CC BY
15
УДК 616.981.455:615.371/.372
А.А.Лапин, А.Н.Мокриевич, Г.М.Вахрамеева, Т.И.Комбарова, И.В.Бахтеева,
И.А.Дятлов, В.М.Павлов
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММА РГАПС&ЕНА TULARENSIS 15/10
С ДЕЛЕТИРОВАННЫМ ГЕНОМ ГЕСА
ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Оболенск
Делеция гена гесА в геноме Francisella tularensis 15/10 приводит к повышению чувствительности к ультрафиолетовому облучению, снижению способности к гомологичной рекомбинации, незначительному снижению вирулентности для мышей. Эффективность размножения штамма Francisella tularensis 15/10Дrea4 в макрофагоподобных клетках, устойчивость к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки и протективные свойства на мышиной модели туляремии не изменились по сравнению с штаммом Francisella tularensis 15/10.
Ключевые слова: туляремийный вакцинный штамм, ген гесА, рекомбинация, протективные свойства.
A.A.Lapin, A.N.Mokrievich, G.M.Vakhrameeva, T.LKombarova, LV.Bakhteeva, I.A.Dyatlov, V.M.Pavlov Immunobiological Properties of Francisella tularensis 15/10 Strain with Deleted recA Gene
State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk
Deletion of recA gene in Francisella tularensis 15/10 genome leads to the increase in its sensitivity to ultraviolet irradiation, reduction of the homologous recombination capacity, and a slight decline of virulence for mice. Efficacy of Francisella tularensis 15/10ArecA reproduction within microphage-like cells, its resistance to normal rabbit serum, and protective properties on the mouse model of tularemia are the same as in original Francisella tularensis 15/10.
Key words: tularemia vaccine strain, recA gene, recombination, protective properties.
Для профилактики туляремии в РФ используется живая вакцина, созданная на основе штамма F. tularensis 15/10. Анализ нуклеотидной последовательности генома штамма F. tularensis LVS [10], производного штамма F. tularensis 15/10, показал наличие recA-подобного гена [http://www.ncbi.nlm. nih.gov/ genome?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermT oSearch=19299]. Но функциональная роль этого гена для туляремийного микроба остается невыясненной. Ранее для близкородственного микроорганизма F. tularensis subsp. novicida было показано, что удаление recA -подобного гена приводит к повышению чувствительности к ультрафиолетовому облучению и воздействию алкилирующих агентов [5], но отсутствовали данные о влиянии этой мутации на гомологичную рекомбинацию и иммунобиологические свойства. Известно, что инактивация белка RecA в вакцинном штамме Micobacterium bovis BCG привела к стабилизации вакцинных свойств [7]. Поэтому представляет определенный интерес изучение иммунобиологических свойств F. tularensis 15/10 без recA-подобного гена.
Материалы и методы
Штаммы и плазмиды, использованные в работе, представлены в таблице.
Штамм Francisella tularensis 15/10ArecA получен методом аллельного обмена, описанным ранее [6].
Культивирование штаммов F. tularensis проводили при температуре 37 °С на среде FT-агар (ФГУН ГНЦ ПМБ) и жидкой питательной среде (FTB) [2],
при необходимости в питательные среды добавляли антибиотики полимиксин В (Pm) 100 мкг/мл, хло-рамфеникол (Cm) 3 мкг/мл. Культивирование штаммов E. coli проводили на питательной среде Лурия-Бертани (LB) [8] при температуре 37 °С с добавлением соответствующих антибиотиков Cm 10 мкг/мл, Ap 100 мкг/мл.
Для приготовления клеточных бактериальных суспензий использовали забуференный физиологический раствор (ЗФР), pH 7,2. Стандартные генноинженерные манипуляции проводили как описано [3]. Для определения чувствительности к перекиси водорода (Н2О2) использовался диско-диффузион-ный метод с диаметром дисков 5 мм. Определение чувствительности к УФ-облучению проводили, используя UV-облучатель с длиной волны 254 нм, «Cole Parmer», США.
Линию мышиных макрофагоподобных клеток J774.A1 культивировали в пластиковых флаконах и планшетах для культур тканей (Corning Costar, США) в концентрации 3—9^105 м.к./мл в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM, Gibco, США) с добавлением 10 % инактивированной фетальной сыворотки теленка, 2 мМ L-глутамина и 0,2 % бикарбоната натрия при температуре 37 °С и концентрации углекислого газа 5 % в ^^инкубаторе (Sanyo, США).
Нормальная кроличья сыворотка (НКС) была получена от кроликов породы шиншилла. Оценку устойчивости к НКС туляремийных штаммов проводили по выживаемости бактерий в НКС после инкубирования бактериальной суспензии в концентрации Ы06 КОЕ/мл при температуре 37 °С в течение 24 ч.
Штаммы и плазмиды
Название
Характеристика
Источник или ссылка
E. coli DH5a E. coli Si7-i
E. coli S17-1(pHV33-mob)
E. coli S17-i(pHV33-mob/recA) Francisella tularensis 15/10
F supE44 AlacUl69 (ф8GІаcZДMІ5)hsdRІ7 (rk-mk- ) recA l 9 endAl gyr A96 thi-I el Al
thi, thr, leu, tonA, lacy, supE, recA: :RP4-2-Tc: :Mu, Kn: :Tn7 E. coli Si7-i с плазмидой pHV33-mob
E. coli Si7-i с плазмидой pHV33-mob/recA Pmr, прототип вакцинного штамма
Francisella tularensis i5/iGArecA F tularensis 15/10 с инактивированным геном recA
Francisella tularensis 15/10ArecA(pHV33-mob/recA)
E. coli S17-i(pPV/AiglC) pPV/AiglC
F tularensis 15/10 с инактивированным геном recA, несущий плазмиду pHV33-mob/recA, содержащую регион хромосомной ДНК с нативным геном recA
E. coli S17-1 с плазмидой pPV/AiglC
Ampr, Cmr, sacB, mob содержит фрагмент хромосомы
F. tularensis 15/1G с инактивированным геном iglC
[13]
[11]
[6]
Данная работа
Государственная коллекция микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск»
Государственная коллекция микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск»
Данная работа
[6]
[6]
pHV33-mob
pHV33-mob/recA
Ampr, Cmr, Tcs
Ampr, Cmr, Tcs, содержит регион хромосомной ДНК
F. tularensis 15/1G с нативным геном recA
[б]
Данная работа
В работе использовали мышей линии BALB/c. OпределениеLD50 проводилисогласнометодуКербера в модификации И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева [1]. Мышей линии BALB/c (по 5 в группе, самцы и самки, возраст 6-8 недель, массой 18-2G г) инфицировали подкожно бактериальной суспензией в дозах Ы01, 1-Ю2, Ы0З и Ы04 КOЕ/мышь и наблюдали в течение 30 дней. Oпределение протективности проводили аналогично определению LD50, по прошествии 3G дней, мышам вводили подкожно культуру F. tularensis 503 в дозе Ы0З КOЕ/мышь (DCl штамма F. tularensis 503 для мышей линии BALB/c равна 1 ШЕ).
Ампликон размером 4009 п.о. с геном recA был получен c праймерами FSA 5'-AAAGTCGACCTG GTGGTTTGATGGTT-3' и RSA 5'-AAAGTCGACTAC CATTCTCAAGGTACT-3' на матрице ДНК клеток штамма F. tularensis i5/iG.
Плазмида pHV33-mob/recA была получена в результате встраивания в плазмиду pHV33-mob по сайту рестрикции Sall ампликона с геном recA. Селекцию клонов E. coli DH5a с плазмидой pHV33-mob/recA проводили на среде с ампициллином с последующим ПЦР-анализом с праймерами FSA, RSA.
Мобилизационный перенос плазмид из клеток
E. coli S17-1 в клетки F. tularensis проводили как описано [б].
Результаты и обсуждение
Делеция гена recA не повлияла на культуральноморфологические свойства штамма при выращивании на плотных и жидких питательных средах. После 48 часов инкубации на FT-агаре вырастали колонии диаметром 2 мм с характерной для культур вакцинного штамма туляремийного микроба формой и цветом.
Время удвоения оптической плотности культуры на среде FTB равнялось двум часам.
В мышиных макрофагоподобных клетках линии J774.A1 количество клеток F. tularensis 15/iGArecA увеличилось за 2i ч в 44 раза, что не отличалось от данных для клеток штамма F. tularensis 15/10.
Клетки штамма F. tularensis 15/iGArecA обладают повышенной чувствительностью к УФ-облучению по сравнению с исходным штаммом F. tularensis 15/10 (рисунок). Введение плазмиды pHV33-mob/ recA с геном recA в клетки F. tularensis 15/iGArecA полностью восстанавливает устойчивость бактерий к УФ-облучению.
”1
4
з -2 -1 -
0 -I---------------т--------------Т---------------Т----------------1
0 50 100 150 200
Доза облучения, ч
^^-F. tularensis 15/10,
- F. tularensis 15/10 RecA-,
- F. tularensis 15/10 RecA- с pHV33/RecA+,
—- F. tularensis 15/10 RecA- с pHV33
Устойчивость штаммов F. tularensis 15/10 к УФ-облучению
Чувствительность бактерий штамма F. tularen-sis 15/10 ArecA к бактерицидному действию перекиси водорода (Н2О2) сравнима с таковой для клеток F. tularensis 15/10. Для концентраций перекиси водорода 1 % зона подавления составляла 0,9 см. Бактерицидная активность НКС для штаммов F. tularensis 15/10ArecA и F. tularensis 15/10 была практически одинакова и составила 10 % выживаемости. Эффективность переноса плазмиды pHV33-mob в штамм F. tularensis 15/10ArecA сопоставима с таковой родительского штамма F. tularensis 15/10.
Процесс гомологичной рекомбинации изучался с использованием плазмиды pPV/AiglC, несущей последовательность, гомологичную хромосомной ДНК F. tularensis 15/10. Частота интеграции pPV/AiglC в хромосомную ДНК штамма F. tularensis 15/10 составляла 10-7, тогда как для F. tularensis 15/10ArecA клоны с интегрированной плазмидой не получены, т.е. частота интеграции составляла менее 10-9. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что делеция recA гена приводит к репрессии механизма рекомбинации.
Удаление гена recA из клеток F. tularensis 15/10 привело к десятикратному снижению остаточной вирулентности по сравнению со штаммом F. tularensis 15/10. LD50 штамма F. tularensis 15/10ArecA составила 5,0-103 КОЕ.
Мыши линии BALB/c, иммунизированные клетками штамма F. tularensis 15/10ArecA в дозе 1-101, 1-102, 1-103 и Ы04 КОЕ/мышь, были устойчивы к заражению в дозе 1-103 КОЕ/мышь штамма
F. tularensis 503.
Таким образом, изучение иммунобиологических свойств полученного штамма F. tularensis 15/10ArecA сравнительно со штаммом исходного типа показало одинаковые культурально-морфологические свойства и повышение чувствительности к ультрафиолетовому облучению. Данное наблюдение совпадает с результатами работы [5] и, возможно, говорит об участии гена recA в репарации повреждений хромосомы, вызванных УФ-облучением. Полученные данные об отсутствии влияния мутации гена recA у клеток F. tularensis на чувствительность к H2O2 не отличают туля-ремийный микроб от Brucella abortus [9]. Мутантный штамм сохранил свойство выживать в нормальной кроличьей сыворотке [4] и не утратил способности к размножению в макрофагоподобных клетках J774. A1, что важно для формирования в организме хозяина клеточного иммунитета [12]. Аттенуирование на порядок при сохранении протективных свойств можно рассматривать как положительный признак для живой вакцины, а существенное снижение способности к гомологичной рекомбинации позволяет говорить о стабилизации полезных качеств штамма.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз; 1962. 58 с.
2. Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Домотенко Л.В., Храмов М.В. Простая жидкая питательная среда для молекулярно-генетических исследований Francisella tularensis. Пробл. особо опасных инф. 2009; 4(102):66-7.
3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1964. 479 с.
4. Мокриевич А.Н., Кондакова А.Н., Валаде Э., Платонов М.Е., Вахрамеева М.Е., Шайхутдинова Р.З., Миронова Р.И., Блаха Д., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Кравченко Т.Б., Комбарова Т.И., Видаль Д., Павлов В.М., Линднер Б., Дятлов И.А., Книрель Ю.А. Биологические свойства и строение липополисахарида вакцинного штамма Francisella tularensis, полученного при инактивации гена «чувства кворума» qseC. Биохимия. 2010; 75(4):539-48.
5. Berg J.M., Mdluli K.E., Nano F.E. Molecular Cloning of the recA Gene and Construction of a recA Strain of Francisella novicida. Infect. and immun. 1992; 60(2): 690-3.
6. Golovliov I., Sjostedt A., Mokrievich A., Pavlov V. A method for allelic replacement in Francisella tularensis. FEMS Microbiol. Lett. 2003; 222:273-80.
7. Keller M., Boettger E.C., Sande P. Tuberculosis vaccine strain Mycobacterium bovis BCG Russia is a natural recA mutant. BMC Microbiol. 2008; 8:120.
8. Miller J.H. Experiments in Molecular Genetics. N.Y: Gold Harbor Laboratory. 1972. 436 р.
9. Roux C.M., Booth N.J., Bellaire B.H., Gee J.M., Roop R.M. II, KovachM.E., TsolisR.M., ElzerP.H., EnnisD.G. RecA and RadA Proteins of Brucella abortus Do Not Perform Overlapping Protective DNA Repair Functions following Oxidative Burst J. Bacteriol. 2006; 188(14):5187-95.
10. Sandstrom G. The tularemia vaccine. J. Chem. Tech. Biotech. 1994; 59:315-20.
11. Simon R., Priefer U., Puhler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram-negative bacteria. Biotechnology. 1983; 1:784-91.
12. Sjostedt A., Sandstrom G., Tarnvik A., Jaurin B. Nucleotide sequence and T-cell epitopes of a membrane protein of Francisella tularensis. J. Immunol. 1990; 145:311-7.
13. Woodcock D.M., Crowther P.J., Doherty J., Jefferson S., DeCruz E., Noyer-Weidner M., Smith S.S., Michael M.Z., Graham M.W. Quantitative evaluation of Escherichia coli host strains for tolerance to cytosine methylation in plasmid and phage recombinants. Nucleic Acids Res. 1989; 17:3469-78.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1.AshmarinI.P., Vorob’evA.A. [Statistical Methods in Microbiological Investigations]. L.: Medgiz; 1962. 58 p.
2. Lapin A.A., Pavlov VM., Mokrievich A.N., Domotenko L.V., Khramov M.V [Simple liquid nutrient medium for molecular genetic investigations of Francisella tularensis]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2009; 4(102):66-7.
3. Maniatis T., FrichE., SembrukG. [Methods of Genetic Engineering. Molecular Cloning.]. M.: Mir; 1964. 479 p.
4. Mokrievich A.N., Kondakova A.N., Valade E., Platonov M.E., VakhrameevaM.E., ShaikhutdinovaR.Z., MironovaR.I., BlakhaD., Bakhteeva I.V., Titareva G.M., Kravchenko T.B., Kombarova T.I., Vidal’D., Pavlov VM., Lindner B., Dyatlov I.A., Knirel’ Yu.A. [Biological properties and lipopoly-saccharide structural organization of Francisella tularensis vaccine strain obtained after qseC gene inactivation]. Biokhimiya. 2010; 75(4):539-48.
Authors:
Lapin A.A., Mokrievich A.N., Vakhrameeva G.M., Kombarova T.I., Bakhteeva I.V., Dyatlov I.A., Pavlov V.M. State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology. Obolensk, Moscow Region, 142279, Russia. E-mail: info@obolensk.org
Об авторах:
Лапин А.А., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Комбарова Т.И., Бахтеева И.В., Дятлов И.А., Павлов В.М. Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. 142279, Оболенск, Московская обл. E-mail: info@obolensk.org
Поступила 04.07.11.
