Научная статья на тему 'Усиление эффективности кандидатной вакцины против гриппа сочетанием консервативных последовательностей гемагглютинина и м2 белка'

Усиление эффективности кандидатной вакцины против гриппа сочетанием консервативных последовательностей гемагглютинина и м2 белка Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
218
38
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ГРИПП / ВАКЦИНАЦИЯ / РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК / ИММУНОГЕННОСТЬ / ПРОТЕКТИВНОСТЬ / INFLUENZA / VACCINATION / RECOMBINANT PROTEIN / IMMUNOGENICITY / PROTECTION

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Цыбалова Л. М., Степанова Л. А., Котляров Р. Ю., Блохина Е. А., Шуклина М. А.

Разработка универсальной вакцины против гриппа вакцины, направленной на все субтипы вирусов гриппа человека, является наиболее актуальной современной задачей в специфической профилактике гриппа. В настоящей статье дана сравнительная характеристика специфической активности нескольких вариантов рекомбинантного вакцинного белка, включающего антигенные детерминанты вируса гриппа эктодомен белка М2 (М2е) и фрагмент второй субъединицы гемагглютинина (аминокислотная последовательность 76 -130). В качестве белка-носителя и адъюванта был выбран флагеллин белок Salmonella typhimurium как полноразмерный, так и с делетированной гипервариабельной частью. На экспериментальных животных показана высокая иммуногенность препаратов и способность предотвращать летальность при инфицированнии вирусом гриппа. Наибольшей протективностью обладал гибридный белок Flg-HA2-4M2 полноразмерный флагеллин с НА2 (76 130) и М2е на С-конце. Препарат обеспечивал 100% выживаемость при заражении высокой дозой вируса гриппа A(H3N2) 10 LD50. Белки, содержащие только полноразмерный флагеллин с М2е или укороченную форму флагеллина с М2е на С-конце и с НА2 в гипервариабельном участке, защищали 75% животных от летальной инфекции. Белок Flg-HA2-4M2 перспективен для дальнейшего исследования в качестве вакцины.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Цыбалова Л. М., Степанова Л. А., Котляров Р. Ю., Блохина Е. А., Шуклина М. А.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Strengthening the Effectiveness of the Candidate Influenza Vaccine by Combining Conserved Sequences of Hemagglutinin and M2 protein

The development of universal influenza vaccine a vaccine directed to all subtypes of human influenza A viruses is the really actual problem task. This paper presents the comparative characteristic of the specific activity of various recombinant proteins consisting of antigenic determinants of influenza A virus the ectodomain of the M2 protein (M2e) and a fragment of the second subunit of the hemagglutinin (the amino acid sequence 76 130). Flagellin Salmonella typhimurium protein was used as carrier protein and as adjuvant. We use two forms of flagellin: full size and with deleted hypervariable region. The proteins showed high immunogenicity, and the ability to prevent lethal infection of influenza virus in mice. Full-length flagellin with HA2 (76 130) and M2e on the C-terminus (protein Flg-HA2-4M2e) demonstrated the most protective properties. It provides 100% survival immunized mice that were challenge with a high dose of influenza A (H3N2) 10 LD50. Proteins containing only full sized flagellin with M2e or flagellin truncated form with M2e at the C-terminus and HA2 within the hypervariable region, protected 75% of animals from lethal infection. Protein Flg-HA2-4M2e is promising for further study as a vaccine.

Текст научной работы на тему «Усиление эффективности кандидатной вакцины против гриппа сочетанием консервативных последовательностей гемагглютинина и м2 белка»

Усиление эффективности кандидатной вакцины против гриппа сочетанием консервативных последовательностей гемагглютинина и М2 белка

Л. М. Цыбалова1 (sovet@influenza.spb.ru), Л.А. Степанова1, Р.Ю. Котляров2, Е. А. Блохина2, М.А. Шуклина1, Е.С. Марданова2, А. В. Коротков1, М. В. Потапчук1, Н. В. Равин2

1 ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России, Санкт-Петербург

2 ФГУ «ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Москва

Резюме

Разработка универсальной вакцины против гриппа - вакцины, направленной на все субтипы вирусов гриппа человека, - является наиболее актуальной современной задачей в специфической профилактике гриппа. В настоящей статье дана сравнительная характеристика специфической активности нескольких вариантов рекомбинантного вакцинного белка, включающего антигенные детерминанты вируса гриппа - эктодомен белка М2 (М2е) и фрагмент второй субъединицы гемагглютинина (аминокислотная последовательность 76 -130). В качестве белка-носителя и адъюванта был выбран флагеллин - белок Salmonella typhlmurlum как полноразмерный, так и с делетированной гипервариабельной частью.

На экспериментальных животных показана высокая иммуногенность препаратов и способность предотвращать летальность при инфицированнии вирусом гриппа. Наибольшей протективностью обладал гибридный белок Flg-HA2-4M2 - полноразмерный флагеллин с НА2 (76 - 130) и М2е на С-конце. Препарат обеспечивал 100% выживаемость при заражении высокой дозой вируса гриппа A(H3N2) - 10 LD50. Белки, содержащие только полноразмерный флагеллин с М2е или укороченную форму флагеллина с М2е на С-конце и с НА2 в гипервариабельном участке, защищали 75% животных от летальной инфекции. Белок Flg-HA2-4M2 перспективен для дальнейшего исследования в качестве вакцины. Ключевые слова: грипп, вакцинация, рекомбинантный белок, иммуногенность, протективность

Strengthening the Effectiveness of the Candidate Influenza Vaccine by Combining Conserved Sequences of Hemagglutinin and M2 protein

L.M. Tsybalova1 (sovet@lnfluenza.spb.ru), L.A. Stepanova1, R.Yu. Kotlyarov2, E.A. Blokhlna2, M.A. Shukllna1, E.S. Mardanova2, A.V. Korotkov1, M.V. Potapchuk1, N.V. Ravln2

1 Federal State Budget Instltutlon Research «Instltute of Influenza»of the Mlnlstry of Healthcare of the Russlan Federation, St. Petersburg

2 Federal State Instltutlon «The Federal Research Centre «Fundamentals of Blotechnology» of the Russlan Academy of Sclences, Moscow Abstract

The development of unlversal lnfluenza vacclne - a vacclne dlrected to all subtypes of human lnfluenza A vlruses - ls the really actual problem task. Thls paper presents the comparatlve characterlstlc of the speclflc actlvlty of varlous recombinant protelns conslstlng of antlgenlc determlnants of lnfluenza A vlrus - the ectodomaln of the M2 proteln (M2e) and a fragment of the second subunlt of the hemagglutlnln (the amlno acld sequence 76 - 130). Flagellln - Salmonella typhlmurlum proteln was used as carrler proteln and as adjuvant. We use two forms of flagellln: full slze and wlth deleted hypervarlable reglon. The protelns showed hlgh lmmunogenlclty, and the ablllty to prevent lethal lnfectlon of lnfluenza vlrus ln mlce. Full-length flagellln wlth HA2 (76 - 130) and M2e on the C-termlnus (proteln Flg-HA2-4M2e) demonstrated the most protectlve propertles. It provldes 100% survlval lmmunlzed mlce that were challenge wlth a hlgh dose of lnfluenza A (H3N2) - 10 LD50. Protelns contalnlng only full slzed flagellln wlth M2e or flagellln truncated form wlth M2e at the C-termlnus and HA2 wlthln the hypervarlable reglon, protected 75% of anlmals from lethal lnfectlon. Proteln Flg-HA2-4M2e ls promlslng for further study as a vacclne.

Key words: lnfluenza, vacclnatlon, recombinant proteln, lmmunogenlclty, protectlon

Введение

Главная задача в области профилактики гриппа в настоящее время заключается в создании вакцин, эффективных против широкого круга вирусов. Преимущество такого рода универсальных вакцин над традиционными очевидно: отсутствует необходимость в ежегодном получении новых реассортан-тов и обновлении штаммового состава вакцин; исключаются случаи несоответствия циркулирующих в конкретном сезоне вирусов и вирусов, вошедших

в состав вакцин; исключается отставание в наработке нужного количества вакцин от скорости распространения нового вируса; не требуется ежегодная вакцинация населения.

Постановка задачи создания универсальных вакцин стала возможной благодаря появлению ДНК рекомбинантных технологий. Они позволили перейти от базисного правила создания вакцин Л. Пастера: «выделить микроорганизм, инактиви-ровать и ввести в макроорганизм» к методам, так

называемой, «обратной вакцинологии» [1], в основе которых лежит анализ in silico всех белков инфекционного агента и выбор в качестве имму-ногенов тех, что отвечают целям разрабатываемой вакцины. По отношению к вакцинам, защищающим от всех субтипов вируса гриппа А, такими белками могут быть внутренние вирусные белки, общие для разных субтипов.

В силу высокой консервативности и обильной презентации на инфицированных клетках, эктодо-мен белка М2 (М2е) - один из наиболее популярных кандидатов для создания универсальных вакцин [2 - 5]. Рядом авторов была показана, в том числе и в клинических исследованиях, высокая иммуногенность конструкций c М2е на разных белковых носителях: флагеллине, коровом антигене вируса гепатита В, Р-белке норовируса, на на-ночастицах золота и т.д. [3, 5 - 7]. Большинство кандидатных вакцин с М2е ускоряло выздоровление при последующем заражении вирусами гриппа, уменьшало выраженность симптомов, предотвращало гибель лабораторных животных. Вместе с тем, очевидно, что для более полного купирования инфекции необходимо комбинировать М2е с другими белками, индуцирующими вирус-нейтра-лизующие антитела (АТ). Одна из стратегий создания вакцин широкой направленности заключается во включении в состав вакцинного белка второй субъединицы гемагглютинина (НА2). В отличие от первой субъединицы гемагглютинина (НА1) вторая субъединица (стебель) менее подвержена мутациям и является более консервативной [8]. Показано, что антитела к М2е и эпитопам НА2 защищают от инфекции при пассивном переносе сывороток от иммунных животных [9] и что комбинация этих эпи-топов в одном препарате делает его более эффективным и универсальным [10].

Значимость НА2 специфических антител для ге-теросубтипической защиты обусловлено их кросс-реактивностью, которая реализуется несколькими путями: НА2 специфические антитела ингибируют слияние вирусной и клеточной мембран, предотвращают конформационные изменения НА, индуцируемые низким рН, блокируют процесс внедрения пептида слияния в эндосомальную мембрану. Ряд авторов показали эффективность включения в вакцину укороченного фрагмента НА2, содержащего пептид слияния и большую а-спираль [8, 11]. Нейтрализующие АТ к эпитопам НА образуются при вакцинации и естественной инфекции, но относительно в небольшом количестве. Предполагается, что эти АТ бустировались во время пандемии 2009 года и внесли вклад в затухание циркуляции сезонных (допандемических) вирусов гриппа А(Н^1).

Вместе с тем, и М2е, и НА2 76 - 130, имея небольшой молекулярный вес, являются сами по себе слабыми иммуногенами и нуждаются в крупной молекуле-носителе. В качестве белкового носителя вирусных пептидов был взят флагел-

лин - жгутиковый белок Salmonella typhimurium. Флагеллин обладает выраженными адъювантными свойствами, так как является лигандом TLR5 и через адаптерный белок MyD88 активирует клетки CD4+ и дальнейшую индукцию синтеза специфических иммуноглобулинов. Еще одним преимуществом флагеллина как носителя является возможность введения гибридных белков на его основе интраназально.

Цель настоящего исследования состояла в создании рекомбинантных белков, включающих консервативные для вируса гриппа А антигенные детерминанты и в оценке их иммуногенности и протективности.

Материалы и методы

Конструирование и экспрессия рекомбинантных белков. В качестве консервативных пептидов вируса гриппа, предназначенных для включения в состав рекомбинантных вакцинных белов, были выбраны:

M2h - консенсусная последовательность протеина М2е штаммов вируса гриппа А человека: SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD;

M2k - M2e вируса птичьего высоко патогенного гриппа A/Kurgan/05/2005 H5N1: SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD;

НА2 - консенсусная аминокислотная последовательность (ак 76 - 130) второй субъединицы НА вирусов гриппа А субтипов Н3 и Н7, относящихся ко второй филогенетической группе: RIQDLEKYVED TKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQL RENA.

Соответственно на основе флагеллина были сконструированы три белка:

Flg-4M2е - молекула флагеллина с присоединенными на С конце двумя копиями М2к в последовательности M2h-M2k-M2h- М2к;

Flg-HА2-4M2е - последовательность флагеллина, к которой на С конце присоединен консенсус-ный фрагмент для субтипов Н3 и Н7 второй субъединицы (ак 76 - 130) НА и последующие 4 копии М2е (M2h-M2k-M2h- M2k);

FlgSh-HA2-4M2е - молекула флагеллина, в которой гипервариабельная (ГВ) часть заменена на консенсусный фрагмент второй субъединицы НА (ак 76-130) вирусов гриппа А II филогенетической группы. К С-концу присоединены 4 копии М2е пептида от человеческих и птичьего вирусов.

Аминокислотная последовательность НА2 разных вирусов была взята из баз данных GISAID и GenBank. Последовательности выравнивали с использованием сервера MAFFT и алгоритмов FFT-NS-i, FFT-NS-2 и анализировали в программном пакете Unipro UGENE v.1.14.0. Поиск экспериментальных B- и СD4+ T-клеточных эпитопов, гомологичных участкам НА2, проводили в базе данных Immune Epitope Database. Поиск вероятных Т-клеточных эпитопов осуществляли с использованием NetCTLpan1.1 Server.

Искусственно созданные гены, кодирующие химерные белки, вводили в плазмиду pQE30 (Qiagen) с помощью стандартных генно-инженерных методов. Были получены экспрессионные векторы: pQE30-Flg-4M2e, pQE30-Flg-HA2-4M2e, pQE30-FlgSh-HA2-4M2e. Для создания штаммов-продуцентов рекомбинантных белков соответствующими экспрессионными векторами трансформировали штамм E. coli DLT1270 - производный от штамма DH10B, в хромосому которого интегрирован ген репрессора лактозного оперона lacI. Культуры штаммов-продуцентов выращивали в среде LB при 37 °С, при достижении оптической плотности культуры OD 600 ~ 0,5 - 0,6 в среду вносили IPTG (до 0,1 мМ). Штаммы-продуценты рекомбинантных белков культивировали далее 12 - 14 часов при 28 °C (Flg-4M2e), 4 часа при 28 °C (Flg-HA2-4M2e), либо в течение ночи при 30 °С (FlgSh-HA2-4M2e). От клеточного лизата белки очистили с помощью металло-аффинной хроматографии на Ni сорбенте. Белковые препараты анализировали с помощью SDS-PAGE.

Электрофорез и иммуноблот. Электрофорез в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) проводили в денатурирующих условиях по методу Лэммли. Подробное описание методики приведено ранее [4]. Полосы рекомбинантных белков определяли окрашиванием мембраны мышиными монокло-нальными анти-М2е АТ 14C2 (ab5416, Abcam, UK) и кроличьим поликлональными АТ, специфичными для бактериального флагеллина (ab93713, Abcam, UK). Мембрану инкубировали 1 час при комнатной температуре с первичными антителами, разведенными в ФБР с 0,1% Твин 20 (ФБРТ) и 3% БСА, затем отмывали в ФБРТ. Белки выявляли окрашиванием мембраны в течение 1 часа при комнатной температуре вторичными антителами (козьи анти-мыши-ные IgG, Abcam, UK), меченными пероксидазой хрена и последующей инкубацией в течение 5 мин с субстратом TMB (тетраметилбензидин) Immunoblot solution (Invitrogen, США).

Лабораторные животные. Иммунизация. В исследовании были использованы линейные мыши (самки) Ва^/c массой 18 - 20 г (возраст 6 -8 недель), полученные из питомника «Столбовая» ГУ «Научный центр биомедицинских технологий» РАН. Животных содержали в виварии ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России в соответствии с действующими правилами. Мышей иммунизировали интраназально рекомбинантными белками в дозе 6 мкг/0,1 мл трехкратно с интервалом 3 нед. Иммунизацию проводили после ингаляционной анестезии смесью 2 - 3 % изофлюран, 30 % О2, 70 % N20. Контрольным мышам вводили и/н 0,1 мл ФБР. Все исследования проводили в соответствии с СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)». Протокол опыта был утвержден Комиссией по биоэтике ФГБУ «НИИ гриппа»

(протокол заседания Комиссии по биоэтике №10/1 от 14 марта 2016 г.).

Получение сывороток крови и бронхоальвео-лярных лаважей. Образцы крови и бронхоальве-олярные лаважи (БАЛ) получали от пяти мышей каждой группы через 2 недели после третьей иммунизации, после эвтаназии в С02-камере (Vet Tech Solutions, Великобритания). Для получения сыворотки кровь инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 °С. После образования сгустков крови образцы помещали на поверхность льда и охлаждали в течение 1 ч с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 400 g. Аликвоты сыворотки крови (по 30 мкл) замораживали при температуре -20 °С. Для получения БАЛ труп животного фиксировали на операционном столике. Производили разрез кожи по средней линии от нижней челюсти. В нижнюю часть трахеи в направлении легких вводили катетер на глубину 3 - 5 мм. Дважды промывали бронхи и легкие 1 мл ФБР. БАЛ центрифугировали в течение 15 мин при 400 g, отбирали аликвоты надосадка и замораживали их при температуре -20 °С.

Иммуноферментный анализ. Сыворотки и БАЛ исследовали в ИФА с использованием 96-луночных планшет (Greiner, Германия). Титры антител определяли индивидуально у 5 мышей каждой группы. В качестве твердой фазы использовали синтетические пептиды (5мкг/мл), синтезированные в НПО «Верта», Санкт-Петербург : M2ek SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD (M2e вируса гриппа А/Курган/05/05 (H5N1), M2eh SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (консенсусная последовательность М2е вирусов гриппа А человека), или очищенный вирус А/Аичи/2/68 (H3N2) (2 мкг/мл) в ФБР (рН 7.2). Планшеты выдерживали в течение ночи при 4 °С. ИФА проводили по ранее описанной методике [4].

Вирусы и заражение мышей. На 14-й день после последней иммунизации мышей Balb/c (по 8 мышей в опытных и контрольной группах) заражали адаптированным к мышам вирусом гриппа А/Аичи/2/68 (H3N2), полученным из Коллекции вирусов гриппа и ОРЗ ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России, в дозе 10LD50. Вирус А/Аичи/2/68 (H3N2) был адаптирован к мышам путем серии пассажей (мышь/куриный эмбрион). Вирус сохранил антигенные свойства исходного дикого штамма, но приобрел способность летально инфицировать мышей. Вирус вводили интраназально в объеме 50 мкл/мышь после ингаляционной анестезии. После заражения проводили ежедневное наблюдение за животными. Протективное действие ре-комбинантных белков оценивали по динамике падения массы тела, выживаемости мышей после заражения и репродукции вируса в легких. В качестве отрицательного контроля в эксперименте использовали мышей, которым вводили 0,1 мл ФБР.

Репродукция вирусов гриппа в легких. На 6-ые сутки после заражения у 3 мышей из каждой группы после эвтаназии забирали легкие. Легкие го-

могенизировали, центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин. До начала работы все образцы были заморожены и хранились при температуре -20 °С. Выделение вируса проводили титрованием легочной суспензии мышей на культуре клеток MDCK. Клетки заражали серийными десятикратными разведениями легочного гомогената (в квадрипликатах) от 10-1 до 10-8 и инкубировали в термостате (36,0 ± 0,5 °С) в течение 72 часов. Уровень репродукции вируса в культуральной жидкости оценивали в реакции гемагглютинации эритроцитов с 1% взвесью в физиологическом растворе. Инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча (1938 г.). За титр вируса принимали величину, противоположную десятичному логарифму наибольшего разведения вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации и выражали в логарифмах 50% тканевой цитопатической инфекционной дозы вируса (^ ТЦИД50).

Статистическая обработка. Статистическую обработку данных проводили в программе GraphPad Рп7т V 6.0. Статистическую значимость различий титров антител оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни и сравнение показателей выживаемости - критерия Мантела-Кокса. Различия считали значимыми при р < 0.05.

Результаты и их обсуждение

В процессе работы были синтезированные химерные гены, которые кодировали 3 белка, включающие молекулу флагеллина (полноразмерную или с удаленной гипервариабельной частью), экто-домены М2 белка высоко патогенного вируса грип-

па птиц А(Н5N1) и консенсусную аминокислотную последовательность М2е вирусов гриппа человека, а также аминокислотную последовательность 76 - 130 второй субъединицы гемагглютинина, консенсусную для вирусов гриппа А субтипов Н3 и Н7. Последовательность расположения пептидов в рекомбинантных вакцинных белках представлена на рис. 1А.

Выбор консенсусной последовательности гемагглютинина субтипов Н3 и Н7 вируса гриппа обусловлен их эпидемической значимостью. Вирус А(Н3N2) циркулирует в человеческой популяции с 1968 года, вызывая практически ежегодно эпидемии гриппа. Вирус А ^N9) - один из вирусов природного резервуара, рассматривается специалистами как возможный донор генов для будущего пандемического вируса [12].

Последовательность НА2 76 - 130 представляет собой большую -спираль, эпитопы которой является мишенью для моноклональных антител [3, 8]. Аминокислотная последовательность фрагмента 76 - 130 НА2 двух субтипов Н3 и Н7 имеет гомологию в 63,6%; с учетом замен на аминокислоты с аналогичными физико-химическими свойствами гомология составляет 80%.

Оба целевых пептида М2е и НА2 имеют Т-клеточные ^4+, СD8+) и В-клеточные эпитопы. К настоящему времени получен ряд моноклональ-ных антител (мАТ), реагирующих с В-клеточными эпитопами М2е и НА2 (76 - 130). Так, мАТ ^1, взаимодействуют с ак 76 - 106 и обладают нейтрализующей способностью в отношении вирусов A(H3N2) 1968 - 2003 годов циркуляции [8]. Моноклональные антитела FE1, специфичны к участку125 - 175 НА2 и ингибируют фьюзоген-

Рисунок 1.

Схема молекулы флагеллина (А) и экспрессионных векторов (Б), содержащих химерные гены гибридных белков. Электрофорез рекомбинантных белков после хроматографической очистки на Ni сорбенте (1 - 3) (В)

В

Примечание: Вестерн-Блотинг рекомбинантных белков (4 - 9). Дорожка НМ-маркеры молекулярного веса в кДа Дорожки:1, 4, 7 - белок Flg НА2-4М2е; 2, 5, 8 - белок Flg 4М2е; 3, 6, 9 - белок FlgSh-HА2-4M2е.

А

Б

ную активность вируса гриппа А [14]. МАТ CR6261 ингибируют рН-индуцированное конформационное изменение вирусов гриппа Н1 и Н5 и обладают нейтрализующей активностью [4], взаимодействует преимущественно с а-спиралью НА2. Для М2е еще в 1980-е годы было получено мАТ 14С2, взаимодействующее с аминокислотной последовательностью 1 - 10.

После трансформации E. coli плазмидами, содержащими химерные гены, были получены три белка: FlgНА-4М2е, FlgShНА-4М2е, Flg4М2е. В белке FlgShНА-4М2е (см. рис. 1А) вариабельная часть Flg была заменена на ак 76 - 130 от второй субъединицы НА вирусов гриппа филогенетической группы II. Как видно на рисунке 1Б в белках FlgНА-4М2е и Flg4М2е целевые белки находятся на С-конце флагеллина. Последовательность аминокислот в пептиде М2е вируса птиц А(Н5N1), по сравнению с консенсусной последовательностью аминокислот вирусов гриппа человека отличается на 3 аминокислоты в положениях 8 (Т ^ I), 15 (Е ^ G) и 19 (S N); по сравнению с М2е вируса А/ Калифорния/05/09, имеет одну лишь замену N12S и индуцирует антитела, хорошо взаимодействующие с М2е вируса А ^1N1)pdm09 [15].

Теоретическая молекулярная масса белков Flg4М2е, Flg-HА2-4M2е и FlgSh-HА2-4M2е составляла 66 kDa, 73,9 кДа и 55 кДа соответственно, что

совпадало с электрофоретической подвижностью этих белков в ПААГ (рис. 1В).

Подлинность белков была подтверждена в Ве-стерн-блотинге. Очищенные с помощью хроматографии белки взаимодействовали с М2е специфическими моноклональными антителами 14С2 и антителами к флагеллину (см. рис. 1В).

Иммуноферментный анализ сывороток крови мышей, иммунизированных вакцинными белками с разной локализацией НА2, выявил взаимодействие с синтетическими пептидами М2е1л и М2ек до титров 1:60 000 - 1:90 000 с отсутствием статистически достоверных различий в уровнях анти-М2е IgG (см. рис. 1А). Таким образом, удаление гипервариабельной части в молекуле Flg и замена ее на НА2 не отразились на уровне индуцируемых М2е-специфических антител. Это логично, так как показано, что лиганды TLR 5, активизирующие клетки врожденного иммунитета, а через них клетки CD4+ и далее образование специфических антител, расположены именно в консервативной части молекулы флагеллина [16].

Иммунный ответ привитых мышей на НА2 также оценивали в реакции иммуноферментного анализа. Как видно на рисунке 2Б, более высокие титры IgG (1:1100) обнаружены в сыворотках мышей, привитых белком с локализацией НА 76 - 130 в гипервариабельной части молекулы флагеллина (р < 0,01). В

Рисунок 2.

Среднее геометрическое титров IgG в сыворотке (А) и БАЛ (В) к синтетическим пептидам M2ek (М2е Курган), M2eh (М2е человек); СГТ IgG в сыворотке к А(Н3N2) (Б) после третьей иммунизации (интраназальное введение)

Примечание: Достоверных различий между опытными группами нет. Достоверное отличие от контрольных групп р < 0.01.

Рисунок 3.

Динамика массы тела (А) и гибели (Б) мышей, иммунизированных рекомбинантными белками, после заражения вирусом гриппа А/АюМ/2/68 (H3N2) в дозе 10LD

Примечание: Статистическую значимость определяли с помощью теста Манна-Уитни. Различия между опытными и контрольной группами статистически достоверны р ? 0,05.

целом, белки, содержащие НА2, расширяли спектр специфических иммуноглобулинов, что предположительно должно было повысить их защитные свойства по сравнению с белком Flg 4М2е. Обладают ли образующиеся антитела вирус-нейтрализующи-ми свойствами - предмет дальнейшего изучения. Также как и вопрос может ли последовательность 76 - 130 НА2, локализованная в гипервариабельной (ГВ) части молекулы флагеллина, индуцировать образование специфических клеток CD8+, как это было показано в отношении некоторых белков, встроенных в ГВ часть флагеллина [16].

Уровни М2е-специфичных ^ и ^А в БАЛ после иммунизации каждым из трех кандидатных вакцинных белков не имели статистически значимых различий (рис. 2В, Г).

По данным литературы, основными защитными механизмами, индуцируемыми гибридными белками, содержащими пептиды с М2е и НА2, является антитело-зависимая цитотоксичность и комплемент-опосредованная NK-клеточная элиминация инфицированных клеток [3, 17], то есть вакцинные препараты на основе консервативных белков не предотвращают инфекцию, но значительно облегчают клиническую симптоматику заболевания и исключают летальные исходы.

Для ответа на вопрос: насколько иммунизация сконструированными белками защищает организм от последующей инфекции вирусом гриппа, было проведено заражение всех групп мышей высокой дозой (10LD50) вируса А/Аичи/2/68 ^N2) (рис. 3 А, Б). При этом 100% выживаемость наблю-

Рисунок 4.

Титры вирусов в легких мышей, иммунизированных рекомбинантными белками, на 6-й день после заражения вирусом гриппа А/АюМ/2/68 (H3N2) в дозе 10LD50

Примечание: Данные выражены в виде Lg ТСЮ50. Нижний предел обнаружения составляет 0,51д ТСЮ50. Статистическую значимость определяли с помощью теста Манна-Уитни. *р < 0,05 значения между вакцинированными и контрольными группами.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.