CC BY
29
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МЕТОДЫ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК 615.37:579.887.9].012.6
Зенинская Н.А.1, Рябко А.К.1, Колесников А.ВУ- Козырь А.В.1, Марьин М.А.1, Фирстова В.В.1, Шемякин И.Г.1, Караулов А.В.3, Дятлов И.А.1
ПОЛУЧЕНИЕ И ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОГО ПЕПТИДОГЛИКАН-АССОЦИИРОВАННОГО ЛИПОПРОТЕИНА (PAL) LEGIONELLA PNEUMOPHILA
1ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ), 142279, п. Оболенск, Россия;
2Институт инженерной иммунологии (ИИИ), 142380, дер. Любучаны, Россия;
3ФГБОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, 119991, Москва, Россия
Разработан метод получения рекомбинантного пептидогликан-ассоциированного липопротеина (PAL) L. pneumophila в гетерологичной системе экспрессии в составе химеризованного белка His-SUMO-PAL, содержащего гексагистидиновый тэг для хроматографической очистки белка-предшественника и белок PAL, разделённые расщепляемым SUMO-протеазой пептидом, который позволяет отделить белок His-SUMO от белка PAL с восстановлением его нативной первичной структуры. Метод позволяет получить PAL L. pneumophila с высокой степенью чистоты и выходом 0,3 г с литра бактериальной культуры без ферментации. Полученный рекомбинантный PAL сохраняет иммуногенные свойства и может быть использован при конструировании вакцинных препаратов и в процессе получения моноклональных антител для диагностики легионеллёзной инфекции.
Ключевые слова: Legionella pneumophila; пептидогликан-ассоциированный липопротеин; PAL; легионеллёз, лимфоциты.
Для цитирования: Зенинская Н.А., Рябко А.К., Колесников А.В., Козырь А.В., Марьин М.А., Фирстова В.В., Шемякин И.Г., Караулов А.В., Дятлов И.А. Получение и иммуногенные свойства рекомбинантного пептидогликан-ассоциированного липопротеина (PAL) Legionella pneumophila. Иммунология. 2018; 39(1): 50-55. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-50-50-55
Zeninskaya N.A.1, Riabko A.K.1, Kolesnikov Â.V.12, Kozyr A.V.1, Marin M.A.1, Firstova V.V.1, Shemyakin I.G.1, Karaulov A.V.3, Dyatlov I.A.1
THE PREPARATION OF RECOMBINANT PEPTIDOGLYCAN-ASSOCIATED LIPOPROTEIN (PAL) LEGIONELLA PNEUMOPHILA AND CHARACTERISATION OF ITS IMMUNOGENIC PROPERTIES
1 FSIS State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Rospotrebnadzor, 142279, Obolensk, Russia;
2 Institute of Immunological Engineering, 142380, Lyubuchany, Russia;
3 Sechenov First Moscow State Medical University, Russian Health Ministry, 119991, Moscow, Russia
A method for producing recombinant peptidoglycan-associated lipoprotein (PAL) L. pneumophila in a heterologous expression system consisting of chimerical protein His-SUMO-PAL with hexa-histidine tag (for chromatographic purification of the precursor protein) and the protein PAL, which separated by SUMO protease peptide was developed. The method allows to obtain recombinant PAL with a high degree of purity and a yield of 0.3 g per liter of bacterial culture without fermentation. The obtained recombinant PAL retains the native structure, immunogenic properties and it can be used for vaccine development and production of monoclonal antibodies as a diagnostic tool at Legionella infection.
Keywords: Legionella pneumophila; peptidoglycan-associated lipoprotein; PAL; legionellosis; lymphocytes.
For citation: Zeninskaya N.A., Riabko A.K., Kolesnikov A.V., Kozyr A.V., Marin M.A., Firstova V.V., Shemyakin I.G., Karaulov A.V., Dyatlov I.A. The preparation of recombinant peptidoglycan-associated lipoprotein (PAL) legionella pneumophila and characterisation of its immunogenic properties. Immunologiya. 2018; 39(1): 50-55. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-50-55
For correspondence: Natalia A. Zeninskaya, junior researcher of the laboratory of molecular biology «FBIS SRCAMB», E-mail: nataliazeninskaya@mail.ru Information about authors:
Zeninskaya N.A., http://orcid.org/0000-0002-5388-292X; Riabko A.K., http://orcid.org/0000-0001-7478-909X; Kolesnikov A.V., http://orcid.org/0000-0001-8108-0265; Kozyr A.V., http://orcid.org/0000-0001-6295-5943; Marin M.A., http://orcid.org/0000-0003-0560-915X;
Для корреспонденции: Зенинская Наталья Алексеевна, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии ФБУН ГНЦ ПМБ, E-mail: nataliazeninskaya@mail.ru
ORIGINAL ARTICLE
Firstova V. V., http://orcid.org/0000-0002-9898-9894; Shemyakin I.G., http://orcid.org/0000-0001-9667-1674 Dyatlov I.A., http://orcid.org/0000-0003-1078-4585
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. Work is performed under NIR 054 «development of a new generation
of high-performance test systems for detection ofpathogens of nosocomial infections on the basis of immuno-PCR aptamers».
Received 03.09.17 Accepted 16.12.17
Введение
Основным методом, позволяющим осуществлять раннюю диагностику и мониторинг легионеллёзной инфекции, является определение легионеллёзного антигена в моче иммунохро-матографическим или иммуноферментным методом. Эти тесты основаны прежде всего на выявлении ЛПС L. pneumophila серогруппы 1, т. к. именно этот возбудитель чаще всего вызывает легионеллёзную инфекцию. Вместе с тем последние исследования показывают, что доля легионеллёзной инфекции, вызванной L. pneumophila серогруппы 1, варьирует от года к году и составляет от 50 до 91%, что было подтверждено лабораторными исследованиями [1 - 3]. Более того, показатели смертности для всех групп пациентов, не входящих в группу заболевших от инфицирования L. pneumophila серогруппы 1, выше и составляют около 27% [1, 2]. L. pneumophila, L. micdadei и L. bozemanii были причиной 30 - 55% заболеваний легионеллёзной инфекцией в Австралии и Новой Зеландии. Регистрировались также инфекции, вызванные L. jordanis, L. oakridgensis, L. anisa, L. gormanii и L. sainthelensi [1, 4 - 6].
Приведённые данные свидетельствуют о необходимости создания тест-системы, позволяющей выявлять не только легионеллёзную инфекцию, вызванную бактериями L. pneu-mophila серогруппы 1, но также и другими серогруппами и другими видами Legionella.
Одним из высококонсервативных антигенов бактерий рода Legionella является пептидогликан-ассоциированный липопротеин (PAL). Иммунизация экспериментальных животных (мышей, кроликов, морских свинок) PAL индуцирует выраженный синтез антител, пролиферацию лимфоцитов, а сам антиген, начиная с третьих суток, обнаруживается в моче инфицированных животных [7]. В связи с иммуногенной активностью и специфичностью для бактерий рода Legionella PAL рассматривается в качестве возможного компонента вакцины, а моноклональные антитела к нему - в качестве основы при разработке препарата для диагностики легионеллёз-ной инфекции на ранних сроках заболевания [8].
Для получения рекомбинантного белка PAL (rPAL) использовались разные подходы, в частности, разработан метод получения rPAL содержащего на С-конце последовательность шести гистидинов; получение rPAL в клетках грамм-отрицательных бактерий под контролем сильного промотора; в эукариотических клетках линии NIH3T3 в векторе pcDNA3.1(+) методом липофекции, в составе единого полипептида с фрагментом глутатион^-трансферазы (GST) в E. соН в векторе pGEX-KG, получение rPAL в виде химеры с мальтозосвязывающим белком (MBP) с использованием вектора pMAL(C2X). Все эти методы имеют определенные недостатки: низкая чистота конечного белкового препарата, сложность и дороговизна проведения масштабной продукции белка, низкая эффективность продукции rPAL.
Цель работы - разработать оптимальный способ получения рекомбинантного белка PAL в растворимой форме со структурой, максимально приближённой к нативной и определить его иммунобиологические свойства.
Материал и методы
Бактериальные штаммы, плазмиды, основные реактивы, среды. Патогенный штамм L. pneumophila ATCC
33152 серогруппы 1 (Philadelphia), депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) ФБУН ГНЦ ПМБ, культивировали в течение 5 сут при температуре 37 °С на ле-гионеллбакагаре (ФБУН ГНЦ ПМБ, РФ), приготовленном в соответствии с инструкцией предприятия-изготовителя. Для клонирования и экспрессии использовали штаммы электрокомпетентных E. coli DH12S (Invitrogen, США) и BL21(DE3) (NEB, США). Бактерии E. coli культивировали как на агари-зованной среде 2xYT (дрожжевой экстракт - 10 г/л, триптон - 16 г/л, NaCl - 5 г/л, агар - 15 г/л, pH 7.0) с добавлением 1%-ной глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина, так и в жидкой среде 2xYT (дрожжевой экстракт - 10 г/л, триптон - 16 г/л, NaCl - 5 г/л, pH 7.0) с добавлением 0,1%-ной глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Для получения экспрессионной конструкции использовали коммерческую плазмиду pET22b(+) (Novagen, США). Для расщепления продуктов амплификации и плазмиды по специфическим сайтам использовали эндонуклеазы рестрикции NdeI, SacI, Sail и BglII (Thermo, США). Для отщепления рекомбинантного белка rPAL из конструкции применяли протеазу SUMO (Invitrogen, США). Праймеры синтезированы ЗАО «Евроген» по заказу ФБУН ГНЦ ПМБ.
Выделение тотальной ДНК L. pneumophila. Колонии бактерий L. pneumophila смывали с поверхности агара физиологическим раствором. Помещали суспензию в стерильные микроцентрифужные пробирки, собирали клетки центрифугированием в течение 5 мин. при 10000 g. Полученный осадок (60 - 80 мг) ресуспендировали в 400 мкл буфера экстракции (2 М Трис-HCl pH 8.0, 1 М NaCl, 20% SDS, 0,5 М ЭДТА), после чего прогревали суспензию на водяной бане при 65 °C в течение 20 мин., затем центрифугировали 5 мин. при 18000g. К супернатанту добавляли 300 мкл изопропило-вого спирта, перемешивали и выдерживали в течение 5 мин. при комнатной температуре, затем повторяли центрифугирование при тех же условиях. Осадок, содержащий ДНК, промывали 70%-ным охлаждённым (+4 °С) этиловым спиртом, повторяли центрифугирование. Полученный осадок подсушивали 30 мин на воздухе с соблюдением условий асептики, и растворяли в 50 мкл особо чистой стерильной H2O (получена с помощью системы Milli-Q, Millipore, США).
Получение экспрессионной конструкции. Фрагмент ДНК, кодирующий последовательность шести гистидинов и пептида SUMO получали путём двух последовательных ам-плификаций с перекрывающихся праймеров. Результирующий фрагмент кодирует трансляционный энхансер MASMT, последовательность шести гистидинов (H6) и специфический сайт расщепления протеазой SUMO, содержит сайты эндонуклеаз рестрикции: NdeI на 5'-конце последовательности и SacI на 3'-конце. Полученный фрагмент клонировали в плазмиду pET22b(+) по сайтам рестрикции эндонуклеаз NdeI и SacI c получением экспрессионной плазмиды pET22-His-SUMO, которой затем трансформировали клетки E. coli DH12S. Трансформанты выращивали на твёрдой среде 2xYT единичные колонии, анализировали на наличие инсерта расчётной длины в плазмиде с помощью ПЦР с использованием стандартных праймеров T7forward и T7reverse. Плазмидную ДНК-клонов, содержащих встроенный фрагмент, выделяли
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
из ночной культуры, выращенной в жидкой среде 2xYT, методом щелочного лизиса [9]. Корректность синтеза и встраивания экспрессионных конструкций верифицировали методом капиллярного секвенирования.
Фрагмент ДНК, кодирующий искомый белок PAL, получали прямой амплификацией с выделенного бактериального генома L. pneumophila. Использовали праймеры, вносящие на 5'-конец последовательности сайт рестрикции BglII и сайт SalI на 3'-конец фрагмента. Фрагмент, кодирующий PAL, лигировали в плазмиду pET22-His-SUMO по сайтам SalI и BglII. Получение единичных колоний и идентификацию инсерта проводили, как описано ранее.
Экспрессия рекомбинантного белка His-SUMO-PAL в клетках E. coli. Штамм-продуцент E. coli His-SUMO-PAL получали электротрансформацией электрокомпетентных клеток E. coli BL21 (DE3). Трансформанты выращивали на агаризованной среде 2xYT, содержащей 1% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Полученную культуру засевали в жидкую среду 2xYT, содержащую 0,1% глюкозы и 100 мкг/ мл ампициллина, культивировали не менее 3 ч при 37°С в термостатируемом орбитальном шейкере при 220 об./мин до достижения 1 единицы оптической плотности. Продукцию рекомбинантного белка индуцировали добавлением 0,2 мM изопропил^-Э-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ), экспрессию белка проводили в течение 4 ч при 30°С.
Выделение и очистка rPAL. Бактериальную биомассу собирали посредством центрифугирования при 5000 g в течение 10 мин., ресуспендировали осадок в буфере состава 20 мM трис-HCl pH 8.0, 100 мM NaCl. Лизис клеток производили в 0,5%-ном растворе тритон Х-100 после предварительной обработки лизоцимом (200 мкг/мл), затем удаляли нуклеиновые кислоты обработкой ДНК-азой и РНК-азой в концентрациях по 10 мкг/мл каждого фермента. Разделяли лизат на фракции центрифугированием при 10000 g в течение 30 мин. с охлаждением до +4°С. Выделение рекомбинантного белка His-SUMO-PAL осуществляли из осветлённого лизата (растворимой белковой фракции) методами ВЭЖХ. Все хроматографические работы вели при температуре +4°С. Выделяли His-Tag меченые белки на металл-хелатной смоле cOmplete™ His-Tag Purification Resin (Roche Life Sciences), используя буфер нанесения состава 20 мM трис-HCl pH 8.0, 100 мM NaCl и элюирующий буфер, содержащий 50 мM ими-дазола. Доочищали элюат анионообменной хроматографией на смоле Q-Sepharose (GE Healthcare, США). Белок наносили на колонку в буфере, содержащем 20 мM трис-HCl pH 8.0, 20 мM NaCl, элюировали градиентом хлорида натрия на том же буфере от 20 до 500 мM в течение 40 мин. Полученный белок His-SUMO-PAL обрабатывали протеазой SUMO (Invitrogen, США) в массовом соотношении протеазы к белку 1:1000, в присутствии 0,1 мM дитиотреитола (ДТТ) при температуре 30 °С в течение 2 ч. для отщепления последовательности из пептида SUMO и гексагистидина.
Продукты расщепления белка His-SUMO-PAL отделяли друг от друга хроматографически на металл-хелатной смоле cOmplete™ His-Tag Purification Resin. Белок rPAL собирали из проскока хроматографической колонки при нанесении продуктов расщепления протеазой SUMO, концентрировали при помощи центрифужных фильтров Amicon Ultra-15 (Millipore, США). Получали чистую фракцию белка rPAL в конечном буфере методом эксклюзионной хроматографии на колонке Superdex 200 10/300 GL, уравновешенной буфером, содержащим 20 мM MES pH 8.0, 100 мM NaCl. Фракции, содержащие целевой белок PAL, определяли электро-форетически в 12% ПААГ в денатурирующих условиях по методике Лэммли [10], объединяли, концентрировали, измеряли концентрацию белка в конечном препарате по методу Бредфорд [11] и при помощи инфракрасного спектрометра DirectDetect (Millipore, США), затем оценивали чистоту белкового препарата денситометрически. Белок PAL храни-
Рис. 1. Результаты отщепления белка His-SUMO и очистки белка PAL.
1 - маркер молекулярной массы SM0441 (Fermentas, США); 2 - контроль совокупности белков растворимой фракции бактериального лизата; 3 -белок His-SUMO-PAL, очищенный методом металл-хелатной хроматографии; 4 - фрагменты His-SUMO и PAL, полученные после расщепления исходного белка His-SUMO-PAL протеазой SUMO; 5 - белок PAL; 6 - белок His-SUMO.
ли в аликвотах при температуре -70°С в присутствии 30%-ного глицерина.
Денситометрия. Денситометрию rPAL проводили на лазерном сканере Typhoon FLA 9500 с использованием программы ImageQuant™ TL.
Определение цитотоксичности rPAL проводили на клеточной линии J774 и лимфоцитах мышей c использованием общепринятых методов в МТТ-тесте [12] и с использованием прижизненного окрашивания 7-AAD красителем [13].
Иммунизация мышей. Мышей линии BALb/c иммунизировали двукратно подкожно rPAL (200 мкг/мл), эмульгированного с полным (первая иммунизация) и неполным (вторая иммунизация) адъювантом Фрейнда, с интервалом в 21 день. Бустер-дозу rPAL (100мкг/мл) вводили внутрибрюшинно в физиологическом растворе. Оценку иммунологических показателей проводили на 14-е сутки после последней иммунизации.
Определение антител к PAL. Проверку титра специфичности антител у иммунизированных мышей проводили непрямым твердофазным ИФА.
Определение специфической активации лимфоцитов. Спленоциты (2^106 кл/мл), полученные общепринятым методом [12], инкубировали в лунках 96-луночного планшета по 200 мкл при температуре 37°С во влажной атмосфере 5% углекислого газа (СО2) в полной питательной среде RPMI. В экспериментальные лунки вносили по 10 мкл среды, содержащей 10 мкг/мл PAL. В контрольные лунки добавляли 5 мкг/мл Con A (Sigma, США) для оценки уровня неспецифической активации. В лунки отрицательного контроля добавляли 10 мкл среды. Спленоциты инкубировали в течение 24 ч для выявления количества клеток, экспрессирующих маркер активации CD69, 48 ч - экспрессирующих CD25.
Окрашивание поверхностных маркеров. Спленоциты окрашивали моноклональными антителами к поверхност-
- S2 -
ORIGINAL ARTICLE
e CD25 PerCP-Cy5,5 г CD25 PerCP-Cy5,5
Рис. 2. Пример цитофлюорограмм, отражающих процентное содержание CD3+ CD4+ субпопуляции лимфоцитов, экспрессирующих CD69 (а,
б) или CD25 (в, г) молекулу.
Распределение лимфоцитов, полученных от иммунных мышей, после инкубирования клеток в течение 24 ч (а, б), 48 ч (в, г) в присутствии rPAL (контурная линия) и без антигена (контурная линия с заштрихованной областью). Под маркером указано процентное содержание клеток, экспрессирующих активационный маркер без стимуляции гРАК Над маркером - процентное содержание клеток, экспрессирующих активационный маркер после стимуляции rPAL.
ным маркерам клеток мыши: CD69, CD25, CD19, CD3, CD4 (Caltag, Invitrogen), меченными флюорохромами FITC, PE, PerCP, PerCP-Cy5.5 или APC, в соответствии с инструкцией производителя. Подсчёт окрашенных клеток проводили на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программы Cell QuestPro.
Статистическая обработка результатов измерений. Для обработки результатов использовали стандартные методы математической статистики с вычислением средних арифметических значений величин и среднеквадратических отклонений; для анализа различий между группами применяли метод Стьюдента и непараметрические критерии Уил-коксона и Манна - Уитни [14].
Результаты и обсуждение
Для продукции комплексного белка His-SUMO-PAL была использована система экспрессии в E. coli. Выбор плазмид-ного вектора системы pET обусловлен возможностью высокоэффективной трансляции полипептидов за счёт использования сильного промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7, повышенной стабильности продукции потенциально токсических белков за счёт низкого уровня копийности плазмид, несущих сайт репликации pBR332.
В итоге была получена экспрессионная конструкция pET22-His-SUMO-PAL. Результаты секвенирования плаз-миды pET22-His-SUMO-PAL показали полное соответствие
полученной и запланированной к получению последовательности. N-концевая область белкового продукта содержит ко-доны, обеспечивающие синтез последовательности энхансера трансляции MASMT [15], гомополимерного пептида H6, который позволяет очистить продукт с использованием металл-хелатной хроматографии, и полипептид SUMO, выступающий эффективным катализатором фолдинга - образующегося белка, и создающий возможность последующего отщепления N-концевого полипептида протеазой SUMO с сохранением на-тивной первичной последовательности белка PAL.
По результатам электрофоретического анализа в денатурирующих условиях было установлено, что белок, экспрес-сируемый клетками E. coli BL21 (DE3), трансформированными плазмидой pET22-His-SUMO-PAL, имеет вес ~30 кДа и накапливается как в растворимой, так и в нерастворимой фракции. Сравнение уровня продукции белка в растворимой и нерастворимой формах показало, что белок присутствует в обеих фракциях приблизительно в равных количествах. В связи с высокой продуктивностью растворимой формы PAL выделение рекомбинантного белка His-SUMO-PAL проводили из осветлённого лизата бактериальных клеток. В результате обработки очищенного His-SUMO-PAL протеазой SUMO получили 2 белковых фрагмента массой ~17 кДа (rPAL) и ~13 кДа (HIS-SUMO) (рис. 1). Меньший вес rPAL (17 кДа) по сравнению с нативным PAL (19 кДа) объясняется отсутствием сигнальной последовательности.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Процентное содержание Т- и В-лимфоцитов, экспрессирующих CD69 или CD25-молeкулу
Группа мышей
Процентное содержание активированных лимфоцитов*, % интактные иммунизированные rPAL с адъювантом Фрейнда иммунизированные адъювантом Фрейнда
доза rPAL, мкг/мл
0 10 0 10 0 10
CD19+ CD69+ 3,11 2,97 2,81 5,28 2,65 3,12
CD3+ CD69+ 4,24 3,39 5,79 11,53 5,01 4,95
CD3+CD8+ CD69+ 2,07 1,98 2,45 4,38 2,42 2,78
CD3+CD4+ CD69+ 1,98 2,41 1,82 8,26 2,55 2,36
CD19+ CD25+ 2,41 3,56 3,15 12,06 2,59 3,14
CD3+ CD25+ 6,01 8,14 6,94 33,10 6,43 7,98
CD3+CD8+ CD25+ 2,36 2,99 2,01 4,58 1,57 2,14
CD3+CD4+ CD25+ 4,56 5,67 5,06 28,09 5,45 6,47
Примечание.*-n = 5.
Разработанная методика получения белка rPAL позволила получить белок-предшественник His-SUMO-PAL с применением простой и быстрой двустадийной хроматографической очистки на металл-хелатной и анионообменной смолах. По результатам электрофоретического анализа, после 2-часовой выдержки большого избытка белка His-SUMO-PAL (1000 частей к 1 части протеазы) с протеазой SUMO происходит полное расщепление предшественника без остатка (см. рис. 1, дорожка 4). Фильтрация продуктов протеолиза осуществляется через металл-хелатную смолу, при этом происходит эффективное отделение пептида His-SUMO, который задерживается ионами Ni2+ от нетэгированного белка rPAL, обладающего нативной первичной структурой. Удаление примесей, выделение структурно гомогенной фракции белка и перевод в конечный буфер осуществляется эксклюзионной хроматографией.
Разработанная методика позволяет получить препарат с чистотой 98%, согласно данным денситометрии. Выход белка rPAL, отщеплённого из состава рекомбинантного белка His-SUMO-PAL, составил 0,3 г с 1 литра бактериальной культуры.
Отсутствие токсичности rPAL было показано на клеточной линии J774 и лимфоцитах мышей в МТТ-тесте и с использованием прижизненного окрашивания клеток 7-AAD красителем (количество жизнеспособных клеток, инкубировавшихся совместно с rPAL, составило 95 - 97%).
Иммуногенность rPAL оценивали по способности антигена индуцировать синтез антител, активировать Т- и В-лимфоциты. Титры специфических антител у мышей, иммунизированных rPAL, составили 1:64000, причём антитела распознавали нативный PAL в иммуноблоте. Способность rPAL специфически активировать Т- и В-лимфоциты была подтверждена в экспериментах in vitro, проведённых на культурах спленоцитов, полученных от интактных и иммунных мышей. В качестве маркёров активации клеток оценивали уровень экспрессии CD69 и CD25 молекулы на поверхности клеток, отражающие этапы ранней (через 16 - 18 ч) и более поздней (через 48 ч) активации, соответственно. CD69 способствует запуску активационных процессов, для продолжения которых необходимы дополнительные сигналы, а появление молекулы CD25 на поверхности клеток позволяет сделать заключение о нарастании активации лимфоцитов. Появление молекулы CD25+ на поверхности В-лимфоцитов отражает не только активацию клеток, усиление их антиген-
презентирующих свойств, но и дифференцировку в клетки памяти [16].
Результаты исследований показали, что под влиянием rPAL активируются как Т-, так и В-лимфоциты, но только в группе иммунных мышей (см. таблицу, рис. 2), что показывает способность rPAL индуцировать специфические иммунные реакции и образование клонов памяти лимфоцитов, способных к быстрому иммунному ответу. В ответ на стимуляцию rPAL в группе иммунных мышей увеличивается количество CD3+CD4+ CD69+ (в 4,5 раза) и CD3+CD8+ CD69+ (в 1,7 раз) лимфоцитов, что свидетельствует о способности антигена активировать обе субпопуляции: Т-хелперы и цито-токсические лимфоциты.
Нативный PAL способен индуцировать синтез антител и специфически активировать Т- и В-лимфоциты [17, 18]. На основании полученных результатов, отражающих наличие иммуногенной активности у rPAL, можно сделать заключение о сохранении нативной структуры рекомбинантным антигеном аналогичной PAL L. pneumophila.
Заключение
В рамках проведенной работы был создан новый эффективный способ конструирования продуцента, обеспечивающий получение белка в растворимом состоянии. Увеличение выхода белка-предшественника в растворимой форме было достигнуто за счёт химеризации белка PAL L. pneumophila с пептидом, расщепляемым SUMO. Разработана эффективная система хроматографической очистки белка, позволяющая получить белок 98%-ной чистоты с выходом 0,3 г с литра бактериальной культуры.
Полученный рекомбинантный белок rPAL специфически активирует Т- и В-лимфоциты и индуцирует синтез антител, распознающих нативный PAL в иммуноблоттинге, и нетоксичендля иммунокомпетентных клеток, что позволяет рассматривать его в качестве возможного компонента при конструировании вакцины против легионеллёзной инфекции. Способность rPAL индуцировать синтез специфических антител позволяет использовать этот белок для получения моноклональных антител с целью создания диагностического препарата, выявляющего легионеллезную инфекцию у людей на ранних стадиях заболевания, в том числе обусловленную инфицированием L. pneumophila не только первой серогруппы, но и другими видами патогенных Legionella.
Финансирование. Работа выполнена в рамках НИР 054 «Разработка нового поколения высокоэффективных тест-систем для детекции возбудителей нозокомиалъных инфекций на основе метода иммуно-аптамерной ПЦР».
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-12, 15-18 см. REFERENCES)
13. Зурочка А.В., Хайдуков С.В., Кудрявцев И.В., Черешнев В.А. Проточная цитометрия в биологии. Екатеринбург: РИО УрО РАН; 2014: 576.
14. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Медгиз; 1962.
REFERENCES
1. Benin A.L., Benson R.F., Besser R.E. Trends in Legionnaires Disease, 1980-1998: Declining Mortality and New Patterns of Diagnosis. Clin. Infect. Dis. 2002; 35(9): 1039-46. doi:10.1086/342903.
2. St-Martin G., Uldum S., M0lbak K. Incidence and prognostic factors for Legionnaires' disease in Denmark 1993-2006. ISRN Epidemiol. 2012; 2013. doi: 10.5402/2013/847283.
3. Bruin J.P., Diederen B.M.W. Evaluation of Meridian TRU Legionella, a new rapid test for detection of Legionella pneumophila serogroup 1 antigen in urine samples. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2013; 32(3): 333-4. doi:10.1007/s10096-012-1745-0.
4. Murdoch D.R., Podmore R.G., Anderson T.P., Barratt K., Maze M.J., French K.E. et al. Impact of Routine Systematic Polymerase Chain Reaction Testing on Case Finding for Legionnaires' Disease: A Pre-Post Comparison Study. Clin. Infect. Dis. 2013; 57(9): 1275-81. doi:10.1093/cid/cit504.
5. NNDSS, Annual Report Writing Group. Australia's notifiable disease status, 2011: annual report of the National Notifiable Diseases Surveillance System. Communicable diseases intelligence quarterly report. 2013; 37(4): E313.
6. Yu V.L., Plouffe J.F., Pastoris M.C., Stout J.E., Schousboe M., Widmer A. et al. Distribution of Legionella Species and Serogroups Isolated by Culture in Patients with Sporadic Community-Acquired Legionellosis: An International Collaborative Survey. J. Infect. Dis. 2002; 186(1): 127-8. doi:10.1086/341087.
7. Kim M.J., Sohn J.W., Park D.W., Park S.C., Chun B.C. Characterization of a lipoprotein common to Legionella species as a urinary broad-spectrum antigen for diagnosis of Legionnaires' disease. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(7): 2974-9. doi: 10.1128/jcm.41.7.2974-2979.2003.
8. Shim H.K., Kim J.Y., Kim M.J., Sim H.S., Park D.W., Sohn J.W. et al. Legionella lipoprotein activates toll-like receptor 2 and induces cytokine production and expression of costimulatory molecules in peritoneal macrophages. Exp. Mol. Med. 2009; 41(10): 687. doi:10.3858/emm.2009.41.10.075.
9. Lee S.Y., Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA. Biotechniques. 1990; 9(6): 676-9.
10. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259): 680-5. doi:10.1038/227680a0.
ORIGINAL ARTICLE
11. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-54. doi:10.1006/ abio.1976.9999.
12. Caligan J.E. Short protocols in immunology. Wiley. 2005; 730.
13. Zurochka A.V., Hajdukov S.V., Kudrjavcev I.V., Chereshnev V.A. Flow cytometry in biology. [Protochnaya tsitomitriya v biologii]. Ekaterinburg: RIO UB RAS; 2014: 576. (in Russian)
14. Ashmarin I.P., Vorob'ev A.A. Statistical methods in microbiological studies. [Statisticheskie metody v mikrobiologicheskikh issledovani-yakh]. Medgiz; 1962. (in Russian)
15. Xia Y., Luan P. Methods and DNA constructs for high yield production of polypeptides. Patent WO. 2003100022; 2003.
16. Amu S., Gjertsson I., Tarkowski A., Brisslert M. B-cell CD25 Expression in Murine Primary and Secondary Lymphoid Tissue. Scand. J. Immunol. 2006; 64(5): 482-92. doi:10.1111/j.1365-3083.2006.01832.x.
17. Godlewska R., Wis'niewska K., Pietras Z., Jagusztyn-Krynicka E.K. Peptidoglycan-associated lipoprotein (Pal) of Gram-negative bacteria: function, structure, role in pathogenesis and potential application in immunoprophylaxis. FEMS Microbiol Lett. 2009; 298(1): 1-11. doi:10.1111/j.1574-6968.2009.01659.x.
18. Shim H.K., Kim J.Y., Kim M.J., Sim H.S., Park D.W., Sohn J.W. et al. Legionella lipoprotein activates toll-like receptor 2 and induces cytokine production and expression of costimulatory molecules in peritoneal macrophages. Exp. Mol. Med. 2009; 41(10): 687. doi:10.3858/emm.2009.41.10.075.
Поступила 03.09.17 Принята в печать 16.12.17
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК 615.37:547.962.4].012
Фомина Е.Г., Счеслёнок Е.П., Семижон П.А., Школина Т.В., Григорьева Е.Е., Ткачёв С.В., Владыко А.С.
ПОЛУЧЕНИЕ, ОЧИСТКА И АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОГО ПОЛИПЕПТИДА, ВКЛЮЧАЮЩЕГО СН2-СН3 ДОМЕНЫ FС-ФРАГМЕНТА ИММУНОГЛОБУЛИНА G ЧЕЛОВЕКА
Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь, 220114, г. Минск, Беларусь
Получен рекомбинантный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность СН2-СН3 доменов иммуноглобулина G человека, в клетках Escherichia coli. Показано, что экспрессируемый белок неравнозначно распределён между двумя фракциями бактериального лизата: растворимой (~30%) и нерастворимой (~70%). Отработаны способы его очистки с помощью металлохеллатной хроматографии (растворимая фракция) и выделение «телец включения». Подтверждены антигенные свойства полученного рекомбинантного полипептида в иммуно-блоттинге. Наработаны препаративные количества белка, который будет использован в качестве иммуногена для получения иммуноасцитических жидкостей, содержащих моноспецифические поликлональные антитела против IgG человека.
Ключевые слова: рекомбинантная плазмидная ДНК; Fc-фрагмент; рекомбинантные СН2-СН3 домены иммуноглобулина G человека; экспрессия рекомбинантных белков; металлохеллатная хроматография.
Для цитирования: Фомина Е.Г., Счеслёнок Е.П., Семижон П.А., Школина Т.В., Григорьева Е.Е., Ткачёв С.В., Владыко А.С. Получение, очистка и антигенные свойства рекомбинантного полипептида, включающего СН2-СН3 домены Fс-фрагмента иммуноглобулина G человека. Иммунология. 2018; 39(1): 55-61. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-55-61
Fomina E.G., Scheslenok E.P., Semizhon P.A., Shkolina T.V., Grigorieva E.E., Tkachov S.V., Vladyko A.S. PRODUCTION, PURIFICATION AND ANTIGENIC SPECIFICITY OF RECOMBINANT POLYPEPTIDE INCLUDING CH2-CH3 DOMAINS OF FC-FRAGMENT OF HUMAN IMMUNOGLOBULIN G
State Institution «The Republican Research and Practical Center for Epidemiology and Microbiology», Ministry of Health of the Republic of Belarus, 220114, Minsk, Belarus
Для корреспонденции: Фомина Елена Георгиевна, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии и иммунодиагностики особо опасных инфекций государственного учреждения «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии», кандидат биологических наук. E-mail: feg1@tut.by
