CC BY
29
15. Demidova T.N., Gorlenko V.V., Meshcheryakova I.S. Analysis of the incidence of tularemia in the Arkhangelsk region. Dal'nevostochnyj zhurnal infekcionnoj patologii. [Far East journal of infectious pathology]. 2014; 25: 60 - 62 (in Russian).
16. Demidova T.N., Meshcheryakova I.S. the current situation on tularemia in the North-West Federal district of the Russian Federation. Infekcionnije bolezni. [Infectious diseases].. Moscow. 2015: 106 (in Russian).
17. Methodical instructions MI 3.1.2007-05. Moscow. Rospotrebnadzor. 2005: 59 (in Russian).
Биологические свойства штамма Francisella ^^^пз^ 15 НИИЭГ со сниженной экспрессией гена sodB, кодирующего железозависимую супероксиддисмутазу
М.А. Сотникова (marik_suharikelf@mail.ru), Т.Б. Кравченко, И.В. Бахтеева, Р.И. Миронова, Т.И. Комбарова (kombarova.tatyana@yandex.ru), А.Н. Мокриевич (mokrievich@obolensk.org), В.М. Павлов
ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», г. Оболенск
Резюме
Ранее нами было показано, что замена в гене sodB штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ нуклеотидов в стартовом кодоне и кодоне, кодирующем лейцин, приводила к снижению количества фермента железозависимой супероксиддисмутазы (FeSOD) в делящихся бактериальных клетках и повышению чувствительности бактерий к окислительному стрессу.
В данной работе на мышиной модели экспериментальной туляремии была оценена эффективность иммунного ответа, формируемого мутантным штаммом F. tularensis 15/sodBII, при заражении вирулентным штаммом F. tularensis Schu S4. Показано, что степень защиты, оцениваемая по обсемененности печени и селезенки инфицированных животных, была значительно более выражена у мышей, вакцинированных мутантным штаммом, в отличие от родительского, что позволяет рассматривать модифицированный штамм F. tularensis 15/sodBII в качестве перспективного кандидата для создания новой туляремийной вакцины. Ключевые слова: туляремия, вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ, Fe-супероксиддисмутаза, протективный иммунитет
The Biological Properties of the Strain Francisella tularensis 15 NIIEG with Decreased Gene Expression sodB, Encoding Fe-Dependent Superoxide Dismutase
M.A. Sotnikova (marik_suharikelf@mail.ru), T.B. Kravchenko, I.V. Bakhteeva, R.I. Mironova,
T.I. Kombarova (kombarova.tatyana@yandex.ru), A.N. Mokrievich (mokrievich@obolensk.org), V.M. Pavlov
State Research Scientific Center for Applied Microbiology and Biotechnology
142279, Moscow reg., Serpukhov dist., Obolensk, info@obolensk.org +7(4967)36-00-10
Abstract
Relevance. Superoxide anion has bactericidal properties and is also an important inducer of proinflammatory cytokines in macrophages. We have created F. tularensis 15/sodBII strain with transiently decreased FeSOD synthesis level and more sensitive to oxidative stress. So we suggest that the modified vaccine strain have lower reactogenicity.
Goal. Studying of effect of sodB gene expression modulation on biological properties of vaccine F. tularensis strain 15 NIIEG. Materials and methods. F. tularensis survival in macrophage-like cell line J774.1A and in spleen and liver of infected mice were analyzed through colony-forming unit enumeration. Strains reactogenicity was assessed by the dynamics of change in weight of infected mice. Efficacy of immune response generated by mutant strain of F. tularensis 15/sodBII was estimated with virulent F. tularensis strain Schu S4 infection in the BALB/c mice model.
Results. Degree of protection was significantly more pronounced in the mice vaccinated with the strain F. tularensis with decreased sodB gene expression in comparison with parental F. tularensis strain NIIEG 15.
Conclusions. The modified strain of F. tularensis 15/sodBII may be consider as a promising variant for development of a new tularemia vaccine with reduced reactogenicity.
Key words: tularemia, vaccine strain Francisella tularensis 15 NIIEG, Fe-superoxide dismutase, protective immunity
Ф
Введение
Туляремия - зооантропонозная инфекция, возбудителем которой является бактерии Francisella tularensis. Природный резервуар возбудителя -мелкие грызуны и лагоморфы. Передача возбудителя человеку происходит через кровососущих насекомых, клещей и инфицированную воду [1].
Для профилактики туляремии в России и ряде стран СНГ используется живая туляремийная вакцина, созданная на основе штамма F. tularensis 15 НИИЭГ [2]. Данный вакцинный штамм авиру-лентен для людей, кроликов и морских свинок, но вирулентен для мышей [1]. Среди ферментов туляремийного микроба жизненно важную роль играет железозависимая супероксиддисмутаза (FeSOD), инактивирующая токсичный супероксид анион [3, 4]. Этот анион может возникать как в процессе окислительного взрыва при фагоцитозе бактерий клетками макроорганизма, так и в процессе жизнедеятельности самого микроорганизма [5], в частности, в результате переноса электрона с Fe+2 на молекулу кислорода (реакции Фентона). Снижение количества этого фермента в бактериальной клетке приводит, с одной стороны, к уменьшению скорости инактивации супероксид аниона, с другой стороны, к увеличению количества свободных ионов железа, вызывающего увеличение продукции супероксид аниона. Повышение количества супероксид аниона в клетке оказывает негативное влияние на микробную клетку, приводя к повреждению бактериальных структур, что, в свою очередь, индуцирует повышенный синтез белков теплового шока [4].
Ранее нами было показано, что в гене sodB, кодирующем фермент FeSOD вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, замены нуклеотидов в стартовом и ближайшем к нему кодоне, кодирующем лейцин, приводит к 50% снижению супероксиддис-мутазной активности бактерий, находящихся в логарифмической фазе роста, и повышению чувствительности полученного модифицированного штамма F. tularensis ^^ЙВИ к окислительному стрессу [6].
Цель работы - определить с использованием мышиной модели экспериментальной туляремии влияние модификации гена sodB на иммуногенность и протективность штамма F. tularensis ^^ЙВИ.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы и плазмиды. В работе использовали следующие бактериальные штаммы из государственной коллекции «ГКПМ-Оболенск»: вакцинный штамм F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ, его модифицированный вариант F. tularensis 15/sodBИ со сниженной активностью FeSOD [6], тест-заражающий штамм F. tularensis subsp. tularensis Sсhu.
Клеточные линии. Мышиная макрофагоподоб-ная клеточная линия J774.1A получена из Российской коллекции культур клеток позвоночных Института цитологии РАН.
Среды и условия культивирования. Штаммы F. tularensis культивировали при температуре 37 °С на плотной питательной среде FT-агар производства ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия) с добавлением антибиотика полимиксина B до 100 мкг/мл.
Линию клеток J774.1A культивировали в среде DMEM (Gibco, США) с добавлением 10% инакти-вированной фетальной сыворотки теленка, 2 мМ L-глутамина и 0,2% бикарбоната натрия при 37 °С и 5% СО2 в С02-инкубаторе (Sanyo, США). Клетки выращивали в пластиковых флаконах и 24-луноч-ных планшетах для культур тканей (Corning Costar, США).
Животные. В экспериментах использовали ин-бредных мышей линии BALB/c (ФИБХ Питомник «Пущино», МО, г. Пущино). Вес мышей составлял 18 - 20 г, возраст - 6 - 8 недель. Содержание и манипуляции с животными проводили в соответствии с методическими рекомендациями: «Использование современных средств содержания животных» (ФБУН «ГНЦ ПМБ» № 7 от 11.09.2013 г.); «Порядок работы с СПФ животными в современных исследованиях» (ФБУН ГНЦ ПМБ № 7 от 11.09.2013 г.) и с соблюдением требований санитарных правил: СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патоген-ности (опасности)», Москва, 2003; СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III -IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных инфекций», Москва, 2008.
Размножение F. tularensis в клетках линии J774.1A. Для экспериментов клетки снимали с пластиковой подложки флакона с 0,25%-м раствором трипсина в растворе Версена (ПанЭКО, Россия) и в концентрации 1 - 4 х 105 кл/мл помещали в планшет по 1 мл в лунку. Клетки инкубировали 24 ч для кондиционирования и формирования монослоя в атмосфере 5% СО2 при температуре 37 °С.
Суспензию бактериальных клеток в концентрации 5 х 108 КОЕ/мл вносили в лунки планшета с монослоем клеток J774.1A из расчета 100 бактериальных клеток на 1 макрофаг. Бактерии инкубировали с клетками J774.1 в атмосфере 5% СО2 при 37 °С в течение 3 ч. После инкубации монослой отмывали от нефагоцитированных бактерий забуференным физиологическим раствором (ЗФР) троекратно. Затем клетки J774.1A инкубировали в течение 24 часов для внутриклеточного размножения F. tularensis.
Определение количества живых бактерий в макрофагах проводили методом высевов. Для этого клеточный монослой через 3 или 24 ч после инфицирования лизировали добавлением 0,5мл дистиллированной воды в лунку и делали высевы десятикратных серийных разведений клеточного лизата на чашки с FT-агаром. Подсчет количества колоний проводили через трое суток роста.
#
Заражение мышей штаммами F. tularensis. Ночную агаровую культуру F. tularensis суспендировали в ЗФР до концентрации 5 х 109 КОЕ/мл по стандарту мутности (ОСО 42-28-85-2012 ФГБУ «НЦЭСМП») и готовили ряд десятикратных разведений в ЗФР.
Мышам вводили бактериальную суспензию из соответствующего разведения внутрикожно в область хвоста по 0,1мл. За животными наблюдали в течение 21 суток. Величины LD50 штаммов рассчитывали по формуле G. КегЬег в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [7].
Определение обсемененности органов. У 3-х мышей из каждой экспериментальной группы после эвтаназии ингаляцией СО2 проводили забор селезенки и печени. Органы гомогенизировали в ЗФР, делали высевы из десятикратных разведений гомогенатов на чашки с FT-агар по 0,2 мл. Подсчет колоний на агаре проводили через 72 ч инкубации чашек при 37 °С.
Определение веса мышей. Взвешивание животных проводили на электронных весах Scout ProSPU («Ohaus», США) с точностью измерения 0,1 г. Мышей взвешивали группами в одно и то же время суток.
Оценка титра специфических антител к антигенам F. tularensis. Пробы крови для получения сывороток отбирали у мышей на 28 сутки после иммунизации. Титр антител к туляремийным антигенам определяли методом твердофазного имму-ноферментного анализа (ИФА) [8].
Оценка протективности штаммов F. tularensis. Мыши (по 6 животных в группе) были иммунизированы внутрикожно введением бактериальных суспензий штаммов F. tularensis 15 НИ-ИЭГ и F. tularensis 15/sodBII в объеме 0,1 мл. На 28 сутки после иммунизации иммунных и контрольных животных заражали штаммом F. tularensis Schu подкожно в паховую область дозой 3х103 КОЕ/мышь (3000 DCL) в объеме 0,2 мл
суспензии. За экспериментальными животными наблюдали в течение 21 суток.
Статистическая обработка. Данные анализировали с помощью программного обеспечения Microsoft Office Excel.
Результаты и обсуждение
Способность размножаться в фагоцитах является необходимым свойством вакцинного штамма туляремийного микроба. Изучаемый штамм F. tularensis 15/sodBII захватывался клетками ма-крофагоподобной линии J774.1A с той же эффективностью, что и штамм F. tularensis 15 НИИЭГ. Через 24 часа наблюдали внутриклеточное размножение бактерий обоих штаммов, однако количество высеваемых бактерий штамма F. tularensis 15/sodBII было в 2 раза меньше, чем штамма F. tularensis 15 НИИЭГ (рис. 1).
Полученные данные показывают, что снижение уровня экспрессии гена sodB в штамме F. tularensis 15/sodBII не влияет на захват макрофагами модифицированных бактерий, но замедляет их внутриклеточное размножение в 2 раза.
Известно, что вакцинный штамм 15 НИИЭГ обладает умеренной вирулентностью для мышей [1]. Сравнение вирулентности штамма F. tularensis 15/ sodBII и родительского вакцинного штамма показало, что изучаемый штамм менее вирулентен (табл. 1).
Данные таблицы показывают, что подавление трансляционной активности с мРНК гена sodB штамма F. tularensis 15/sodBII, приводящее к уменьшению количества синтезируемого фермента SOD, снижает вирулентность модифицированного штамма, по сравнению с родительским приблизительно в 10 раз. Полученные данные соотносятся с результатами по размножению бактерий в макрофагах. Модифицированный штамм оказался менее способен к размножению в макрофагах в результате большей восприимчивости к действию
Рисунок 1.
Эффективность захвата и размножения штаммов F. tularensis в клетках мышиной макрофагоподобной линии Л74
Таблица 1.
Вирулентность штаммов F. tularensis 15/sodBII и 15 НИИЭГ для мышей линии BALB/c при внутрикожном введении
Мыши BALB/c Доза заражения, КОЕ/животное Число павших животных/общее количество Средние сроки гибели животных, сутки Значение LD50, КОЕ
F. tularensis 15 НИИЭГ 10 100 1000 0/5 3/5 5/5 9,3 8,6 52 (13 + 206)
F. tularensis 15/sodBII 16 160 1600 16 000 0 1/6 5/6 6/6 8,0 8,4 6,2 506 (127 + 2014)
агрессивной внутримакрофагальной среды, что обусловило снижение его вирулентности для мышей по сравнению с родительским штаммом.
Ранее было показано, что при сублетальных дозах заражения мышей линии BALB/c вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ в организме животных в течение первых 7-и суток происходит размножение туляремийного микроба, а затем, по мере формирования иммунного ответа, количество бактерий в организме снижается к 21-м суткам [9]. Нами была проведена сравнительная оценка динамики обсемененности печени и селезенки мышей после заражения изучаемыми штаммами. Данные по высевам бактерий из органов приведены на рисунке 2.
На рисунке 2 видно, что снижение количества синтезируемого фермента FeSOD в бактериальных клетках модифицированного штамма F. tularensis 15^ойВИ в некоторой степени приводило к снижению способности бактерий к размножению в исследуемых органах, что следует из уменьшения обсемененности органов на всех этапах формирования иммунного ответа по сравнению с вакцинным штаммом.
Одним из интегральных показателей реактоген-ности вакцинных штаммов является динамика изменения веса экспериментальных животных после введения изучаемого штамма [9]. Сравнение изменения веса мышей, инфицированных штаммами F. tularensis 15^ойВП и F. tularensis 15 НИИЭГ, не выявило существенных отличий, но у мышей, иммунизированных штаммом F. tularensis 15^ойВП наблюдалось более медленное восстановление веса (рис. 3). Тем не менее, к 15 дню после иммунизации средний вес мышей в обеих экспериментальных группах был одинаковым.
Сравнение титра специфических антител у групп мышей, иммунизированных штаммом F. tularensis 15^ойВИ и туляремийным вакцинным штаммом в дозах 80 КОЕ и 160 КОЕ соответственно, показало двукратное снижение титра при введении F. tularensis 15^ойВП (1/80 по сравнению 1/160 для F. tularensis 15 НИИЭГ). Возможной причиной такого отличия является меньшая обсемененность органов экспериментальных животных, иммунизированных штаммом F. tularensis 15^ойВП.
Для сравнительного изучения эффективности протективного иммунитета мышей, иммунизирован-
Рисунок 2.
Динамика обсемененности органов иммунных мышей.
Доза иммунизации для F. tularensis 15/sodBII - 145 КОЕ/мышь, для F. tularensis 15 НИИЭГ - 80 КОЕ/мышь
#
Рисунок 3.
Динамика изменения веса мышей линии BALB/c, иммунизированных штаммами F. tularensis, по отношению к весу перед иммунизацией (%).
Доза иммунизации штаммами F. tularensis 15 НИИЭГ и F. tularensis 15/sodBII - 100 КОЕ/мышь
Контроль Р tularensis 15 НИИЭГ Р tularensis 15/вос(ВИ
Время, сутки
со о
ных штаммами F. tularensis 15^ойВИ и F. tularensis 15 НИИЭГ, был использован высоковирулентный штамм F. tularensis Sсhu. Заражение проводили через 28 дней после иммунизации. В течение времени наблюдения (21 день) мыши в экспериментальных иммунных группах оставались живыми, что указывало на наличие напряженного протек-тивного иммунитета как у мышей, иммунизированных родительским вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ, так и у мышей, иммунизированных модифицированным штаммом F. tularensis 15^ойВП. Контрольные неиммунные мыши погибли на 4 сутки после заражения.
Для получения более полной картины реакции иммунных мышей на заражение определяли вес мышей в течение 15 дней. Анализ изменения веса мышей после заражения показал, что у иммунных мышей развитие инфекционного процесса сопрово-
ждалось снижением веса, который уже на 3 - 4 сутки после инфицирования во всех группах достигал наименьшего значения (рис. 4).
В группе животных, иммунизированных штаммом F. tularensis 15^ойВИ, вес снижался на 4% по отношению к началу инфекционного процесса, тогда как в группе, иммунизированной штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ, снижение веса было более выражено и достигало 9%. К 15 суткам вес животных в группе, иммунизированной F. tularensis 15/ sоdBN, вернулся к исходным значениям, а в группе, иммунизированной штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ, вес животных был все еще меньше исходного. Полученные результаты указывают на менее тяжелый инфекционный процесс у группы животных, иммунизированных штаммом F. tularensis 15/ sоdBИ. Сравнение обсемененности печени и селезенки мышей в экспериментальных группах на
Рисунок 4.
Динамика изменения веса имунных мышей линии BALB/c, зараженных штаммом F. tularensis Sсhu, по отношению к весу перед заражением (%). Доза заражения 3000 КОЕ/мышь
Контроль Р tularensis 15 НИИЭГ Р tularensis 15/вос(ВИ
Рисунок 5.
Обсемененность органов иммунных мышей на 7 сутки
после введения 3000 КОЕ/мышь вирулентного штамма F. tularensis S^u
7 сутки после заражения показало повышенную защиту от диссеминации возбудителя в органах мышей, иммунизированных штаммом F. tularensis 15/sodBII (рис. 5). Это явление более ярко выражено при сравнении обсеменённости печени. У мышей, иммунизированных штаммом F. tularensis 15/ sodBII, печень практически свободна от бактерий тест-заражающего штамма.
Суммируя полученные данные, можно сказать, что у мышей, иммунизированных модифицированным штаммом F. tularensis 15/sodBII, напряженность протективного иммунитета выше, чем у мы-
шей, иммунизированных штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ, при этом он менее вирулентен для мышей, чем родительский вакцинным штамм.
Таким образом, нами показано, что модификация гена sodB, приводящая к транзиторному снижению количества синтезируемого фермента FeSOD в логарифмической фазе роста штамма F. tularensis 15/sodBII [6], улучшает его иммуно-генные свойства, а данный методический приём полезен для проведения исследований в области, касающейся создания современной живой туля-ремийной вакцины. Ш
Литература
1. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. Москва. Медицина. 1975
2. Медуницын Н.В. Вакцинология. 2-е, перераб. и доп. Москва. Триада-Х. 2004: 448.
3. Bakshi C.S., Malik M., Regan K., Melendez J.A., Metzger D.W., Pavlov V.M. et al. Superoxide dismutase B gene (sodB)-deficient mutants of Francisella tularensis demonstrate hypersensitivity to oxidative stress and attenuated virulence. J. Bacteriol. 2006; 188 (17): 6443 - 6448.
Bakshi C.S., Malik M., Mahawar M. Kirimanjeswara G.S., Hazlett K.R., Palmer L.E. et al.: An improved vaccine for prevention of respiratory tularemia caused by Francisella tularensis SchuS4 strain. Vaccine. 2008; 26: 5276 - 5288.
Miller R.A., Britigan B.E. Role of oxidants in microbial pathophysiology. Clin. Microbiol. Rev. 1997: 1 - 18.
Сухова М.А., Вахрамеева Г.М., Кравченко Т.Б., Мокриевич А.Н., Павлов В.М., Дятлов И.А. Конструирование и изучение свойств вариантов штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ со сниженной экспрессией гена sodB, кодирующего Fe-супероксиддисмутазу. Биотехнология. 2015; 4: 16 - 27. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград; Медицинская литература; 1987: 184.
8. Мокриевич А.Н., Титарева Г.М., Комбарова Т.И., Ганина Е.А., Кравченко Т.Б., Бахтеева И.В. и др. Иммуногенность и реактогенность штамма Francisella tularensis 15/23-1 recA, кандидата для создания новой живой туляремийной вакцины. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2015; 6 (85): 74 - 86.
9. Комбарова Т.И., Павлов В.М., Кравченко Т.Б., Титарева Г. М. , Бахтеева И. В. , Борзилов А.И. и др.Сравнительная оценка реактогенности туляремийной вакцины на различных биомоделях. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2013; 4: 54 - 62.
References
4.
7.
i. 2. 3.
Olsuf'ev N.G. Taxonomy, microbiology and laboratory diagnosis of tularemia pathogen. Moscow. Medicina. [Medicine]. 1975 (in Russian). Medunitsyn N.V. Vaccinology. 2nd, Revised. and ext. Moscow. Triada-X. [Triad-X] 2004: 448 (in Russian).
Bakshi C.S., Malik M., Regan K., Melendez J.A., Metzger D.W., Pavlov V.M. et al. Superoxide dismutase B gene (sodB)-deficient mutants of Francisella tularensis demonstrate hypersensitivity to oxidative stress and attenuated virulence. J. Bacteriol. 2006; 188 (17): 6443 - 6448.
Bakshi C.S., Malik M., Mahawar M. Kirimanjeswara G.S., Hazlett K.R., Palmer L.E. et al. An improved vaccine for prevention of respiratory tularemia caused by Francisella tularensis SchuS4 strain. Vaccine. 2008; 26: 5276 - 5288.
Miller R.A., Britigan B.E. Role of oxidants in microbial pathophysiology. Clin. Microbiol. Rev. 1997: 1 - 18.
Sukhov M.A., Vahrameeva G.M., Kravchenko T.B., Mokrievich A.N., Pavlov V.M., Dyatlov I.A. Design and study of a strain of Francisella tularensis 15 NIIEG properties options NIIEG with decreased gene expression sodB, encoding Fe-superoxide dismutase. Biotehnologiya. [Biotechnology]. 2015; 4: 16 - 27 (in Russian).
Ashmarin I.P, Vorobyov A.A. Statistical methods in microbiological research. Leningrad; Medicinskaja literatura. [Medical literature]; 1987: 184 (in Russian). Mokrievich A.N., Titareva G.M., Kombarova T.I., Ganina E.A. Kravchenko T.B., Bakhteeva I.V. et al. Immunogenicity and reactogenicity of Francisella tularensis strain 15/23-1 recA, the candidate for a new live tularemia vaccine. Jepidemiologija i Vakcinoprofilaktika. [Epidemiology & Vaccinal prevention]. 2015; 6 (85): 74 - 86 (in Russian).
Kombarova T.I., Pavlov V.M., Kravchenko T.B., Titareva G.M ,Bakhteeva I.V. Borsilov A.I. et al. Comparative assessment of reactogenicity tularemia vaccine at different biomodels. Jepidemiologija i Vakcinoprofilaktika. [Epidemiology & Vaccinal prevention]. 2013; 4: 54 - 62 (in Russian).
Ф
