CC BY
65
иммунология
13. Зурочка А.В., Хайдуков С.В., Кудрявцев И.В., Черешнев В.А.
Проточная цитометрия в медицине и биологии. Екатеринбург: РИО УрО РАН; 2013.
16. Тотолян А.А. Роль хемокинов и их рецепторов в иммунорегуляции.
Иммунология. 2001; (5): 7-15. 21. Елезов Д.С., Кудрявцев И.В., Арсентьев Н.А., Басин В.В., Эсауленко Е.В., Семенов А.В. и др. Анализ популяций Т-хелперных клеток памяти, экспрессирующих хемокиновые рецепторы CXCR3 и CCR6, в периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2015; 160 (8): 204-8.
Поступила 01.10.15
REFERENCES
1. Murphy K.M., Reiner S.L. The lineage decisions of helper T cells. Nat. Rev. Immunol. 2002; 2 (12): 933-44.
2. Sakaguchi S., Yamaguchi T., Nomura T., Ono M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 2008; 133 (5): 775-87.
3. Geginat J., Paroni M., Maglie S., Alfen J.S., Kastirr I., Gruarin P. et al. Plasticity of human CD4 T cell subsets. Front. Immunol. 2014; 5: 630.
4. Rivino L., Messi M., Jarrossay D., Lanzavecchia A., Sallusto F., Geginat J. Chemokine receptor expression identifies Pre-T helper (Th)1, Pre-Th2, and nonpolarized cells among human CD4+ central memory T cells. J. Exp. Med. 2004; 200 (6): 725-35.
5. Crotty S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Ann. Rev. Immunol. 2011; 29: 621-63.
6. Annunziata F., Cosmi L., Santarlasci V., Maggi L., Liotta F., Mazzinghi B. et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J. Exp. Med. 2007; 204 (8): 1849-61.
7. Kudryavtsev I.V. Memory T cells: major populations and stages of differentiation. Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal. 2014; 8 (4): 947-64. (in Russian)
8. Sokhonevich N.A., Khaziakhmatova O.G., Yurova K.A., Shupletsova V.V., Litvinova L.S. Phenotypic characterization and functional features of memory T- and B-cells. Tsitologiya. 2015; 57 (5): 311-8. (in Russian)
9. Khaydukov S.V., Baydun L.A., Zurochka A.V., Totolyan A.A. The standardised technique "Study subpopulations of peripheral blood lymphocytes by using flow cytometry". Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal. 2014; 8 (4): 974-92. (in Russian)
10. Kudryavtsev I.V., Subbotovskaya A.I. Application of six-color flow cytometric analysis for immune profile monitoring. Meditsinskaya immu-nologiya. 2015; 17 (1): 19-26. (in Russian)
11. Mahnke Y.D., Roederer M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin. Lab. Med. 2007; 27 (3): 469-85.
12. Sallusto F., Lanzavecchia A. Understanding dendritic cell and T-lympho-cyte traffic through the analysis of chemokine receptor expression. Immunol. Rev. 2000; 177: 134-40.
13. Zurochka A.V., Khaydukov S.V., Kudryavtsev I.V., Chereshnev V.A. Flow Cytometry in Medicine and Biology. [Protochnaya tsitometriya v meditsine i biologii]. Ekaterinburg: RIO UrO RAN; 2013. (in Russian)
14. Schaerli P., Willimann K., Lang A.B., Lipp M., Loetscher P., Moser B. CXC chemokine receptor 5 expression defines follicular homing T cells with B cell helper function. J. Exp. Med. 2000; 192 (11): 1553-62.
15. Morita R., Schmitt N., Bentebibel S.E., Ranganathan R., Bourdery L., Zurawski G. et al. Human blood CXCR5(+)CD4(+) T cells are counterparts of T follicular cells and contain specific subsets that differentially support antibody secretion. Immunity. 2011; 34 (1): 108-21.
16. Totolyan A.A. Role of chemokines and their receptors in immunoregulation. Immunologiya. 2001; (5): 7-15. (in Russian)
17. Le Coz C., Joublin A., Pasquali J.L., Korganow A.S., Dumortier H., Mon-neaux F. circulating TFH subset distribution is strongly affected in lupus patients with an active disease. PLoS One. 2013; 8 (9): e75319.
18. Wang Q., Zhai X., Chen X., Lu J., Zhang Y., Huang Q. Dysregulation of circulating CD4+CXCR5+ T cells in type 2 diabetes mellitus. APMIS. 2015; 123 (2): 146-51.
19. Espinosa-Ortega F., Gomez-Martin D., Santana-De Anda K., Romo-Tena J., Villasenor-Ovies P., Alcocer-Varela J. Quantitative T cell subsets profile in peripheral blood from patients with idiopathic inflammatory myopathies: tilting the balance towards proinflammatory and pro-apoptotic subsets. Clm. Exp. Immunol. 2015; 179 (3): 520-8.
20. Andalib A., Doulabi H., Najafi M., Tazhibi M., Rezaie A. Expression of chemokine receptors on Th1/Th2 CD4+ lymphocytes in patients with multiple sclerosis. Iran. J. Immunol. 2011; 8 (1): 1-10.
21. Elezov D.S., Kudryavtsev I.V., Arsent'ev N.A., Basin V.V., Esaulenko E.V., Semenov A.V. et al. The analysis of T helper memory cells populations expressing the chemokine receptors CXCR3 and CCR6 in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis C. Byulleten' eksperimental 'noy biologii i meditsiny. 2015; 160 (8): 204-8. (in Russian)
22. Lecureuil C., Combadiere B., Mazoyer E., Bonduelle O., Samri A., Au-tran B. et al. Trapping and apoptosis of novel subsets of memory T lymphocytes expressing CCR6 in the spleen of HIV-infected patients. Blood. 2007; 109 (9): 3649-57.
Reseived 01.10.15
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2016 УДК 616.981.455-078.33
Еремкин А.Б., Елагин Г.Д., Печенкин Д.в., Фоменков О.О., Богачева Н.в., Кытманов А.А., Куклина Г.в., Тихвинская О.в.
РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ И ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ
Филиал ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации, 610017, г. Киров, Российская Федерация
Осуществлен подбор моноклональных антител, обладающих иммунохимической активностью к антигенам Francisella tularensis, на их основе разработаны иммуноферментная и иммунохроматографическая тест-системы для выявления возбудителя туляремии. Оценка чувствительности и специфичности разработанных тест-систем показала, что образцы обеспечивали выявление штаммов F. tularensis в концентрации от 5,0105м.к.см-3 до 1,010м.к.см-3 и не давалилож-ноположительныхрезультатов при исследовании гетерологичныхмикроорганизмов в концентрации 1,0108м.к.^см-3.
К л ю ч е в ы е с л о в а: Francisella tularensis; моноклональные антитела; иммуноферментный анализ; иммунохромато-графический анализ.
Д л я ц и т и р о в а н и я : ЕремкинА.В., Елагин Г.Д., Печенкин Д.В., Фоменков О.О., Богачева Н В., Кытманов А.А., Куклина Г.В., Тихвинская О.В. Разработка иммуноферментной и иммунохроматографической моноклональных тест-систем для выявления возбудителя туляремии. Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61 (3): 184-187. DOI 10.18821/0869-2084-2016-61-3-184-187.
Для корреспонденции: Еремкин Андрей Валентинович, мл. науч. сотр. научно-исследовательского отдела, E-mail: andreieremkin@ gmail.com
immunology
Eremkin A.V., Elagin G.D., Petchenkin D.V., Fomenkov O.O., Bogatcheva N.V., Kitmanov A.A., Kuklina G.V., Tikhvinskaya O.V. THE DEVELOPMENT OF IMMUNE ENZYME AND IMMUNE CHROMATOGRAPHIC MONOCLONAL TESTSYSTEM FOR DETECTING TULAREMIA AGENT
The office of the 48 central research institute of the Minoborona of Russia, 610017 Kirov, Russia
The immune enzyme and immunochromatographic test-systems for detecting tularemia agent were developed on the basis of selected set of monoclonal antibodies having immunochemical activity to antigens Francisella tularensis. The evaluation of .sensitivity and specificity of developed test-systems demonstrated that samples provided detection of strains of F. tularensis in concentration from 5.0x105 mkxcm-3 to 1.0x106 mkxcm-3 and gave no false positive results in analysis of heterologous microorganisms in concentration of 1.0x108 mkxcm-3
Keywords: Francisella tularensis; monoclonal antibodies; immune enzyme analysis; immunochromatographic analysis For citation: Eremkin A.V., Elagin G.D., Petchenkin D.V., Fomenkov O.O., Bogatcheva N.V., Kitmanov A.A., Kuklina G.V., Tikhvinskaya O.V The development of immune enzyme and immune chromatographic monoclonal test-system for detecting tularemia agent. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostic) 2016; 61 (3): 184-187. (in Russ.) DOI: 10.18821/0869-2084-2016-61-3-184-187.
For correspondence: Eremkin A.V., research assistant of the scientific research department. e-mail: andreieremkin@ gmail.com
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Financing. The study had no sponsor support.
Received 20.06.2015 Accepted 15.12.2015
Введение. Туляремия - опасное инфекционное заболевание, протекающее с лихорадкой и характеризующееся развитием гранулем во многих органах [1]. Крупные вспышки и спорадические случаи заболевания периодически регистрируются во многих странах мира, в том числе в Российской Федерации. Особенностью эпидемиологии туляремии является большое разнообразие переносчиков, путей передачи и механизмов заражения.
В настоящее время достигнуты значительные успехи в области лабораторной диагностики туляремии, тем не менее разработка новых диагностических препаратов для детекции Francisella tularensis, в том числе на основе иммунологических методов анализа с использованием моноклональных антител (МкАт), не утрачивает актуальности [2].
С развитием гибридомной технологии МкАт нашли широкое применение во многих областях биологии. Современным направлением совершенствования иммунодиагности-ческих методов анализа является замена поликлональных антител на моноклональные [3].
Главным преимуществом МкАт является строго определенная специфичность к конкретной антигенной детерминанте - эпитопу. Кроме того, МкАт стандартны по всем биологическим свойствам (авидность, аффинность). Наконец, гибридомная технология позволяет наработать МкАт в любое время в практически нелимитированном количестве. Единственным зарегистрированным и разрешенным к применению на территории Российской Федерации средством диагностики возбудителя туляремии, разработанным на основе МкАт, является тест-система ДИАТул-М производства ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов, выполненная в формате ДОТ-ИФА [4].
В связи с этим целью настоящей работы стала разработка иммуноферментной и иммунохроматографической монокло-нальных тест-систем для выявления возбудителя туляремии.
Материал и методы. При разработке тест-систем осуществляли наработку МкАт, продуцируемых культурами гибридных клеточных линий, полученных в филиале ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (Киров).
С этой целью клетки гибридом 31G1F10, 32E5D3, 35B11C8, 36C2F11, 36D5F4 и 31E3B9 в дозе 1-2 млн клеток на животное вводили внутрибрюшинно мышам линии BALB/с, предварительно обработанным пристанном, и через
7-10 сут контролировали их приживление. В случае развития у мышей выраженного асцита проводили забор перитонеаль-ного экссудата.
Во всех асцитных жидкостях методом иммунофермент-ного анализа определяли специфическую активность МкАт к антигенам F. tularensis, а также определяли класс иммуноглобулинов с использованием иммунохроматографических наборов реагентов IsoQuick Strips and Kits for Mouse Monoclonal Isotyping (Sigma, США).
Асцитные жидкости с титром антител 1:160 000 и более, полученные при культивировании гибридом одного клона, объединяли и использовали для получения специфических иммуноглобулинов. С этой целью их подвергали двукратному последовательному осаждению насыщенным раствором сульфата аммония. Антитела очищали методом ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЕ-сефацелем (Sigma-Aldrich, США). Контроль выхода белка по экстинкции осуществляли посредством проточного ультрафиолетового абсорбциометра и потенциометрического самописца. В полученном растворе МкАт определяли концентрацию белка по методу Лоури [5], а также специфическую активность методом иммуноферментного анализа.
На следующем этапе осуществляли выбор специфических компонентов иммуноферментной тест-системы, обеспечивающих выявление возбудителя туляремии и наиболее высокую чувствительность. Были исследованы различные комбинации полученных специфических туляремийных МкАт при их использовании в сенситине и иммунопероксидазном конъюгате. Синтез конъюгатов МкАт с пероксидазой хрена осуществляли по методике Р. Nacane [6]. Рабочее разведение конъюгатов определяли методом «шахматного титрования». В качестве положительного контроля использовали микробную культуру F. tularensis штамма 15 НИИЭГ в концентрации 5-106 м.к.-см-3.
Следующим этапом работы стало конструирование экспериментальных образцов иммуноферментной монокло-нальной тест-системы для выявления возбудителя туляремии. Для этого специфические компоненты тест-системы разводили защитной средой высушивания до концентрации, в 11 раз превышающей рабочее разведение, и подвергали лиофильному высушиванию с предварительной фасовкой в ампулы. Для лиофилизации иммуноферментного конъюгата использовали защитную среду следующего состава: 5 % са-
иммунология
Таблица 1
Характеристика препаратов туляремийных МкАт
МкАт гибридной клеточной линии Класс Объем, мл Содержание белка, мг-см"3 Специфическая активность, титр Удельная специфическая активность, ЕА-мг"1
31G1F10 M 4,2 6,2 1:5 120 000 247 742
32E5D3 M 3,9 6,4 1:2 560 000 120 000
35B11C8 M 4,5 6,3 1:2 560 000 121 904
36C2F11 M 3,9 7,2 1:2 560 000 106 000
36D5F4 M 3,6 12,0 1:5 120 000 128 000
31E3B9 M 4,0 6,1 1:1 280 000 62 950
П р и м е ч а н и е. Удельная специфическая активность - отношение произведения величины, обратной титру антител и соответствующей оптической плотности субстратно-индикаторной смеси, к концентрации белка в данном препарате иммуноглобулинов.
харозы, 10 мгсм-3 бычьего сывороточного альбумина в 0,5 М трис-НС1 с рН 7,4±0,1; в качестве среды высушивания для иммуноглобулинов применяли 5 % раствор сахарозы в 0,5 М КББ с рН 9,6±0,1.
Сушку проводили в установке для лиофильного высушивания «АЛСУ» (Ижевск, Россия). Ампулы запаивали и помещали на хранение при температуре 40С. После этапа лиофильного высушивания были отобраны образцы для оценки диагностических возможностей МкАт.
В состав иммуноферментной тест-системы были включены в готовом виде или в виде полуфабрикатов все им-мунохимические реагенты, необходимые для постановки твердофазного иммуноферментного анализа в планшетах, за исключением дистиллированной воды. Были изготовлены 3 лабораторно-экспериментальные серии иммуноферментной моноклональной тест-системы для выявления возбудителя туляремии.
Следующим этапом являлась разработка иммунохрома-тографической моноклональной тест-системы для выявления возбудителя туляремии.
Растворы для получения коллоидного золота и его конъю-гатов с антителами готовили на деионизированной воде, полученной при использовании установки МШ-р (МЛНроге, США).
В качестве специфических компонентов иммунохро-матографической тест-системы были использованы: МкАт гибридных клеточных линий 31Е3В9 и 35В11С8, кроличьи антивидовые антитела к иммуноглобулинам мыши. Все специфические компоненты получены специалистами филиала ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (Киров).
Для изготовления иммунохроматографической тест-системы применяли комплект мембран фирмы MDI Easypack (Advanced Microdevise, Индия): нитроцеллюлозную мембрану - CNPF-SN12-L2-P25 со скоростью ламинарного потока 4 см за 125 с для нанесения тестовой и контрольной зон; подложку для конъюгата - PT-R5; подложку для образца - GFB-R7L (0,6); подложку для адсорбента - АРО45.
Коллоидное золото (КЗ) получали с использованием золотохлористоводородной кислоты (Sigma, США), по методу Френса [7]. Результат электронной микроскопии показал высокую степень однородности частиц по размерным характеристикам. Для получения конъюгата коллоидного золота с антителами (КЗ-АТ) были использованы частицы диаметром 30±2 нм.
Определение связывания антител с КЗ проводили по рекомендациям [8]. Оптимальную концентрацию МкАт для получения конъюгата КЗ-АТ определяли на основании полученных фотометрических данных. Для конъюгирования в соответствии с рекомендациями выбрали концентрацию антител, на 10-15% превышающую точку выхода на плато.
При приготовлении конъюгата КЗ-АТ в коллоидное золото с рН 9,0 вносили раствор иммуноглобулинов с выбранной концентрацией. Смесь КЗ-АТ перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. По окончании времени инкубации в смесь добавляли 4% ПЭГ-40 000 (Sigma, США) в объеме, необходимом для получения конечной концентрации 0,25%, и вновь перемешивали содержимое на вортексе. Смесь инкубировали в течение 15 мин. Удаление несвязавших-ся антител от частиц КЗ проводили центрифугированием при 8000 g в течение 30 мин. По окончании центрифугирования супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 0,025 М трис-буфере с рН 8,0, содержащем 0,25% БСА и 10% сахарозу.
Конъюгат наносили на мембрану методом пропитывания с плотностью распределения реагента на подложке 30 мкл на 1 см2.
Для формирования аналитической и контрольной зон иммуноглобулины в выбранной концентрации наносили при помощи диспенсера с плотностью нанесения 0,1 мклмм-1.
Подложки с нанесенным конъюгатом и готовые рабочие мембраны сушили в вакууме при температуре 40оС в течение 2 ч.
Собранные и нарезанные по 4,5 мм иммунохроматогра-фические тест-системы помещали в пластиковые контейнеры (стрипы), которые запаивали в фольгированные пакеты с силикагелевым осушителем. Было изготовлено 3 лабораторные серии иммунохроматографической моноклональной тест-системы для выявления возбудителя туляремии.
На заключительном этапе проводили лабораторно-
Таблица 2
Чувствительность иммуноферментного анализа при выявлении F tularensis штамма 15 НИИЭГ в условиях постановки реакций с использованием разных комбинаций туляремийных МкАт
МкАт гибридной клеточной линии, Чувствительность иммуноферментного анализа при выявлении F. tularensis штамма 15 НИИЭГ с использованием иммунопероксидазного конъюгата, приготовленного на основе препарата, -106 м.к.см-3
используемые в качестве сенситина МкАт гибридной клеточной линии
31G1F10 32E5D3 35B11C8 36C2F11 36D5F4 31E3B9
31G1F10 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
32E5D3 1,0 2,0 1,0 1,0 1,0 1,0
35B11C8 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
36C2F11 1,0 0,5 1,0 1,0 1,0 1,0
36D5F4 0,5 2,0 1,0 1,0 1,0 1,0
31E3B9 1,0 4,0 0,25 2,0 4,0 2,0
immunology
Таблица 3
Чувствительность и специфичность иммуноферментной и иммунохроматографической моноклональных тест-систем для обнаружения и идентификации возбудителя туляремии
5,0105 м.к.см-3, иммунохроматографической тест-системы - в концентрации
Вид микроорганизма Количество исследованных штаммов Количество выявляемых штаммов с помощью иммуноферментной тест-системы Количество выявляемых штаммов с помощью иммунох-роматографической тест-системы Определяемая концентрация, м.к. ■ см-3 (n = 3)
F. tularensis 7 7 7 0,5106—1,0-106
Y. festis 3 0 0 1,0-108
Y. enterocolitica 3 0 0 1,0-108
E. coli 1 0 0 1,0-108
Y. fseudotuberculosis (I) 3 0 0 1,0-108
B. mallei 3 0 0 1,0-108
B. fseudomallei 3 0 0 1,0-108
B. аbortus 6 0 0 1,0-108
B. melitensis 6 0 0 1,0-108
B. suis 4 0 0 1,0-108
L. pneumophila (1) 3 0 0 1,0-108
B. ünthracis 3 0 0 1,0-108
V. cholerae 1 0 0 1,0-108
П р и м е ч а н и е. n - количество определений.
экспериментальное изучение разработанных тест-систем. Чувствительность тест-системы оценивали при исследовании семи штаммов F. tularensis. Оценку специфичности проводили с рядом гетерологичных микроорганизмов: Y. pestis, Y. entero-colitica, E.coli, Y. pseudotuberculosis, B.mallei, B.pseudomallei, B. abortus, B. melitensis, B. suis, L. pneumophila, B. anthracis, V. cholerae, взятых в концентрации 1,0108 м.к. см-3.
Результаты и обсуждение. На первом этапе разработки иммуноферментной и иммунохроматографической моно-клональных тест-системы провели наработку и определили иммунохимическую активность МкАт методом ИФА к F. tularensis (табл. 1).
Как следует из анализа данных, представленных в табл. 1, все приготовленные препараты туляремийных МкАт относились к классу М, характеризовались содержанием белка 6,1 мгсм-3 и более, специфической активностью в титре антител 1:128 000 и выше, а также имели высокий уровень удельной специфической активности и как следствие этого оказались перспективными в плане создания на их основе иммунофер-ментной и иммунохроматографической тест-систем, предназначенных для выявления F. tularensis.
В ходе отбора пары МкАт для использования в качестве сенситина и иммунопероксидазного конъюгата, обладающей наибольшей чувствительностью при выявлении F. tularensis штамма 15 НИИЭГ, максимальную чувствительность 0,25-106 м.к.см-3 обеспечивали антитела гибридных клеточных линий 31E3B9 и 35B11C8 (табл. 2).
Показатель чувствительности снижался в 2 раза после этапа лиофильного высушивания специфических компонентов иммуноферментной тест-системы и составил 0,5-106 м.к.-см-3.
В дальнейшем МкАт гибридных клеточных линий 31E3B9 и 35B11C8 использовали при разработке иммунохроматогра-фической тест-системы.
На этапе лабораторно-экспериментального изучения разработанных тест-систем провели оценку их чувствительности и специфичности (табл. 3).
Образцы иммуноферментной тест-системы обеспечивали выявление штаммов F. tularensis в концентрации
1,0106 м.к.см-3 и не давали ложнополо-жительных результатов при исследовании гетерологичных микроорганизмов в концентрации 1,0108 м.к.см-3.
Выводы. 1. В результате проведенных исследований разработаны высокочувствительные и специфичные моноклональные тест-системы для выявления возбудителя туляремии: имму-ноферментная тест-система обеспечивает выявление штаммов F. tularensis в концентрации 5,0105 м.к. см-3, им-мунохроматографическая - в концентрации 1,0106 м.к.см-3, тест-системы не дают ложноположительных результатов при исследовании гетерологич-ных микроорганизмов в концентрации 1,0108 м.к.-см-3.
2. Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности применения разработанных тест-систем для выявления возбудителя туляремии в условиях стационарных лабораторий, а также в полевых условиях мобильными диагностическими группами. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 3, 5-8 см. REFERENCES)
1. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., ред. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство. М.: ЗАО «Шико»; 2013.
2. Сырова Н.А., Терешкина Н.Е., Девдариани З.Л. Современное состояние иммунодиагностики туляремии. Проблемы особо опасных инфекций. 2008; 3 (97): 12-5.
4. Терешкина Н.Е., Терехова И.В., Сырова Н.А., Девдариани З.Л., Ля-шова О.Ю., Григорьева Г.В. и др. Конструирование и медицинские испытания моноклональной дот-иммуноферментной тест-системы для детекции туляремийного микроба «ДИАТул-М». Проблемы особо опасных инфекций. 2013; (2): 42-5.
Поступила 20.06.15
REFERENCES
1. Onisfohenko G.G., Kutyrev V.V., eds. Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases: A Practical Guide. [Laboratornaya diagnostika opas-nykh infektsionnykh bolezney: Prakticheskoe rukovodstvo]. Moscow: ZAO "Shiko"; 2013. (in Russian)
2. Syrova N.A., Tereshkina N.E., Devdariani Z.L. The current state of im-munodiagnostics tularemia. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2008; (3 (97)): 12-5. (in Russian)
3. Peruski A.H., Peruski L.F.Jr. Immunological methods for detection and identification of infectious disease and biological warfare agents. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003; 10 (4): 506-13.
4. Tereshkina N.E., Terekhova I.V., Syrova N.A., Devdariani Z.L., Lyashova O.Yu., Grigor'eva G.V. et al. Construction and medical tests monoclonal dot-ELISA test kits for the detection of tularemia microbe "DIATul-M. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2013; (2): 42-5. (in Russian)
5. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193 (1): 265-75.
6. Nakane P., Lavaoi A. Peroxidase-labeled antibody - new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22 (12): 1084-91.
7. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Nat. Phys. Sci. 1973; 241: 20-2.
8. Hermanson G.T. Bioconjugat Technique. 2nd Ed. Amsterdam: Academic Press; 2008.
Received 20.06.15
