherichia coli host strains for tolerance to cytosine methylation in plasmid and phage recombinants. Nucleic Acids Res. 1989; 17:3469-78.
References
1. Lapin A.A., Pavlov V.M., Mokrievich A.N., Domotenko L.V., Khramov M.V [Simple liquid nutrient medium for molecular-genetic investigations of Francisella tularensis]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2009; (102):66-7.
2. Maniatis T., FrichE., Sambruk G. [Methods of Genetic Engineering. Molecular Cloning]. M.: Mir; 1984. 479 p.
3. Miller D. [Experimentation in Molecular Genetics]. M.: Mir; 1976.
440 p.
4. Ehrlich S.D. DNA cloning in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978; 75:1433-6.
5. Ellis J., Oyston P.C.F., Green M., Titball R.W. Tularemia. Clin. Microbiol. Rev. 2002; 15(4):631-46.
6. Golovliov I., Ericsson M., Sandström G., Tärnvik A., Sjöstedt A. Identification of proteins of Francisella tularensis induced during growth in macrophages and cloning of the gene encoding a prominently induced 23-ki-lodalton protein. Infect Immun. 1997; 65(6):2183-9.
7. Golovliov I., Sjostedt A., Mokrievich A., Pavlov V A method for allelic replacement in Francisella tularensis. FEMS Microbiol. Lett. 2003; 222:273-80.
8. Pavlov V.M., Mokrievich A.N., Volkovoy K. Cryptic plasmid pFNL10 from Francisella novicida-like F6168: The base of plasmid vectors for Francisella tularensis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996; 13:253-56.
9. Pomerantsev A.P., Golovliov I.R., Ohara Y., Mokrievich A.N., Obuchi M., Norqvist A., Kuoppa K., Pavlov VM. Genetic organization of the Francisella plasmid pFNL10. Plasmid. 2001; 46(3):210-22.
10. Rohmer L., Brittnacher M., Svensson K., Buckley D., Haugen E., Zhou Y., Chang J., Levy R., Hayden H., Forsman M., Olson M., Johansson A., Kaul R., Miller S.I. Potential Source of Francisella tularensis Live Vaccine Strain Attenuation Determined by Genome Comparison. Infect. Immun. 2006;
74(12):6895-906.
11. Simon R., Priefer U., Puhler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gramnegative bacteria. Biotechnology. 1983; 1:784-91.
12. Sjöstedt A. Tularemia: history, epidemiology, pathogen physiology, and clinical manifestations. Ann. NY Acad. Sci. 2007; 1105:1-29.
13. Woodcock DM., Crowther P.J., Doherty J., Jefferson S., DeCruz E., Noyer-WeidnerM., Smith S.S., MichaelM.Z., Graham M.W. Quantitative evaluation of Escherichia coli host strains for tolerance to cytosine methylation in plasmid and phage recombinants. Nucleic Acids Res. 1989; 17:3469-78.
Authors:
Mokrievich A.N., Vakhrameeva GM., Mironova R.I., Kombarova T.I., Titareva G.M., Kravchenko T.B., Bakhteeva I.V., Dyatlov I.A., Pavlov VM. State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology. Obolensk, Moscow Region, 142279, Russian Federation. E-mail: info@obolensk.org
Об авторах:
Мокриевич А.Н., Вахрамеева ГМ., Миронова Р.И., Комбарова Т.И., Титарева ГМ., Кравченко Т.Б., Бахтеева И.В., Дятлов И.А., Павлов ВМ. Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. Российская Федерация, 142279, Московская обл., п. Оболенск. E-mail: info@obolensk.org
Поступила 03.06.13.
