CC BY
81
УДК 602.64:578.2
Гибридный белок на основе второй субъединицы гемагглютинина вирусов гриппа формирует
перекрестный иммунитет
Л. А. Степанова*, М. В. Сергеева, М. А. Шуклина, А. А. Шалджян, М. В. Потапчук, А. В. Коротков, Л. М. Цыбалова
Научно-исследовательский институт гриппа МЗ РФ, 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф.
Попова, 15/17
*E-mail: stepanoval60@mail.ru
Поступила в редакцию 21.09.2015
Принята к печати 08.02.2016
РЕФЕРАТ Консервативные участки второй субъединицы гемагглютинина (НА2) представляют интерес для дизайна вакцинных конструкций, способных обеспечить протективный иммунитет против вирусов гриппа А различных подтипов. На основе флагеллина и высококонсервативного фрагмента НА2 (35-107) вирусов гриппа подтипа А/Н2^, содержащего В-клеточные, CD4+ Т-клеточные, а также CD8+ Т-клеточные эпитопы, сконструирован гибридный рекомбинантный белок FlgMH. Нативная конформация фрагмента НА2 частично сохранялась при присоединении к С-концу флагеллина в составе гибридного рекомбинант-ного белка FlgMH. Показано, что FlgMH стимулирует формирование смешанного ТМ/^2-ответа на целевую последовательность, перекрестно реагирующих антител, связывающихся с вирусами гриппа первой филогенетической группы (Н1, Н2, Н5), и индукцию специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+ИФН-Y+). Иммунизация рекомбинантным белком защищала животных от летальной гриппозной инфекции. Сконструированный белок FlgMH перспективен для включения в противогриппозную вакцину широкого спектра действия, способную стимулировать Т- и В-клеточный иммунный ответ. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА вакцина, грипп, НА2, рекомбинантный белок, флагеллин.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ НА2 - вторая субъединица гемагглютинина; Flg - флагеллин; FlgMH - гибридный белок, включающий флагеллин и консервативный участок НА2 вирусов гриппа А/Н2^; БАЛ - бронхоаль-веолярный лаваж; ИФА - иммуноферментный анализ; ОП - оптическая плотность; СГТ - среднегеометрический титр; TLR5 - То11-подобный рецептор 5; МНС - главный комплекс гистосовместимости.
ВВЕДЕНИЕ
Вируснейтрализующие антитела предотвращают инфекцию, блокируя прикрепление вируса гриппа к клеточной поверхности. Действие этих антител направлено, главным образом, на эпитопы первой иммунодоминантной высоковариабельной субъединицы гемагглютинина (НА1). Узкая специфичность нейтрализующих антител делает существующие вакцины неэффективными против дрейфовых вариантов вируса гриппа и против вновь появляющихся вирусов с пандемическим потенциалом. Т-клеточный иммунитет вносит существенный вклад в очищение организма от вируса и обеспечивает легкое течение инфекции, поэтому для достижения более полного контроля над гриппозной инфекцией желательно иметь вакцины, индуцирующие не только гуморальный, но и Т-клеточный ответ. Разработка вакцин,
основанных на консервативных антигенах, которые усиливают как гуморальный, так и клеточный ответ, является универсальной стратегией контроля эпидемий и пандемий.
Гемагглютинин вируса гриппа - белок, синтезируемый в виде предшественника (НА0), который триме-ризуется в эндоплазматическом ретикулуме и транспортируется на клеточную поверхность через аппарат Гольджи. Гемагглютинин (НА0) посттрансляционно разрезается хозяйскими протеазами на две субъединицы - НА1 и НА2, которые остаются связанными одним дисульфидным мостиком [1]. В отличие от НА1, вторая субъединица гемагглютинина (НА2) относительно консервативна среди штаммов вируса и отвечает за слияние вирусной и клеточной мембраны в эндосомах, обеспечивая таким образом попадание рибонуклеинового комплекса в цитоплазму [2].
Иммунизация традиционными вакцинами и естественная гриппозная инфекция не приводят к образованию значительного количества анти-НА2-антител, что связано с низкой иммуногенностью стеблевого участка НА2 в присутствии иммунодо-минантных рецепторсвязывающих регионов НА1 [3]. Однако в последнее время выделен ряд моноклональ-ных антител (от мышей, человека), которые реагируют с эпитопами, локализованными в стеблевой части НА. Это перекрестно реагирующие антитела, которые нейтрализуют подтипы вируса гриппа в пределах филогенетической группы, обеспечивая, таким образом, широкий спектр защиты [4—11].
Моноклональные антитела, специфичные к регионам НА2 1-38 (CF2), 125-175 (FE1), способны ин-гибировать in vitro слияние вирусной и клеточной мембран. Внутривенное введение моноклональных антител CF2 и FE1 за 2 ч до заражения мышей Balb/c гомологичным и гетерологичным вирусами гриппа А/ H3N2 в дозе 1LD50 обеспечивало 100% выживаемость опытных животных [6]. Моноклональное антитело CR6261, специфичное к гидрофобному карману стеблевой части НА2, ингибировало рН-индуцируемое конформационное изменение НА вирусов гриппа H1N1, H5N1 и обладало нейтрализующей активностью [4, 5]. Показано, что моноклональное антитело CR6261 взаимодействовало преимущественно с а-спиралью НА2, а также с соседними аминокислотными остатками НА2 и НА1. Большинство аминокислот в малой а-спирали НА2, которые взаимодействуют с CR6261, у подтипов вирусов гриппа первой филогенетической группы идентичны более чем на 99% (различия в 1-5 аминокислотных остатках). Моноклональное антитело CR6261 предотвращало конформационный переход НА при низких значениях рН, т.е. нейтрализовало вирус, стабилизируя на-тивное состояние НА и предотвращая рН-зависимое слияние вирусной и клеточной мембран. Выделено анти-Н3^-моноклональное антитело 12D1, которое взаимодействовало с высококонсервативной большой а-спиралью НА2 (остатки 76-106), обладало нейтрализующей способностью и связывалось с вирусами гриппа подтипа H3N2, циркулировавшими с 1968 по 2003 г. [8].
В последние годы разработан ряд кандидатных вакцин на основе НА2 вирусов гриппа А филогенетической группы II [12-14]. Показана их им-муногенность и эффективность в защите от заражения летальными дозами гомологичного и гетерологичного вирусов одной филогенетической группы. Предполагается, что конструирование антигена, формирующего иммунный ответ на консервативные эпитопы НА2, может служить основой для вакцины широкого спектра действия, обладаю-
щей профилактической и терапевтической эффективностью.
Целью данной работы было моделирование и создание гибридного рекомбинантного белка, содержащего перспективные Т- и В-клеточные эпитопы НА2 вирусов гриппа A/H2N2, изучение его иммуноген-ности и протективного действия. В качестве основы гибридного белка выбран флагеллин - мукозаль-ный адъювант, который усиливает иммунный ответ на присоединенные к нему антигены.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Выбор консервативного участка НА2 вирусов гриппа А/Ш^
Поиск аминокислотных последовательностей для анализа проводили в базе данных GenBank, построение выравниваний осуществляли с использованием программного обеспечения Vector NTI v10.0 (Invitrogen, США). Поиск вероятных Т-клеточных эпитопов осуществляли с использованием NetCTLpan1.1 Server [15] и параметров поиска, установленных по умолчанию. Поиск экспериментальных B- и CD4+ T-клеточных эпитопов, гомологичных участкам НА2, проводили в базе данных Immune Epitope Database [16]. Визуализацию трехмерной структуры белков выполняли в программе Chimera 1.5.3 [17]. Для гомологичного моделирования трехмерной структуры белка по первичной последовательности использовали открытый веб-ресурс Phyre2 [18].
Конструирование экспрессионных векторов и создание штаммов-продуцентов Escherichia coli Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибридный рекомбинантный белок FlgMH, оптимизировали для экспрессии в E. coli, синтезировали и встраивали в вектор pQE30 по сайтам рестрикции BamHI и HindIII. Для создания белков Flg (флагеллин) и MH (фрагмент гемагглютинина) соответствующие нукле-отидные последовательности амплифицировали с использованием праймеров, несущих концевые сайты рестрикции BamHI и HindIII, и затем встраивали в поликлональный сайт вектора pQE30. Для получения штаммов-продуцентов рекомбинантных белков плазмидами pQE30/FlgMH, pQE30/MH, pQE30/Flg трансформировали клетки E. coli DLT1270. Штамм DLT1270, производное штамма DH10B [19], содержит ген репрессора лактозного оперона lacI, интегрированный в хромосому.
Выделение и очистка рекомбинантных белков
Штаммы E. coli DLT1270, трансформированные векторами pQE30/FlgMH, pQE30/Flg и pQE30/MH, на-
капливали в среде LB с ампициллином, экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ IPTG. Клетки обрабатывали лизоцимом, рекомбинантные белки очищали из клеточного лизата с помощью металлоаф-финной хроматографии на Ni-сорбенте.
Электрофорез и иммуноблотинг
Электрофорез в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) проводили в денатурирующих условиях по методу Лэммли [20]. Пробы смешивали с буфером для внесения, содержащим ß-меркаптоэтанол, кипятили в течение 7 мин и наносили в градиентный 8-16% ПААГ. Электрофорез проводили в течение 1.5 ч при 10-12 мА. Гель фиксировали 10% уксусной кислотой и окрашивали Кумасси G-250 в течение 18 ч.
Горизонтальный перенос белков из ПААГ на ни-троцеллюлозную мембрану (BioRad, США) осуществляли в TB-буфере (0.03 М глицин, 0.04 М трис, 0.037% додецилсульфат Na, 20% этанол) с использованием системы Mini Trans-Blot cell (BioRad, США) в охлаждаемой камере при +4°С в течение 1.5 ч при постоянном токе 200 мА. Затем мембрану блокировали в 3% растворе БСА (бычий сывороточный альбумин, Amresco, ЕС) в фосфатно-солевом буфере (ФБР) в течение ночи при комнатной температуре. Мембрану инкубировали 1 ч при комнатной температуре с первичными антителами, разведенными в ФБР с 0.1% Твин 20 (ФБРТ) и 3% БСА, затем отмывали в ФБРТ. Флагеллин окрашивали кроличьими поликлональны-ми антителами (Abcam, Великобритания) в разведении 1 : 16000. Для окрашивания фрагмента гемагглю-тинина использовали кросс-специфичную сыворотку, полученную трехкратной последовательной иммунизацией мышей сублетальными дозами вирусов гриппа А филогенетической группы I (H2, H5 и H1pdm), в разведении 1 : 2000. Белки выявляли окрашиванием мембраны в течение 1 ч при комнатной температуре вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (козьи антикроличьи IgG либо козьи антимышиные IgG, Invitrogen, США), в разведении 1 : 2000 и последующей инкубацией в течение 15 мин с субстратом TMB (тетраметилбензидин) Immunoblot solution (Invitrogen, США).
Иммунизация мышей
Иммуногенность рекомбинантного белка FlgMH исследовали на линейных мышах ВаШ/c и C57Bl/6 (самки, возраст 6-8 недель, масса 18-20 г), полученных из питомника «Столбовая» ГУ научный центр биомедицинских технологий РАМН. Животных содержали в виварии ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России в соответствии с действующими правилами. Мышей (16 особей) иммунизировали рекомбинант-ным белком FlgMH интраназально (после ингаляци-
онной анестезии 2-3% изофлюран, 30% O2, 70% N2O) трехкратно с двухнедельным интервалом в дозе 10 мкг/мышь в объеме 50 мкл. Контрольной группе мышей (16 особей) вводили рекомбинантный белок Flg интраназально трехкратно с двухнедельным интервалом в дозе 10 мкг/мышь.
Получение сывороток и БАЛ
Образцы крови получали от пяти мышей опытной и контрольной групп через 2 недели после последней иммунизации, после эвтаназии в С02-камере (Vet Tech Solutions, Великобритания). Для получения сыворотки кровь инкубировали в течение 30 мин при температуре 37°С. После образования сгустков крови образцы помещали на поверхность льда и охлаждали в течение 1 ч с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 400д. Аликвоты сыворотки крови (по 30 мкл) замораживали при температуре -20С.
Бронхоальвеолярные лаважи (БАЛ) получали от пяти мышей каждой группы через 2 недели после последней иммунизации после эвтаназии животных в С02-камере. Труп животного фиксировали на операционном столике брюшком кверху. Производили разрез кожи по средней линии от нижней челюсти. В нижнюю часть трахеи в направлении легких вводили катетер на глубину 3-5 мм. Дважды промывали бронхи и легкие 1 мл ФБР. БАЛ центрифугировали в течение 15 мин при 400д, отбирали аликвоты надо-садка и замораживали их при температуре -20С.
Получение спленоцитов мыши
Спленоциты мыши получали в соответствии с протоколом BD Pharmingen™. На 14-й день после последней иммунизации мышей опытной и контрольной групп (по три мыши из каждой группы) подвергали эвтаназии с помощью С02-камеры. Селезенки мышей извлекали асептически, гомогенизировали с использованием Medimachine (BD Biosciences, США) и избавлялись от дебриса путем фильтрации через шприцевые фильтры с диаметром пор 70 мкм (Syringe filcons, BD Biosciences, США). Эритроциты лизировали ACK-буфером (0.15 M NH4Cl, 1.0 М KHCO3, 0.1 мМ Na2EDTA, pH 7.2-7.4), спленоциты отмывали полной средой RPMI-1640 с 10% ЭТС, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Жизнеспособность клеток оценивали окрашиванием 0.4% раствором трипанового синего. Концентрацию клеток доводили до 2 х 106 кл/мл.
Синтетические пептиды
Иммуногенность рекомбинантных белков оценивали с использованием следующих синтетических пептидов, синтезированных НПО «Верта»:
G-47 (24 аминокислоты): AADKESTQKAF-DGITNKVNSVIEK - малая а-спираль НА2 (35-58); G-48 (15 аминокислот): MNTQFEAVGKEFSNL -«расплетенный» в нативном неактивированном ге-магглютинине «линкерный» участок НА2 (59-72); G-49 (34 аминокислоты): ERRLENLNKKMEDGFL-DVWTYNAELLVLMENERT - часть большой а-спирали НА2 (73-107).
Иммуноферментный анализ
ИФА проводили общепринятым методом. 96-луноч-ные планшеты с высокой сорбционной способностью (Greiner, Германия) покрывали рекомбинантным белком FlgMH в концентрации 5 мкг/мл или очищенными вирусами A/Singapore/1/57 (H2N2), A/PR/8/34 (H1N1), A/Aichi/2/68 (H3N2), A/ Kurgan/05/2005/RG (H5N1) в концентрации
2 мкг/мл, сорбцию проводили в ФБР рН 7.2 в течение ночи при 40С. После сорбции вирусов часть планшетов заливали на 30 мин цитратным буфером (рН 5.0), затем 1 раз отмывали ФБР. Планшеты обрабатывали блокирующим буфером (0.01 М ФБР, pH 7.2 с 5% ЭТС) в течение 1 ч при комнатной температуре, отмывали
3 раза ФБРТ. В лунки планшетов добавляли 100 мкл двукратных разведений сывороток (начиная с 1 : 400) в блокирующем буфере, инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Использовали конъюга-ты козьих поликлональных антимышиных IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA (Abcam, Великобритания) с пероксидазой хрена в разведении 1 : 20000. В качестве субстрата использовали ТМБ (BD Bioscience, США), инкубация 15 мин. Оптическую плотность (ОП) измеряли с использованием микропланшетного ридера i-Mark (Bio-Rad) при длине волны 450 нм. За титр принимали наибольшее разведение сыворотки, которое дает оптическую плотность, по крайней мере, в 2 раза большую, чем среднее значение бланка.
Проточная цитометрия
Мультипараметрическую проточную цитоме-трию выполняли в соответствии с протоколом BD Pharmingen™. Определяли способность синтетических пептидов G-47, G-48, G-49 и вируса гриппа A/Singapore/1/57 (H2N2) активировать продукцию ИФН-у специфическими CD8+ Т-лимфоцитами в селезенке. Спленоциты мышей Ва1Ь/с и C57B1/6 получали на 14-й день после последней иммунизации, 2 х 106 спленоцитов мышей опытных и контрольных групп стимулировали (в течение 6 ч при 370C) 10 мкг пептидов G-47, G-48, G-49 или 1 мкг вируса A/Singapore/1/57 (H2N2) в присутствии брефел-дина А (1 мкг/мл) (BD Bioscience, США). Клетки отмывали, Fc-рецепторы блокировали антителами
CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, BD Pharmingen, США) и окрашивали флуоресцентно меченными антителами анти-CD3а-FITC, анти-CD8-PerCP (BD Pharmingen, США) при 4°C в течение 30 мин. Затем клетки пермеабилизировали в соответствии с протоколом тест-системы Cytofix/Cytoperm Plus (BD Bioscience, США) и окрашивали флуоресцентно меченными антителами анти-ИФНу-PE (BD Pharmingen, США). Интенсивность флуоресценции измеряли на проточном цитофлуориметре BD FACS Canto II (Becton Dickinson, США). Результаты анализировали с использованием программного обеспечения BD FACS Diva версия 6.1.3 (BD Bioscience, США).
Вирусы и заражение мышей
В работе использованы штаммы, полученные из Коллекции вирусов гриппа и ОРЗ лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России - А/ Singapore/1/57 (H2N2), A/PR/8/34 (H1N1), A/ Aichi/2/68 (H3N2) и A/Kurgan/05/2005/RG (H5N1). В экспериментах с летальным заражением использовали адаптированный к репродукции в легких мышей вариант вируса гриппа А/Singapore/1/57 (H2N2), полученный в лаборатории гриппозных вакцин ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России. Вирусы накапливали в 10-12-дневных развивающихся куриных эмбрионах и очищали методом ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы.
Иммунизированных мышей (по 11 мышей в опытной и контрольной группах) заражали адаптированным к мышам вирусом гриппа A/Singapore/1/57 (H2N2) в дозе 2LD50. Вирус вводили интраназально в объеме 50 мкл/мышь после ингаляционной анестезии (2-3% изофлюран, 30% O2, 70% N2O). После заражения проводили ежедневное наблюдение за животными. Протективное действие FlgMH оценивали по двум параметрам: динамика падения массы тела и выживаемость мышей после заражения.
Статистическая обработка
Статистическую обработку данных проводили в программе GraphPad Prizm v5.1. Статистическую значимость различий титров антител оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Сравнение показателей выживаемости проводили с использованием критерия Мантела-Кокса. Различия считали значимыми при р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор и построение MH-фрагмента консенсусной последовательности НА2 вирусов гриппа A/H2N2
По результатам выравнивания консенсусных последовательностей НА2 найдены два протяженных
л
1
HI (1)
H2 (It
НЗ (1)
Н5 И)
Hlpdm (1)
Н7 (ijj
HI (61)
H2 (61)
НЗ (61)
Н5 (61)
Hlpdre (61)
Н7 (61)
HI (121)
Н2 (121)
НЗ (121)
Н5 (121)
Hlpdm (121)
Н7 (121)
HI (181)
Н2 (181)
НЗ (181)
Н5 (181)
Hlpdm (181)
Н7 (181)
GLFGAIAGFIEGGWTGMIEGWYGY GLFGAI AGFIEGGWQGMVDGW YG Y GIFGAIAGFIENGWE GMVDGWYGF GLFGAIAGFIEGGWQGMVD6WYGY G LFGAXAGFIEGGWTGMVDGWYGY
60
iHQNEQGSG YAADQK $ TQHAIXGIT8K VN S VIE KMN jHSMDQGSGYAADKESTQKAIDGITHKVKSVIEKMN * HQN ЗЁGTGQAAD LKS TQAA Г XQIN GKLNRLIE KTN i HSNEQG $SYAADKE STQKAIDGVTNKVN SIIЕКШ 1HQNEQGSG YAADLK S TQNAIDXITN КVN SVIE KMN GLFGAIAG FIE M GWE GLIE G Я Y GFP.HQHAQGEGT AADYK S TQS AIDQIT G К LN RLIEKTN 61 120 TQ FT AVGKE FNXL E RRIE N LNKK V BDGEILDIWTYNAE LLVLLENfeRTLDFHDSHVKNLYE T Q FEft VG KE FML ERRL EH LH KKME DG ELDVWTYNAELLVLMENiRTLDFHDSNVKWLYD Ei"F::QIEKEF.: EVEGRI; i LEKYVEDTK £DLWSYNAELLVALEN JHTIDLTDSEMSKLFB TQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGE LDVWTYNAELLVLMEN CRTLDFHDSNVKNLYD TQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGE LDIWTYNAELLVLLEN SRT L D Y H DSNVKMLYE QQFELIDNE FMEVEKQIGtrVI И WXRDSIFEVWS YMAE LLVftME ¡4: :-:TIDLADSEMEF.lye 121 180 kvksqlknkakeighgcfefyhkcxdecmesvkkgtydyfkyseesklnrexidgvkles к vrmq lrdk ak e i g№g fe f y h kg ddegmn и vrn g t y d y pk y e ё e s kln rk e i ^ g vk l : r;
RT RKQLRENAEDMGNGCFf-" I YHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFi; i KGVELKS
KVRLQLRDNAKELGN GG FE FYHKCDNE GME SVRNG TY DY PQ Y SE EARLNREEI£ GVK LE S
KVRS у LK:iK AKEIGM GC FE F Y HKC ШТ С ME S VKN G T Y D Y PK Y SE E AKLN REE I DG VK LE S
RVKRQLRi2»AE£DGT GCFEIFHKCOTtXMASIRSJ MT Y DHS KYREEAMQNR IQIDPVKL5S
181 223
MGVYQILAIYSTVAS SLVLL-VSLGA1ЁFWMCSNGSLQGRICI
MGVYQILAIYATVAGSLSLA-IMIAGISFWMGSNGSLQCR3CI
GP- YK DWIL® SFAISg'FLLC WLLGFIMHACQK GNIRCHICI
MGT YQIL SIYS TVAS S LALAXIMVA GL S LWMC SNG S LQCRIСI
TRIYQILAIYSTVASSLVLV-VSLGAISFWMCSMGSLQCRICI
G--YKDVILWFSFGASGFILLAIVMGLVFICVKMGNMP.CT1CI
/
AADKESTQkAFdgl TNKvNSvI EKmNtQFEaVgKEFsNLErRLeNLnKkiriEOG I I DVWTYNAE L LVLMENE R t
Б
В
. as m » иг w lit ж ж ж :я «з «2 <ш (re <oe tie tt2 4» tig its «о 122 124 12: (м «г i» 4J6 im 4« 442 444 ui
Рис. 1. A — выравнивание консенсусных последовательностей НА2 вирусов гриппа А различных подтипов. Два высококонсервативных участка с идентичностью последовательностей 78.3 и 62.5% соответственно выделены синими рамками. Подчеркнут фрагмент, выбранный для включения в состав гибридного белка. Б - трехмерная структура молекулы гемагглютинина (тример, модель 3WR7 Protein Data Bank). Красным выделен фрагмент НА2 (35-107) одного из мономеров. Основные участки: малая а-спираль (35-58); неструктурная область (5973); участок большой а-спирали, содержащий высококонсервативную область (74-107). В - степень консервативности аминокислот в участке HA2 (35-107) вирусов гриппа человека A/H2N2 (нумерация по НА0). Наименее консервативный Arg416 (58.3%) отмечен красной стрелкой
высококонсервативных участка: (1-24) и (89-104) (рис. 1А). Идентичность на первом участке составляет 78.3%, однако он содержит высокогидрофобный пептид слияния НА, склонный к образованию агрегатов. Несмотря на то что консервативность второго участка меньше (62.5%), большинство аминокислотных замен не сопряжено с изменением физико-химических свойств боковых радикалов, что позволяет надеяться на небольшое изменение способности к презентации на определенных аллелях HLA. Кроме того, консервативная последовательность YNAELLVL, входящая в данный участок, обнаруживается в большой части В- и CD4+ Т-эпитопов в НА2 (рис. 2А). Наиболее отличаются от консенсуса последовательности Н3 и Н7 (филогенетическая группа II), при исключении которых идентичность
на участке повышается до 87.5%. Для конструирования целевого гибридного рекомбинантного белка был выбран фрагмент консенсусной последовательности НА2 вирусов гриппа человека А/Н2^ (филогенетическая группа I).
В состав гибридного белка была включена консервативная область НА2 (89-104), а также малая а-спираль НА2 (35-58), выступающая на поверхность триммера, и потенциально доступная для связывания антителами (рис. 1Б). Для сохранения третичной структуры в состав гибридного белка FlgMH включен непрерывный фрагмент НА2 (35-107).
Фрагмент НА2 (35-107) вирусов гриппа Н2 человека обладает наибольшей однородностью по аминокислотному составу. Наиболее вариабельной аминокислотой (встречаемость 58.3%) является аргинин
л
Эпитоп
13172
19567
79805
79809
800-52
95623
96007
113324
122152
125912
125913 127161 130108 130227 144630 151060 151075 167880 167894 167981 168022 173555 182 4 01 188765 195290 225949
35 40 50 60 70 80 90 100
05050505050505 AADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQFEAVGKEFSNLERRLENLNKKKEDGFLDVWTYNAELLVLMENERT
ELLVLMENERTLDFHD GFLDVWTYNAELLVLMENER
EKMNTQFTAVGKE
SVIEKMNTQFTAV NKVNSVIЕ KMNTQFTAVG
SVIEKMNTQ FTAVGKE TNKVNSVIEKMNTQFTA
VIEKMNTQFTAVGKEFN
SVIEKMNTQFTAVGK
DKESTQKAFDGITNKVNSVI
NSVIEKMNTQFEAVGKEFSN
NKVNSVIEKMNTQFT TNKVNSVIEKMNTQFTAVGK FDGITNKVNSVIEKMNTQFE EITNKVNSVIEKMNTQFTAV
ELLVLLENERTLD
WTYNAELLVLLENERTLD DGFLDIWTYNAELLV
NAELLVLMENERTLDFHDSN ELLVLLENERTLDFHD3 ELLVLLENERTLDYHDS
ELLVLLENERTLDYHDSNVK
YNAELLVLLENERTL
EDGFLDVWTYNAELLVLMEN
TYNAELLVLMENERTLDFHD TYNAELLVLMENERTLDF
Б
Фрагмент MH
Аллель (супертип)
А1
А2
А2
A3
A3
A3
А24
А26
В7
В8
В27
В27
В27
В39
В44
В44
В44
В4 4
В58
В62
35 40 50 60 70 80 90 100
05050505050505 AADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQFEAVGKEFSNLERRLENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERT
MEDGFLDVWTY
FLDVWTYNA FLDVWTYNAEL
KVNSVIEK KAFDGITNK KMNTQFEAVGK
IТЙKVNSVIEK
SVIEKMNTQF
RLENLNKK
TYNAELLVL WTYNAELLVLM
RRLENLNK
RRLENLNKK
RRLENLNKKM
YNAELLVL
MEDGFLDV
FEAVGKEF
KEFSNLERRL FEAVGXEFSNL
MEDGFLDVWTY KMEDGFLDVW
SVIEKMNTQF
Рис. 2. Л - экспериментальные B- и CD4+ Т-клеточные эпитопы, гомологичные фрагменту консенсусной последовательности Н2 НА2 (35-107) не менее чем на 90%, результат поиска по базе данных IEDB. Б - потенциальные CD8+ Т-клеточные эпитопы в составе фрагмента НА2 (35-107) для репрезентативного набора аллелей HLA, результат анализа с использованием NetCTLpanl.1 Server [19]
л
Б
PT5
AmpR
His-tag ¡F~~ BamHI (146)
pQE30/FlgMH 5127bp
ColEI
FlgMH
HindIIl(l854)
75
35
Рис. 3. А - карта плазмиды, кодирующей белок FlgМН. ВатН1, Н^Ш - сайты клонирования гена, кодирующего белок FlgMH в поликлональный сайт вектора pQE30. Со1Е1 - участок начала репликации, РТ5 - Т5 промотор, AmpR - ген Р-лактамазы, маркер устойчивости к ампициллину, His-tag - N-концевой гистидиновый таг. Б - теоретическая модель трехмерной структуры мономера гибридного белка FlgMH: красным выделен фрагмент НА2 (35-107), фиолетовым - флагеллин, зеленым - гистидиновый таг
в положении 75 (позиция 415 в нумерации НА0), при этом в 41.7% в данном положении находится лизин (К). Обе аминокислоты положительно заряжены, боковой радикал аргинина крупнее и, следовательно, предпочтительнее для провокации гуморального иммунного ответа (рис. 1В).
Кроме того, последовательность НА2 (35-107) содержит участки, гомологичные экспериментальным В- и CD4+ Т-клеточным эпитопам, представленным в базе данных IEDB (рис. 2А). Теоретический поиск показал наличие множественных потенциальных CD8+ Т-клеточных эпитопов в составе фрагмента НА2 (35-107) для репрезентативного набора аллелей (рис. 2Б).
Дизайн гибридного рекомбинантного белка FlgMH
Химерный белок конструировали с использованием коммерческой плазмиды pQE30, содержащей перед сайтом клонирования старт-кодон и гистиди-новый таг. Гибридный белок FlgMH включал полноразмерную последовательность флагеллина ^ПС) без старт-кодона и целевую последовательность МН,
кодируемые одной рамкой считывания с гистидино-вым тагом (рис. 3А). Таким образом, рекомбинантный белок FlgMH состоял из флагеллина, к N-концу которого присоединен гистидиновый таг, а к С-концу -участок (35-107) консенсусной последовательности НА2 вирусов гриппа человека A/H2N2. Гомологичное моделирование трехмерной структуры FlgMH показало сохранение а-спирализации в участках MH, соответствующих фрагментам (38-56) и (75-107) в составе HA2 (рис. 3Б), из чего можно предположить, что большая часть нативной структуры сохранена, и гибридный белок будет стимулировать образование антител, в том числе к структурным эпитопам, характерным для нативного НА.
Получение и очистка рекомбинантных белков
Нуклеотидные последовательности, кодирующие гибридный белок FlgMH, а также его компоненты Flg и MH были клонированы в вектор pQE30 и экс-прессированы в штамме E. coli DLT1270 (рис. 4А). Теоретическая молекулярная масса белков составляла соответственно FlgMH - 61.3, Flg - 52.9,
А Б
Электрофорез Блот анти-Flg Блот анти-MH
MM FlgMH Flg MH pQE30 MM FlgMH Flg MH MM FlgMH Flg MH MM FlgMH Flg MH
Рис. 4. А - экспрессия рекомбинантных белков в клетках E. coli. 1 - набор белковых стандартов (Fermentas, ЕС), обозначен в кДа; 2—4 - лизат клеток, трансформированных плазмидой pQE30 с соответствующей вставкой; 5 - лизат клеток, трансформированных вектором pQE30 без вставки. Полосы, соответствующие рекомбинант-ным белкам, обозначены стрелками. Б — рекомбинантные белки FlgMH, Flg и МН после хроматографической очистки на Ni-сорбенте. Представлен результат электрофореза, а также Вестерн-блот с использованием поли-клональных антител к флагеллину (6—8) и антисыворотки к фрагменту МН (9—12)
MH - 9.8 кДа, что совпадало с их электрофоре-тической подвижностью в ПААГ (рис. 4Б). Белки FlgMH и Flg были хорошо растворимы в ФБР, в отличие от белка MH, который накапливался в тельцах включения и растворялся только в 2 М мочевине. Очищенные белки FlgMH и Flg взаимодействовали в Вестерн-блотинге с кроличьей поликлональной сывороткой к флагеллину, а белки FlgMH и MH - с мышиной кросс-специфичной сывороткой против НА вирусов гриппа филогенетической группы I (рис. 4Б).
Иммуногенность и протективность рекомбинантного белка FlgMH
Консенсусная последовательность НА2 (35-107), входящая в состав белка FlgMH, включает в себя В-, CD4+ и CD8+ Т-клеточные эпитопы, поэтому мы оценивали способность рекомбинантного белка FlgMH стимулировать как В-, так и Т-клеточный иммунный ответ.
Для исследования способности рекомбинантно-го белка FlgMH индуцировать образование НА2-специфических антител мышей Balb/c иммунизировали трехкратно интраназально белком FlgMH без адъюванта, контрольной группе мышей вводили белок Flg. Интраназальный путь введения антигена индуцирует формирование как системного, так и местного иммунного ответа. Поэтому на 14-е сутки после последней иммунизации мы определяли содержание IgA в сыворотке и БАЛ к целевому антигену, а также титры антител в сыворотке к вирусам гриппа первой и второй филогенетических групп, а также оценивали профиль подклассов IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3). Местный ответ обусловлен секреторным sIgA, мультимерная форма которого обладает эффективной антивирусной активностью, блокируя вирусную репликацию [21, 22]. Интраназальная иммунизация мышей рекомбинант-ным белком FlgMH стимулировала формирование
А Б В
Рис. 5. Титры антител у мышей опытной и контрольной групп через 2 недели после трехкратной иммунизации. А - титры 1дА-антител в сыворотке и БАЛ к целевому антигену МН. Б - СГТ подклассов IgG к целевому антигену МН у мышей опытной группы. В - СГТ IgG-антител в сыворотке к вирусам гриппа A/PR/8/34 (Н1Ж), А/ Singapore/1/57 (Н2№), А/АкЫ/2/68 (Н3№), А/Кигдап/05/2005 (Н5Ж). Для расчета значения р использован критерий Манна-Уитни
Рис. 6. Синтез ИФН-у CD8+ Т-клетками селезенки мышей после рестимуляции пептидами G-47, G-48, G-49 и вирусом гриппа А^тдароге/1/57 (Н2№) у мышей С57В1/6 (Л) и Ва1Ь/с (Б). Селезенки забирали у трех мышей опытной и контрольной групп через 14 дней после трехкратной иммунизации. * - отличие от контроля р < 0.05 (критерий Манна-Уитни)
высокого уровня анти-НА2 IgA в сыворотке и БАЛ иммунизированных животных (рис. 5А).
Известно, что тип иммунного ответа на флагеллин и рекомбинантные белки на его основе определяется формой флагеллина. Растворимый флагеллин (мономерный и полимерный) индуцирует иммунный ответ, специфичный к флагеллину и введенному с ним целевому антигену с сильным преобладанием ответа №2-типа [23-29]. Тогда как закрепленная в мембра-
не форма флагеллина вызывает преимущественно иммунный ответ ТЫ-типа [24, 28]. С другой стороны, показано, что тип иммунного ответа на целевой антиген зависит также от антигена, слитого с фла-геллином [23]. Как показано на рис. 5Б, иммунизация растворимым рекомбинантным белком FlgMH приводила к индукции практически одинакового уровня IgG1 (тип ответа №2), IgG2a и IgG2b (тип ответа ТМ) НА2-специфических антител: IgG1 - 40.0%,
Рис. 7. Изменение среднего веса (А) и кривая выживаемости Каплана-Мейера (Б) в группах иммунизированных мышей после заражения адаптированным вирусом гриппа А^тдароге/1/57 (Н2№) в дозе 2LD50. Мышей вакцинировали гибридным белком FlgMH или белком-носителем Flg, затем заражали летальным вирусом. За состоянием животных следили в течение 14 дней. Для расчета значения р использован критерий Мантела-Кокса
^2а - 30.3%, ^2Ь - 26.4%, ^3 - 3.3%. Отсутствие существенных различий подклассов IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b) к целевому антигену после иммунизации мышей рекомбинантным белком FlgMH предполагает формирование смешанного ТМ и №2 иммунного ответа.
Выбранная консенсусная последовательность НА2 (35-107) достаточно консервативна у вирусов гриппа первой филогенетической группы (87.5% гомологии), поэтому представлялось важным оценить формирование кросс-реактивных антител после иммунизации мышей белком FlgMH. По результатам ИФА НА2-специфические IgG, индуцируемые рекомбинантным белком FlgMH, связывались не только с вирусом гриппа субтипа А/Н2^ (среднегеометрический титр, СГТ = 12800), но и с другими подтипами вируса гриппа А первой филогенетической группы: Н1 (СГТ = 4160) и Н5 (СГТ = 2880) (рис. 5В). Однако титры антител к вирусам гриппа подтипов Н1 и Н5 были значимо ниже, чем к подтипу Н2 (р < 0.05, критерий Манна-Уитни). Кроме того, индуцируемые антитела связывались с гемагглютинином в нативной конформации (рН 7.2) и с кислой формой гемагглюти-нина (рН 5.0) с одинаковой интенсивностью (рис. 5В), что свидетельствует о доступности целевой последовательности НА2 на поверхности вириона для антител.
Способность рекомбинантного белка FlgMH индуцировать клеточный ответ определяли по про-
дукции ИФН-у CD3 + CD8+ Т-лимфоцитами селезенки после рестимуляции синтетическими пептидами ^-47, G-48, G-49), соответствующими целевой последовательности НА2 и очищенным вирусом гриппа А/Н2^. Показано, что число активированных ИФН-у секретирующих CD3 + CD8 + Т-клеток как у мышей линии Ва1Ь/с (гаплотип H-2d), так и у мышей линии С57В1/6 (гаплотип Н-2Ь), иммунизированных рекомбинантным белком FlgMH, было статистически значимо выше (р < 0.05, критерий Манна-Уитни), чем у мышей, иммунизированных белком-носителем флагеллином (рис. 6А,Б).
Флагеллин обеспечивает антигенспецифический CD4+ Т-клеточный ответ [30] через активацию TLR5, экспрессируемых на клетках CD11c+ [31], что приводит к сильному гуморальному ответу. Однако способность флагеллина стимулировать специфический CD8+ Т-клеточный ответ остается неясной. В ряде работ показано, что иммунизация мышей слитым белком (флагеллин-GFP, флагеллин-ОVA) стимулирует CD8+ ответ на антиген, в отличие от иммунизации только антигеном без флагеллина [26, 32]. С другой стороны, установлено, что растворимый флагеллин, слитый с антигеном, преимущественно индуцирует №2-ответ и не формирует антигенспе-цифических клеток CD8+ [23-36]. Для презентации в MHC-комплексе экзогенный антиген подвергается протеолитическому расщеплению, перед которым он должен быть развернут [33]. Восстановление дис-
ульфидных связей внутри белка является ключевым моментом в процессе развертывания [34], и кросс-презентация дендритными клетками антигена, содержащего дисульфидные мостики, зависит от экспрессии тиоловых редуктаз, индуцируемой ИФН-у [35]. Показано [36], что слияние MHC I ограниченных иммуногенных эпитопов с флагеллином может создать псевдоадъювантный эффект, который функционирует через усиление презентации антигена на поверхности клетки и не зависит от TLR5, MyD88 и консервативных регионов флагеллина. Это обусловлено более эффективным процессингом антигена, слитого с флагеллином, чем антигена в нативном состоянии, т.е. антиген, а не сигнал TLR5 является лимитирующим фактором при формировании CD8+ Т-клеточного ответа. Таким образом, флагеллин может быть платформой для вакцин, которые содержат слабопроцессирующиеся антигены, несущие CD8+ эпитопы [36].
Нами установлено, что растворимая форма фла-геллина, слитого с последовательностью НА235-107, содержащей CD8+ эпитопы, стимулирует формирование НА2-специфических CD8+ Т-клеток.
Способность рекомбинантного белка FlgMH защищать мышей показана при заражении иммунизированных животных летальной дозой (2LD50) адаптированного вируса гриппа A/Singapore/1/57 (H2N2). Иммунизация приводила к различию в динамике массы тела опытных и контрольных мышей, у иммунизированных мышей максимальная потеря массы тела составила 10%, у контрольных - 16.6% (рис. 7А). Иммунизация рекомбинантным белком FlgMH защищала мышей от заражения (рис. 7Б). Выживаемость в опытной группе составила 91.0%, в отличие от контрольной группы - 41%. Полученные различия были статистически значимыми (р = 0.0184, критерий Мантела-Кокса).
ВЫВОДЫ
Консервативные участки второй субъединицы НА представляют интерес для дизайна вакцинных кон-
струкций, способных обеспечить иммунитет широкого спектра действия против вирусов гриппа А. Гибридный рекомбинантный белок FlgMH на основе флагеллина и высококонсервативного фрагмента ге-магглютинина НА2 (35-107) вирусов гриппа подтипа А/Н2^ содержит потенциальные В-клеточные, а также CD4+ и CD8+ Т-клеточные эпитопы и сочетает адъювантную активность флагеллина, обусловленную его специфическим связыванием с TLR5, и консервативность участка стеблевой части молекулы гемагглютинина, которая участвует в конформа-ционных изменениях, ведущих к слиянию бислойных липидных мембран вируса и клетки-хозяина в процессе рН-индуцированной реакции слияния. Целевая последовательность, включающая малую а-спираль, фрагмент большой а-спирали и соединяющий их участок, входит в состав второй цепи гемагглютинина и отличается очень высокой стабильностью аминокислотного состава в рамках подтипа.
Рекомбинантный белок FlgMH стимулирует формирование смешанного ТЫ/№2-ответа на целевую последовательность, а также кросс-реагирующих антител, связывающихся с вирусами гриппа первой филогенетической группы (Н1, Н2, Н5), и индукцию специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8 + ИФН-Y+). Иммунизация слитым белком защищала иммунизированных животных от летальной гриппозной инфекции. Сконструированный гибридный рекомбинантный белок FlgMH является перспективной основой для создания противогриппозной вакцины широкого спектра действия, способной стимулировать Т- и В-клеточный иммунный ответ. Кросс-протективный потенциал фрагментов НА2 может быть усилен оптимизацией их доставки и увеличением иммуногенности при помощи лиган-дов TLR-рецепторов для эффективной стимуляции врожденного иммунитета и последующего усиления адаптивного иммунного ответа. •
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 15-14-00043).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Skehel J. J., Wiley D.C. // Annu. Rev. Biochem. 2000. V. 69. P. 531-569.
2. Gerhard W., Mozdzanowska K., Zharikova D. // Emerg. Infect. Dis. 2006. V. 12. № 14. P. 569-574.
3. Kwong P.D., Wilson I.A. // Nat. Immunol. 2009. V. 10. № 6. P. 573-578.
4. Ekiert D.C., Friesen R.H., Bhabha G., Kwaks T., Jongeneelen M., Yu W., Ophorst C., Cox F., Korse H.J., Brandenburg B., et al. // Science. 2011. V. 333. № 6044. P. 843-850.
5. Trosby M., van den Brink E., Jongeneelen M., Poon L.L., Alard P., Cornelissen L., Bakker A., Cox F., van Deventer E., Guan Y., et al. // PLoS One. 2008. V. 3. № 12. P. e3942.
6. Gocnik M., Fislova T., Sladkova T., Mucha V., Kostolansky F., Vareckova E. // J. Gen. Virol. 2007. V. 88. № 3. P. 951-955.
7. Prabhu N., Prabakaran M., Ho H.T., Velumani S., Qiang J., Goutama M., Kwang J. // J. Virol. 2009. V. 83. № 6. P. 25532562.
8. Wang T.T., Tan G.S., Hai R., Pica N., Petersen E., Moran T.M., Palese P. // PloS Pathog. 2010. V. 6. № 2. P. e1000796.
9. Wei C.J., Boyington J.C., McTamney P.M., Kong W.P., Pearce M.B., Xu L., Andersen H., Rao S., Tumpey T.M., Yang Z.Y., et al. // Science. 2010. V. 329. № 5995. P. 1060-1064.
10. Corti D., Voss J., Gamblin S.J., Codoni G., Macagno A., Jar-rossay D., Vachieri S.G., Pinna D., Minola A., Vanzetta F., et al. // Science. 2011. V. 333. № 6044. P. 850-856.
11. Wrammert J., Koutsonanos D., Li G.M., Edupuganti S., Sui J., Morrissey M., McCausland M., Skountzou I., Hornig M., Lipkin W.I., et al. // J. Exp. Med. 2011. V. 208. № 1. P. 181-193.
12. Wang T.T., Tan G.S., Hai R., Pica N., Ngai L., Ekiert D.C., Wilson I.A., Garcia-Sastre A., Moran T.M., Palese P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. № 44. P. 18979-18994.
13. Bommakanti G., Citron M.P., Hepler R.W., Callahan C., Heidecker G.J., Najar T.A., Lu X., Joyce J.G., Shiver J.W., Casimiro D.R., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. № 31. P. 13701-13706.
14. Stanekova Z., Adkins I., Kosova M., Janulikova J., Sebo P., Vareckova E. // Antiviral Res. 2013. V. 97. № 1. P. 24-35.
15. Stranzl T., Larsen M.V., Lundegaard C., Nielsen M. // Immu-nogenetics. 2010. V. 62. № 6. P. 357-368.
16. Vita R., Zarebski L., Greenbaum J.A., Emami H., Hoof I., Sa-limi N., Damle R., Sette A., Peters B. // Nucl. Acids Res. 2010. V. 38. Database issue. P. D854-D862.
17. Pettersen E.F., Goddard T.D., Huang C.C., Couch G.S., Green-blatt D.M., Meng E.C., Ferrin T.E. // J. Comput. Chem. 2004.
V. 25. № 13. P. 1605-1612.
18. Kelley L.A., Sternberg M.J. // Nat. Protoc. 2009. V. 4. № 3. P. 363-371.
19. Grant S., Jessee J., Bloom F., Hanahan D. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. № 12. P. 4645-4649.
20. Laemmli U.K. // Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-685.
21. Arulanandam B.P., Raeder R.H., Nedrud J.G., Bucher D.G., Le J., Metzger D.W. // J. Immunol. 2001. V. 166. № 1. P. 226-231.
22. Bizanov G., Janakova L., Knapstad S.E., Karlstad T., Bakke H., Haugen I.L., Haugan A., Samdal H.H., Haneberg B. // Scand. J. Immunol. 2005. V. 61. № 6. P. 503-510.
23. Bobat S., Flores-Langarica A., Hitchcock J., Marshall J.L., Kingsley R.A., Goodall M., Gil-Cruz C., Serre K., Leyton D.L., Letran S.E. // Eur. J. Immunol. 2011. V. 41. № 6. P. 1606-1618.
24. Cunningham A.F., Khan M., Ball J., Toellner K.M., Serre K., Mohr E., MacLennan I.C. // Eur. J. Immunol. 2004. V. 34. № 11. P. 2986-2995.
25. Didierlaurent A., Ferrero I., Otten L.A., Dubois B., Reinhardt M., Carlsen H., Blomhoff R., Akira S., Kraehenbuhl J.P., Sirard J.C. // J. Immunol. 2004. V. 172. № 11. P. 6922-6930.
26. Huleatt J.W., Jacobs A.R., Tang J., Desai P., Kopp E.B., Huang Y., Song L., Nakaar V., Powell T.J. // Vaccine. 2007. V. 25. № 4. P. 763-775.
27. Sanders C.J., Franchi L., Yarovinsky F., Uematsu S., Akira S., Nunez G., Gewirtz A.T. // Eur. J. Immunol. 2009. V. 39. № 2. P. 359-371.
28. Gat O., Galen J.E., Tennant S., Simon R., Blackwelder W.C., Silverman D.J., Pasetti M.F., Levine M.M. // PLos One. 2011. V. 5. № 11. P. e1373.
29. Stepanova L.A., Kotlyarov R.Y., Kovaleva A.A., Potapchuk M.V., Korotkov A.V., Sergeeva M.V., Kasianenko M.A., Kupri-anov V.V., Ravin N.V., Tsybalova L.M., et al. // PLoS One. 2015. V. 10. № 3. P. e0119520.
30. McSorley S.J., Ehst B.D., Yu Y., Gewirtz A.T. // J. Immunol. 2002. V. 169. № 7. P. 3914-3919.
31. Bates J.T., Uematsu S., Akira S., Mizel S.D. // J. Immunol. 2009. V. 182. № 12. P. 7539-7547.
32. Cuadros C., Lopez-Hernandez F.J., Dominguez A.L., McClelland M., Lustgarten J. // Infect. Immun. 2004. V. 72. № 5. P. 2810-2816.
33. Jensen P.E. // Semin. Immunol. 1995. V. 7. № 6. P. 347-353.
34. Collins D.S., Unanue E.R., Harding C.V. // J. Immunol. 1991. V. 147. № 12. P. 4054-4059.
35. Singh R., Cresswell P. // Science. 2010. V. 328. № 5984. P. 1394-1398.
36. Bates J.T., Graff A.H., Phipps J.P., Grayson J.M., Mizel S.B. // J. Immunol. 2011. V. 186. № 11. P. 6255-6262.
