CC BY
34
УДК 602.6:57.083
Влияние порядка присоединения фрагментов НА2 и М2е вирусов гриппа Д к флагеллину на свойства рекомбинантных белков
Л. А. Степанова1*, Р. Ю. Котляров2, М. А. Шуклина1, Е. А. Блохина2, М. В. Сергеева1, М. В. Потапчук1, А. А. Ковалева1, Н. В. Равин2, Л. М. Цыбалова1
Научно-исследовательский институт гриппа Министерства здравоохранения Российской
Федерации, 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 15/17
2Институт биоинженерии, Исследовательский центр биотехнологии РАН, 119071, Москва,
Ленинский просп., 33, стр. 2
*E-mail: stepanoval60@mail.ru
Поступила в редакцию 28.12.2016
Принята к печати 23.01.2018
РЕФЕРАТ Эктодомен белка М2 и консервативные регионы второй субъединицы НА являются перспективными антигенами для создания вакцин с широким протективным потенциалом. На основе флагеллина, четырех копий эктодомена белка М2 вирусов гриппа А и консервативного фрагмента НА2 (76-130) вирусов гриппа филогенетической группы II, содержащего В-клеточные, CD4+ и CD8+ Т-клеточные эпитопы, сконструированы два гибридных рекомбинантных белка с различным порядком присоединения таргет-ных антигенов к С-концу флагеллина. 3D-моделирование структуры двух гибридных белков показало, что внутренняя локализация четырех копий М2е приводила к частичной а-спирализации, нехарактерной для нативной конформации М2е на поверхности вириона. Концевое расположение М2е в большей степени обеспечивало сохранность нативной конформации М2е. Конформационные различия в структуре двух белков влияли на их иммуногенность. Выявлены различия в уровне продукции антител двумя гибридными белками. Белок с концевым положением М2е был более иммуногенным, чем белок с концевым положением участка НА2. Иммунизация гибридным белком с концевым расположением М2е полностью защищала животных от летального заражения. Показано, что порядок расположения таргетных антигенов в реком-бинантном белке может влиять на третичную структуру рекомбинантного белка, а также на его иммуноген-ность и протективный эффект.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА вакцина, грипп, НА2, М2е, рекомбинантный белок, флагеллин.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ М2е - эктодомен белка М2 вируса гриппа; НА - гемагглютинин; НА2 - вторая субъединица гемагглютинина; Flg - флагеллин; БАЛ - бронхоальвеолярный лаваж; ИФА - иммуноферментный анализ; ОП - оптическая плотность; СГТ - среднегеометрический титр; ТЦИД50 - 50% тканевая цитопати-ческая инфекционная доза вируса.
ВВЕДЕНИЕ
Создание вакцин нового поколения, способных обеспечить защиту от широкого спектра вирусов гриппа А, а также от тяжелых форм гриппа А в течение по крайней мере 5 лет, является глобальной задачей. В качестве таргетных антигенов при конструировании таких вакцин рассматривают консервативные белки вируса гриппа (М2, НА2, М1, NP). В настоящее время на основе высококонсервативного эктодомена белка М2 (М2е) разработан ряд кандидатных вакцин, показана их иммуногенность и протективность у животных, безопасность и иммуногенность у человека
[1-7]. Вакцины на основе М2е не относятся к профилактическим, они не предотвращают развитие инфекции, однако снижают тяжесть заболевания, ограничивая репликацию вируса, и обеспечивают защиту от вирусов гриппа со сходной последовательностью М2е [8-11]. Защитное действие вакцин на основе М2е зависит от антител [8, 10, 12, 13]. Механизм действия анти-М2е-иммунитета обусловлен антителозави-симой клеточной цитотоксичностью и антителоза-висимым клеточно-обусловленным фагоцитозом. Анти-М2е-антитела в отличие от анти-НА-антител не предотвращают вирусную инфекцию и не явля-
ются нейтрализующими, но могут лизировать инфицированные вирусом гриппа клетки и тем самым ограничивать репликацию вируса [9, 11, 14].
В последнее время пристальное внимание привлекает консервативная в пределах филогенетической группы вторая субъединица НА (НА2), которая отвечает за слияние вирусной и клеточной мембраны в эндосомах, обеспечивая таким образом попадание рибонуклеинового комплекса в цитоплазму [15]. Перекрестно реагирующие моноклональные антитела, которые взаимодействуют с эпитопами, локализованными в стеблевой части НА, могут нейтрализовать вирусы гриппа в пределах филогенетической группы [16-22]. Предприняты попытки поиска наиболее перспективных эпитопов НА2 вирусов гриппа А филогенетических групп I и II (аминокислотные остатки 38-59, 23-185, 1-172, 76-103, 35-107) и конструирования рекомбинантных белков на их основе [23-27]. Исследования на животных показали, что такие белки формируют как гуморальный, так и ци-тотоксический Т-клеточный ответ, они эффективно защищают от заражения летальными дозами гомологичного и гетерологичного вирусов одной филогенетической группы.
Вакцина на основе консервативных участков нескольких вирусных белков, вызывающих как гуморальный, так и Т-клеточный ответ, и нейтрализующих широкий спектр вирусных штаммов, была бы значительно более эффективной.
В качестве платформы для разработки рекомби-нантных вакцин на основе слабо иммуногенных антигенов против вирусных и бактериальных патогенов рассматривается флагеллин [2, 28]. Адъювантный эффект флагеллина обусловлен его способностью связываться с TLR5 на CD11c+ антигенпредставля-ющих клетках, что объясняет усиление иммуноген-ности слитых с флагеллином антигенов и способности стимулировать CD4+ Т-зависимый гуморальный ответ [28-31]. Способность флагеллина служить одновременно и платформой, и адъювантом при разработке вакцин показана на различных моделях инфекционных заболеваний, включая грипп [2, 6, 27, 32-34].
В данной работе изучена возможность получения рекомбинантного белка на основе консервативных участков двух вирусных белков (М2 и НА), слитых с С-концом полноразмерного флагеллина. Сконструированы два рекомбинантных белка с различным порядком присоединения к С-концу флагел-лина М2е пептидов разных субтипов вирусов гриппа А и консервативного фрагмента второй субъединицы гемагглютинина вирусов гриппа второй филогенетической группы. Рассмотрено влияние порядка присоединения таргетных антигенов к флагеллину
на структуру, стабильность и иммуногенность реком-бинантных белков.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Выбор консервативного фрагмента HA2 вирусов гриппа филогенетической группы II
Аминокислотные последовательности НА2 получены из баз данных GenBank и GISAID. Для построения консенсусов последовательности выравнивали с использованием сервера MAFFT и алгоритмов FFT-NS-i, FFT-NS-2 (в зависимости от числа последовательностей) [35] и анализировали в программном пакете Unipro UGENE v.1.14.0 [36]. Выравнивание и анализ небольшого числа последовательностей проводили в программном пакете VectorNTI (Invitrogen, США). Поиск экспериментальных B-и CD4+ T-клеточных эпитопов, гомологичных участкам НА2, проводили в базе данных Immune Epitope Database [37]. Поиск вероятных Т-клеточных эпитопов осуществляли с использованием NetCTLpanl.1 Server [38] и параметров поиска, установленных по умолчанию. Изображение трехмерной структуры НА получали в программе UCSF Chimera v.1.9 [39] с использованием моделей 4JTV (4O5I (А/ Victoria/06/2011(H3N2)), взятых из базы данных RCSB Protein Data Bank. Визуализацию трехмерной структуры белков выполняли в программе Chimera 1.5.3 [39]. Для гомологичного моделирования трехмерной структуры белка по аминокислотной последовательности использовали открытый веб-ресурс Phyre2 [40].
Конструирование экспрессионных векторов
Плазмиду pQE30 (Qiagen) использовали для конструирования векторов, обеспечивающих экспрессию белков с различным порядком присоединения тар-гетных антигенов. Гибридный белок Flg-4M2e-HA2 содержал флагеллин из Salmonella typhimurium (Flg), к С-концу которого были последовательно присоединены четыре копии пептида М2е (две копии консенсусной последовательности M2e вирусов гриппа человека А (M2eh) и две M2e вируса гриппа птиц A/H5N1 (M2ek)) и консенсусный фрагмент второй субъединицы (76-130) НА вирусов гриппа филогенетической группы II. Во втором гибридном белке (Flg-НА2-4M2e) к флагеллину был сначала присоединен НА2-фрагмент, а затем четыре копии пептида М2е. Химерные гены конструировали с использованием стандартных методов генной инженерии. Ген флагел-лина был получен ранее с помощью ПЦР на геномной ДНК S. typhimurium и клонирован. Нуклеотидные последовательности, кодирующие консенсусную последовательность НА2 (76-130) вирусов гриппа вто-
рой филогенетической группы и тандемные копии М2е синтезировали in vitro. Для экспрессии НА2 в клетках Escherichia coli проводили оптимизацию состава кодонов. Таким образом, были созданы векторы pQE30_Flg_HА2_4М2е и pQE30_Flg_4М2е_ HA2, обеспечивающие получение соответствующих рекомбинантных белков.
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков
С целью получения штаммов, продуцирующих ре-комбинантные белки, клетки E. coli штамма DLT1270 трансформировали плазмидами pQE30/Flg-HA2-4M2e и pQE30/Flg-4M2e-HA2. Штамм DLT1270, производное DH10B [41], содержит ген репрессора лак-тозного оперона lacI, интегрированный в хромосому. Штаммы-продуценты накапливали в среде LB с ампициллином до середины логарифмической фазы роста (ОП600 = 0.4 - 0.7) при 37°C, затем добавляли IPTG до конечной концентрации 0.1 мМ и культивировали в течение еще 4 ч при 37°C. Клетки обрабатывали ли-зоцимом, рекомбинантные белки очищали из клеточного лизата с помощью металл-аффинной хроматографии на Ni-сорбенте.
Электрофорез и вестерн-блот
Электрофорез в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) проводили в денатурирующих условиях по методу Лэммли [42]. Пробы смешивали с буфером для нанесения, содержащим ß-меркаптоэтанол, кипятили в течение 7 мин и наносили в градиентный 8-16% ПААГ. Электрофорез проводили в течение 1.5 ч при 10-12 мА. Гель фиксировали 10% уксусной кислотой и окрашивали Кумасси G-250 в течение 18 ч. Горизонтальный перенос белков из ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану (BioRad, США) осуществляли в TB-буфере (0.03 М глицин, 0.04 М Трис, 0.037% додецилсульфат Na, 20% этанол) с использованием системы Mini Trans-Blot cell (BioRad, США) в охлаждаемой камере при +4°С в течение 1.5 ч при постоянном токе 200 мА. Затем мембрану блокировали в 3% растворе БСА (бычий сывороточный альбумин, Amresco, ЕС) в фосфатно-солевом буфере (ФБР) в течение ночи при комнатной температуре, полосы рекомбинантных белков определяли окрашиванием мембраны мышиными моноклональ-ными анти-М2е-антителами 14C2 (ab5416, Abcam, Великобритания). Мембрану инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с первичными антителами, разведенными в ФБР с 0.1% Твин 20 (ФБРТ) и 3% БСА, затем отмывали в ФБРТ. Белки выявляли окрашиванием мембраны в течение 1 ч при комнатной температуре вторичными антителами (антимышиные IgG козы, Abcam), меченными пероксидазой хрена и последующей инкубацией в течение 5 мин
с субстратом TMB (тетраметилбензидин) Immunoblot solution (Invitrogen, США).
Иммунизация мышей
Мыши ВаШ/c (самки массой 16-18 г) получены из питомника «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий РАМН. Животных содержали в виварии НИИ гриппа Минздрава России в соответствии с действующими правилами. Мышей иммунизировали рекомбинантными белками Flg-4M2e-HA2 и Flg-НА2-4M2e интраназально (после ингаляционной анестезии 2-3% изофлюрана, 30% O2, 70% N2O) трехкратно с интервалом 2 недели в дозе 6 мкг/0.1 мл. Контрольным мышам вводили интраназально 0.1 мл ФБР.
Получение сывороток и бронхоальвеолярных лаважей
Образцы крови и бронхоальвеолярные лаважи (БАЛ) получали от пяти мышей каждой группы через 2 недели после третьей иммунизации, после эвтаназии в С02-камере (Vet Tech Solutions, Великобритания). Для получения сыворотки кровь инкубировали в течение 30 мин при температуре 37°С. После образования сгустков крови образцы помещали на поверхность льда и охлаждали в течение 1 ч с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 400 д. Аликвоты сыворотки крови (по 30 мкл) замораживали при температуре -20°С.
Для получения БАЛ труп животного фиксировали на операционном столике брюшком кверху. Кожу разрезали по средней линии от нижней челюсти. В нижнюю часть трахеи в направлении легких вводили катетер на глубину 3-5 мм. Дважды промывали бронхи и легкие 1 мл ФБР. БАЛ центрифугировали в течение 15 мин при 400 д, отбирали аликвоты над-осадка и замораживали их при температуре -20°С.
Синтетические пептиды
Иммуногенность рекомбинантных белков оценивали с использованием следующих синтетических пептидов, синтезированных НПО «Верта»:
M2ek SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD (M2e вируса гриппа А/Курган/05/05 (H5N1)),
M2eh SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (кон-сенсусная последовательность М2е вирусов гриппа А человека).
Отличающиеся аминокислотные остатки выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.
Иммуноферментный анализ
Уровни специфических IgG и IgA у мышей, иммунизированных рекомбинантными белками, определяли в ИФА в 96-луночных планшетах с высокой сорбци-
онной способностью (Greiner, Германия). На планшеты сорбировали М2е-пептиды (5 мкг/мл) или очищенный вирус А/Аичи/2/68 (H3N2) (2 мкг/мл) в ФБР (рН 7.2) в течение ночи при 40С.
Планшеты блокировали ФБР с 5% ЭТС (300 мкл/лунка) в течение 1 ч при комнатной температуре, затем планшеты отмывали 3 раза ФБР с Твин. В лунки планшетов добавляли по 100 мкл двукратных разведений сывороток или БАЛ в блокирующем буфере, инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Использовали поликлональные козьи антимышиные IgG и IgA (Abcam), меченные пероксидазой хрена в разведении 1 : 20000. В качестве субстрата использовали ТМБ (BD Bioscience, США), инкубация 15 мин. Оптическую плотность (ОП) измеряли с использованием микропланшетного ридера i-Mark (Bio-Rad) при длине волны 450 нм. За титр принимали наибольшее разведение сыворотки, при котором оптическая плотность по крайней мере в 2 раза превышает среднее значение бланка.
Вирусы и заражение мышей
В работе использован штамм, полученный из Коллекции вирусов гриппа и ОРЗ лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа НИИ гриппа Минздрава России - А/Аичи/2/68 (H3N2). Для заражения использовали вирус гриппа А/ Аичи/2/68 (H3N2), адаптированный к мышам. Этот штамм получен в НИИ гриппа серией пассажей (мышь/куриный эмбрион) родительского штамма дикого типа. Адаптированный штамм А/Аичи/2/68 (H3N2) сохранял антигенные свойства исходного штамма дикого типа, но приобрел способность летально инфицировать мышей. Аминокислотная последовательность поверхностных белков (M2, NA и HA) этого вируса была такой же, как у вируса гриппа дикого типа [6]. На 14-й день после последней иммунизации мышей Balb/c (по восемь мышей в опытных и контрольной группах) заражали адаптированным к мышам вирусом гриппа А/Аичи/2/68 (H3N2) в дозе 5LD50. Вирус вводили интраназально в объеме 50 мкл/мышь после ингаляционной анестезии (2-3% изофлюрана, 30% O2, 70% N2O). После заражения проводили ежедневное наблюдение за животными. Протективное действие рекомбинантных белков оценивали ежедневно по динамике падения массы тела и выживаемости мышей после заражения. В качестве отрицательного контроля в эксперименте по летальному заражению использовали мышей, которым вводили ФБР.
Репродукция вирусов гриппа в легких
Мышей (по три особи в каждой группе) интрана-зально заражали вирусами гриппа А/Аичи/2/68
(H3N2), A/PR/8/34 (H1N1) и А/Курган/5/05 (H5N1) в дозе 5LD50 через 14 дней после третьей иммунизации. На 6-й день после заражения мышей подвергали эвтаназии (С02-камера для эвтаназии, Vet Tech Solutions) и асептически удаляли легкие. Легкие гомогенизировали в 2.7 мл ФБР (Tissue Lyser II ho-mogenizer, Qiagen, США) для получения 10% (w/v) суспензии, центрифугировали в течение 15 мин при 400 g и 4°C для удаления клеточного дебриса и хранили при -20°C. Для определения титра вируса гриппа использовали культуру клеток MDCK в среде МЕМ, выращенных на 96-луночных панелях. Клетки заражали серийными десятикратными разведениями легочного гомогената (в квадрипликатах) от 10-1 до 10-8 и инкубировали в термостате (36.0 ± 0.50С) в течение 72 ч. По окончании срока инкубации куль-туральную жидкость переносили в лунки планшета для иммунологических реакций, после чего добавляли равный объем 1% куриных эритроцитов в физиологическом растворе. Уровень репродукции вируса в лунках панели оценивали по реакции гемагглюти-нации эритроцитов. Инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча. За титр вируса принимали величину, противоположную десятичному логарифму наибольшего разведения вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации, и выражали в логарифмах 50% тканевой цитопатической инфекционной дозы вируса (lg ТЦИД50).
Статистическая обработка
Статистическую обработку проводили в программе GraphPad Prizm v6.0. Статистическую значимость различий титров антител оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Показатели выживаемости сравнивали с использованием критерия Мантела-Кокса. Различия считали значимыми при р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ фрагмента НА2 (76-130) вирусов гриппа филогенетической группы II
Фрагмент НА2 (76-130) представляет собой большую а-спираль второй субъединицы НА, частично доступную с поверхности молекулы (рис. 1А). Консенсусные последовательности гемагглютининов вирусов гриппа филогенетической группы II (подтипы Н3 и Н7) в участке HA2 (76-130) идентичны на 63.6% (рис. 1Б). С учетом замен аминокислотных остатков на близкие по свойствам гомология составляет 80%. Для вирусов гриппа филогенетической группы II B- и СD4+ T-клеточные эпитопы сосредоточены в первой половине участка - аминокислоты
76
130
Сопаепзил НЗ Consensus Н7
consensus ИЗ Consensus Н7
Consensus ИЗ Consensus Н7
Consensus НЗ Consensus Н7
Consensus НЗ Consensus H7
Consensus ИЗ Consensus Н7
Consensus НЗ Consensus Н7
Consensus НЗ Consensus H7
Consensus НЗ Consensus Н7
Consensus НЗ Consensus H7
Consensus НЗ Consensus H7
( 1 > Ю71 JALIY : L-I1VFAQ Hi FXGtTONSTATl,; L G H iîAVPS'GTLVKTlTNDQ ( 1 >-----HHjçiLVFALCAXjP----TMADK§C LGHHAV5HGTXVNT§TERG
51
100
(51) IE VTNATE LVQSlSTGRI CD3PKQ if OGEf CTLiDflf LGDPHCI>gFQNKE (42 ) fE WHATET VE IP RIСSKGKB TfD LGf С G TfT G P PÇC OQELEFS 101 ISO
101 > WDLFfER3I«¥3NCYPYDVPDYaJ (92 > AOLliERJ«jsDVcyPGKrvWEEj
151 200
[PHHEKFDKLYTWG RKKPALIIWG
201 250
RGV3SRX5 PQVWGQ53RID
251 300
«151) 4142)
«19») (191)
(24 9) (241)
- I|E RRli5DVCYPGiCriNEE§LRgeRE 2GGBKE5KGFTfl|G§{lTN
_
[GTis ACgRH 3 VK 5 Fflp В» 4VLBX—L КУРЯ $ AMNV*MF HHE GAfs A -|R-SG53 F®E§K>: L L5R£№AA|Pgffri<lYKHT W
[201
■HHPSfCfPa :SLY§5fSG Rf rVSfKRS PH i GJR PWVRi
|H QT Kb vj SftJ KïflTV MYQ'0jr|P3 PQVM:
251
rlwreKPGDlgL IMSTGNLIA PRG Y FK§R 3GX33IMRSDAP rgKCN5| I F§WlJ®ÎIPïJDT^rrSFNGAFTAPDRASFlRGK3MGIQ3GVQVnBlJCE3f -301 3SO
(299) IT PNGjl PMDKPFQSeKRITYGACPRyVKaNfLKIATGieKVPEKÎ}----
I 2 91 I Y:-iSG3§I ISNLPFQNfNSRAVGKCPRYVKQEfLLIATG^NVP^IPKGSR
351ф__400
(34 S) - T RCfl FGAIJUS FI E M CWE СЯ DGW Y G Г R H 2 t*E 5T AA 0 L К ST S§A IX g (341) ЯзйфгвйхдегхздзтгсзВобиузгъкдэддоет^
401__1 SO
(394 ) tWGKUfRLI EKTHEKgHgJtiKZrseBBBGRlQiyHgVEBiKIHWSVNAE (391) ITGKLM RIIEXTNQQgE L I^ÎE F^£VEKQIGHllHFrRDBMfl»M S Y^AE 4SI S00
Щ4) LLVA§E ГЗ Q KT T OLTDSt" MNK LfE ЯТЖЦ. R £ Г ¡A AffiNGC FK l№ К "J DMA LLValEHSHT I DLADSETOTKLlERvSQLRENA^DaTGCFE I§FÎKCDD£>
| 501__SSO
IDVY ?ЛЕ »ЦП R f Q1KGVE LKS SYKDWILWI5 FflSC гИ 5КУЙ1ЕАВМ11 IQI DPVKLSSG ÏKÛVILWFS Г.: f|
(441)
(494) (491)
(544) (541)
' J-
1ДУАЙЕН flHT I ■'
01
m
551 ■
ЦстАШАмАСвквйВ
LLA|A|G LlFI CVKWG N§1
SIRMGTYO«3 SIRifNTYDHSKYi
S*?4 IRCKIC1 [RCTIC1
Рис. 1. А - bD-структура (тример, модель 4JTV RCSB Protein Data Bank) молекулы гемагглютинина (НА) вируса гриппа A/H3N2 (филогенетическая группа II): бежевым выделена субъединица HA1, серым - субъединица HA2, оранжевым - фрагмент HA2 76-130. Б — выравнивание консенсусных последовательностей HA вирусов гриппа A/H3N2 и A/H7 (включая человеческие изоляты) филогенетической группы II. Начало субъединицы НА2 указано стрелкой, фрагмент НА2 76-130 подчеркнут красным, желтым цветом обозначено полное совпадение последовательностей, зеленым - замены на близкие по свойствам аминокислоты, без цвета - аминокислотные замены, голубым - инсерции
76-103 (рис. 2А). Кроме того, участок НА2 (76-130) вирусов гриппа второй филогенетической группы содержит потенциальные CD8+ Т-клеточные эпитопы для различных аллелей HLA (рис. 2Б).
Дизайн рекомбинантных белков
В качестве консервативных пептидов, предназначенных для включения в состав рекомбинантных вакцин, были выбраны: «консенсусная» последовательность штаммов вируса гриппа А человека (М2еЬ), М2е вируса гриппа А/Курган/05/200 Н5Ш (М2ек), фрагмент второй субъединицы НА (76-130) вирусов гриппа филогенетической группы II (рис. 3).
Были созданы химерные гены, кодирующие гибридные белки, включающие последовательность флагеллина бактерии typhimurшm, к С-концу которого в различных сочетаниях были присоединены М2е-пептид разных подтипов вируса гриппа, а также консервативные фрагменты второй субъединицы гемагглютинина вирусов гриппа второй филогенетической группы (рис. 3). Рекомбинантный белок Flg-HА2-4M2e содержит последовательность флагеллина, к С-концу которой присоединен фрагмент второй субъединицы (76-130) НА вирусов гриппа филогенетической группы II, за которым следуют четыре копии М2е (М2Ь-М2к-М2Ь-М2к).
Белок Flg-4М2е-HА2 содержит последовательность флагеллина, к С-концу которой присоединены четыре копии М2е (М2^М2к-М2^М2к) и фрагмент второй субъединицы (76-130) НА вирусов гриппа филогенетической группы II. В этих белках последовательности М2е отделены друг от друга и от НА2 глицин-богатыми линкерами. «Сборку» химерных генов из отдельных компонентов проводили непосредственно в экспрессионном векторе pQE30. Ген флагеллина без собственного стартового кодона клонировали в сайт BamHI вектора, что обеспечивало экспрессию флагеллина с присоединенным к нему кодируемым вектором N-концевым 6His-тагом, предназначенным для очистки рекомбинантных белков методом металл-аффинной хроматографии.
Химерные гены получали с использованием стандартных методов генной инженерии. Ген флагеллина был получен ранее с помощью ПЦР на геномной ДНК S. typhimurium и клонирован. Нуклеотидные последовательности, кодирующие НА2 и тандемные копии М2е, синтезировали in vitro. Таким образом, созданы векторы pQE30_Flg_HА2-4М2е и pQE30_ Flg_4М2е-НА2, позволяющие получать соответствующие ре-комбинантные белки.
Гомологичное моделирование трехмерной структуры рекомбинантных белков Flg-HA2-4M2e и Flg-
А
80 90 100 110 120 130
Naэпитопa 0505050505 0
RIQOIJiKYVEPTK IDLHSYNAELLVALENQHTIDLT DSFMNKI, FEKTP.RQIJtENA
13575 EHQHTIDLT DSEMNKLFEKTBKQLREN AELTMGK^GCF
22098 GRIQOLEKYVEDTKIDLWS
30386 KEFSEVEGRigDLEKYV
зьгоо KlDLWSYMAELLVALE
31201 KlDLWS"OlA£LLVAL£i4QHTI
36498 I.TEKTNF.KFRQ JEKEFSSVEGRIQDLEKYVEDTK I
Ü0488 QOLEKYVEDTKIDLWS
50489 QOLEKYVKDTKlDLMSYMAELLVALEMQHTIDLT DS
62654 SiNAELLVALEHQHTI
97636 SEVEGBIQOLEKYVEDTK
113533 IDLWSYWAELLVAL
129078 KIDLWSVMAELLVALEM
129760 RIQOLEKYVKDTKIDLW
130384 YMAE LLVALEWQH TI DL
143421 KI DLWS*HA£LLVALEMQHT
422849 WSYHAELLVAMEMQHTI
Б
80 90 100 110 120 130
05050S050S 0
аплель RIQDLEKYVEDTKIDLWS WiA£LLVALQK»lTI DLT DSEMNKLfEKTßRQLRENA
ИИА-А*01з 01 LTDSEMNKL
Н1А-А*01:01 LTD3EMNKLP
Н1А-А*03:01 KLFEKTER
HLA-A*03:01 KI.FEKTRRQUf
НЪА-А*24:02 KYVEDTKIDLW
HLA-A*26:Ol DTKIDLWSY HTIDLTD3EM
RLA-ß*08:01 FEKTEftQL
1ША-В*39:01 YMAELLVAI,
НЬА-В*39з01 WSYNAEU.VAL
HLA-BM0:01 VKDTKIDL LEMQHT1DL
Рис. 2. А - экспериментальные B-и CD4+ Т-клеточные эпитопы, гомологичные фрагменту консенсусной последовательности НА2 (76-130) фрагмента более чем на 90%. Представлен результат поиска по базе данных IEDB, негомологичные аминокислоты выделены красным, зеленым цветом отмечен В-клеточный эпитоп. Б - потенциальные CD8+ Т-клеточные эпитопы в составе фрагмента НА2 (76-130) для репрезентативного набора аллелей HLA, результат анализа с использованием NetCTLpanl.1 Server [38]
4M2e-HA2 показало сохранение а-спирализации в участке НА2 (76-130) независимо от места их присоединения к флагеллину (рис. 4). Можно предположить, что нативная структура этого фрагмента НА2 скорее всего сохранена, и гибридные белки способны стимулировать образование антител, в том числе к структурным эпитопам, характерным для натив-ного НА. Однако между двумя белками существуют некоторые различия. В случае концевого присоединения НА2 структура антигена более компактна. 3D-структура четырех копий М2е существенно различалась в двух моделях рекомбинантных белков. Внутренняя локализация четырех копий М2е приводила к появлению частичной а-спирализации (Flg-4M2e-HA2), не характерной для нативной кон-формации М2е на поверхности вириона или инфицированной вирусом гриппа клетке (рис. 4). Концевое расположение М2е (Flg-HA2-4M2e) в большей степени сохраняло нативную конформацию М2е, неструктурированную в белке М2. Подобные конформацион-ные различия в структуре двух белков могут влиять на их иммуногенность.
Получение и очистка рекомбинантных белков
Нуклеотидные последовательности, кодирующие гибридные белки Flg-4M2e-HA2 и Flg-HA2-4M2e, были клонированы в вектор pQE30 и экспрессирова-ны в штамме E. coli DLT1270 (рис. 5А). Теоретически рассчитанная молекулярная масса белков составляла 73.9 кДа, что совпадало с величиной, определенной по их электрофоретической подвижности в ПААГ (рис. 5Б). Очищенные белки Flg-4M2e-HA2 и Flg-HA2-4M2e взаимодействовали в вестерн-блот с мо-ноклональными анти-М2е-антителами 14C2 (рис. 5Б). Поскольку показано, что антитела 14C2 распознают
M2h - консенсусная последовательность М2е вирусов гриппа А человека: SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD M2k - M2e A/Курган/05/2005 H5N1: SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD НА2 - фрагмент НА2 (76-130) филогенетической группы II вирусов гриппа:
RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEM-NKLFEKTRRQLRENA
Flg-HA2-4M2e
4> Fig I HA2 M2h l M2k M2h J- M2k
pQE30 _Flg_ H2_4M
Flg-4M2e-HA2
н>
Fig
M2k
M2k
pQE30_Flg_4M_H2
Рис. 3. Структура рекомбинантных белков Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2. Синий блок - флагеллин S. ty-phimurium; оранжевый блок - консенсусная последовательность М2е вирусов гриппа А человека; зеленый блок - М2е-пептид вируса гриппа A/Kurgan/5/05 RG (H5N1); желтый блок - фрагмент НА2 (76-130) вирусов гриппа филогенетической группы II
протективный эпитоп М2е [14, 43], полученные результаты подтверждают, что пептид М2е присутствует в обоих белках. Оба рекомбинантных белка были достаточно стабильными. Не выявлено признаков деградации белков при их хранении в течение 2 месяцев при 40С (рис. 5В).
Flg-HA2-4M2e
Flg-4M2e-HA2
Рис. 4. Теоретическое моделирование 3D-структуры мономерных реком-бинантных белков Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2. Желтым выделены М2е-пептиды, красным - фрагмент НА2 и голубым - флагеллин. Моделирование выполнено с помощью Phyre2 server, визуализация сделана с помощью UCSF Chimera
Сравнение иммуногенности рекомбинантных белков Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2
Иммуногенность гибридных белков Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2 оценивали на мышах Ва1Ь/с, иммунизированных 3 раза, интраназально. На 14-й день после третьей иммунизации в сыворотках и БАЛ пяти мышей каждой группы определяли присутствие анти-М2е- и анти-А/Н3^-антител в ИФА. Не выявлено различий в уровнях анти-М2е^ и анти-M2ek-IgG в сыворотках мышей, иммунизированных Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2 (р > 0.05) (рис. 6А). Но средний геометрический титр (СГТ) анти-М2е-IgG после иммунизации рекомбинантным белком Flg-HA2-4M2e был в 4-6 раз выше, чем у мышей, иммунизированных Flg-4M2e-HA2. Уровень анти-НА2-IgG к вирусу гриппа А/Аичи/2/68 (H3N2) также был значительно выше (рис. 6Б) у мышей, иммунизированных Flg-HA2-4M2е (различия между двумя белками были статистически значимыми, р = 0.0317).
Для изучения ^А- и IgG-специфического ответа на мукозальных поверхностях определяли титры M2eh- и M2ek-специфических ^А и IgG в БАЛ пяти мышей каждой группы через 14 дней после третьей иммунизации. Как показано на рис. 7, интраназаль-ная иммунизация гибридным белком Flg-HA2-4M2e стимулировала более высокие уровни IgG- и ^А анти-M2e в БАЛ, чем белок Flg-4M2e-HA2 (р < 0.05). Эти результаты показывают, что гибридный белок с концевым положением М2е-пептидов ^^-НА2-
А
кДа 1
100
70 mm
55 ^Vv'
35 К
25 щ
15 1
Б
Электрофорез
23 M 1 2 —(
.250
анти-М2е вестерн-бл( M 1
щ
150
100 75
50
37
25 20 15 10
250 150 100 75
50
37
25 20 15 10
Рис. 5. А - экспрессия рекомбинантных белков в клетках E. coli. На дорожке 1 представлены маркеры молекулярной массы в кДа (Fermentas,EC); 2 - лизат клеток, трансформированных плазмидой pQE30 Flg_ НА2_4М2е после индукции; 3 - лизат клеток, трансформированных плазмидой pQE30 Flg_4M2е_НА2 после индукции; Б - рекомбинантные белки Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2 после хроматографической очистки на Ni-сорбенте. Представлен результат электрофореза, а также вестерн-блот с использованием моноклональных анти-М2е-антител 14С2; В — реком-бинантные белки Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2 через 2 месяца хранения при 40С. Представлены результаты электрофореза: М - маркер молекулярной массы, 1 - Flg-HA2-4M2e, 2 - Flg-4M2e-HA2
2
Л
.0
и
о
го
J? 21 ш о
I
га
.о
а
• ■
• Flg-4M2e-HA2 ■ Flg-HA2-4M2e ФБР
M2eh
M2ek
«S 4096
.о
и m
О
g
2048
m I
\ <
-
s
H I
ra Z a.
1024
512
256
p = 0.0317 -►
Flg-4M2e-HA2 Flg-HA2-4M2e ФБР
Рис. 6. Титры антител у мышей экспериментальных и контрольной групп через 2 недели после третьей иммунизации гибридными белками Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2. Титры сывороточных IgG к таргетным антигенам: М2е пептидам (А) и к вирусу гриппа А/Аичи/2/68 (Н3№) (Б)
Б
20
2
2
5
2
Л
А Б
а
О J?
e
2 М2
I
га
.с О.
2048 512 12832
р = 0.0238 -
р =0.0159
А Б
m
A
J?
e
2 М2
I
га
.
128
32
р = 0.0159
Flg-4M2e-HA2 Flg-HA2-4M2e ФБР
P = 0.0159
M2eh
M2ek
M2eh
M2ek
Рис. 7. Титры антител в БАЛ к пептидам М2е у мышей экспериментальных и контрольной групп через 2 недели после третьей иммунизации гибридными белками Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2: СГТ IgG (А) и СГТ 1дА (Б)
Б
8
8
2
4M2e) был более иммуногенным, чем белок с внутренней локализацией этих пептидов (Flg-4M2e-HA2).
Сравнение протективных свойств рекомбинантных белков Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2
Для сравнения протективных свойств гибридных белков мышей (по восемь в каждой группе), иммунизированных гибридными белками Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2, заражали вирусом гриппа А/ Аичи/2/68 (H3N2) в дозе 5LD50 через 14 дней после
третьей иммунизации. В качестве контроля в опыте по летальному заражению использовали мышей, которым интраназально вводили ФБР. В течение 14 дней после заражения ежедневно оценивали падение массы тела (показатель тяжести гриппозной инфекции) и выживаемость. Из рис. 8А видно, что у мышей, иммунизированных Flg-HA2-4M2e, максимальная потеря массы тела составила 13% на 4-й день после заражения, а у мышей, иммунизированных гибридным белком Flg-4M2e-HA2, - 20% на 8-й день после заражения. Максимальная потеря массы тела у кон-
Flg-4M2e-HA2
Flg-HA2-4M2e
ФБР
Л
о
X
Ч
О х и s н О
"-S
о
3 ¡3 асЗ
t X
ш ^
о. ?
х со
<и с
m
110
100
90
80
70
60-
10
Б
100
--S
и о
(U га m s £ .0 со
50-
Р = 0.0007
Р = 0.0066
10
—I
15
Дни после заражения
Дни после заражения
A/H1N1
A/H3N2
A/H5N1
Рис. 8. Протективность рекомбинантных белков Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2. Через 2 недели после третьей иммунизации мышей интраназально заражали вирусом гриппа А/Аичи/2/68 (H3N2) в дозе 5LD50. Динамику массы тела (A) и гибели мышей (Б) наблюдали ежедневно в течение 14 дней. Значение p высчитывали с помощью критерия Мантела-Кокса. В - репродукция вируса гриппа в легких мышей. Через 2 недели после третьей иммунизации мышей интраназально заражали вирусом гриппа А/Аичи/2/68 (H3N2), A/PR/8/34 (H1N1) и А/ Курган/5/05 (H5N1) в дозе 5LD50. Вирусные титры определяли на 6-й день после заражения. Результаты представлены в lg ТЦИД50. Нижний предел определения - 0.5 lg ТЦИД50. Статистическое отличие от контрольной группы определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. 'Статистически значимое отличие от контрольной группы, р < 0.05
0
0
В
трольных животных, также отмеченная на 8-й день, составила 28%. Полученные данные свидетельствуют о более легком течении инфекции у мышей, получавших гибридный белок Flg-HA2-4M2e. Иммунизация гибридным белком Flg-HA2-4M2e обеспечивала полную защиту (рис. 8Б) от летального заражения (выживаемость 100%), тогда как выживаемость мышей, получавших Flg-4M2e-HA2, составила 87.5%, а контрольных животных - 12.5% (статистически значимое отличие опытных групп от контрольных, р = 0.0007 и р = 0.0066, критерий Montel-Cox).
Для определения титров вируса в легких через 2 недели после окончания протокола иммунизации
мышей опытных и контрольной групп (по три особи каждой группы) интраназально заражали вирусами гриппа A/PR/8/34 (НШ1), А/Аичи/2/68 (Н3Ш) и А/Курган/05/05 (Н5Ш) в дозе 5LD50. На 6-й день после заражения мышей скарифицировали для титрования остаточного количества вирусов гриппа в легких. Мы наблюдали значительное снижение вирусных титров в легких иммунизированных мышей по сравнению с контрольными (рис. 8В). Иммунизация мышей гибридным белком Flg-HA2-4M2e снижала титр вируса в легких на 3.7, 3.3 и 3.3 log10 при заражении вирусами гриппа A/PR/8/34 (НШ1), А/Аичи/2/68 (Н3Ш) и А/Курган/05/05
(H5N1) соответственно, что статистически значимо отличалось от значений в контроле (р < 0.05, критерий Манна-Уитни). Гибридный белок Flg-4M2eh-HA2 приводил к менее выраженному снижению репродукции вирусов в легких (на 2.0, 3.2 и 2.4 log10 соответственно), однако отличия от контроля были выявлены (р < 0.05).
ВЫВОДЫ
Высококонсервативный эктодомен белка М2 и консервативные регионы второй субъединицы НА являются перспективными антигенами для создания вакцин с широким протективным потенциалом. Вакцинный белок, содержащий два или более консервативных таргетных антигена, стимулирующих формирование различных звеньев иммунного ответа (антител с различным механизмом действия, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов), позволит усилить эффективность таких препаратов. Гибридный белок на основе флагеллина и консервативных фрагментов двух белков вируса гриппа (М2е и НА2 76-130) сочетает адъювантную активность флагеллина, обусловленную его специфическим связыванием с TLR5, консервативность М2е среди вирусов гриппа А человека и птиц (формирование не нейтрализующих антител с механизмом действия, связанным с АЗКЦ) и консервативность участка стеблевой части молекулы гемагглютинина, содержащей потенциальные В-клеточные (формирование нейтрализующих и не нейтрализующих антител), а также CD4+ и CD8+ Т-клеточные эпитопы.
Сконструированы два рекомбинантных белка с различным порядком присоединения к С-концу флагеллина М2е-пептидов разных подтипов вирусов гриппа А и консервативного фрагмента второй субъ-
единицы гемагглютинина вирусов гриппа второй филогенетической группы. Показана возможность получения стабильного рекомбинантного белка с двумя таргетными антигенами (гетерологичного М2е и НА2 (76-30)), слитыми с флагеллином. Такой белок обладает иммуногенностью, стимулирует формирование антител как к М2е, так и антител, связывающихся с НА вируса гриппа. Рекомбинантный белок защищал мышей от летального заражения и значительно снижал вирусную нагрузку в легких. Показано, что порядок расположения таргетных антигенов в рекомбинантном белке может влиять на третичную структуру рекомбинантного белка, а также на его иммуногенность и протективный эффект. Выявлены различия в уровне продукции антител двумя гибридными белками, что свидетельствует о большей им-муногенности гибридного белка с концевым положением М2е, чем белка с концевым положением НА2. Протективный эффект двух белков также различался. Белок с концевым расположением М2е приводил к полной защите животных от летального заражения вирусом гриппа А/Н3^ и быстрое восстановление их веса после небольшого снижения. Кроме того, высокую эффективность белка Flg-HA2-4M2e подтверждает также более выраженное снижение вирусной нагрузки в легких мышей по сравнению с белком Flg-4M2eh-HA2.
Дальнейшие исследования будут направлены на выяснение роли каждого из таргетных антигенов в составе слитого белка в формировании протектив-ного иммунитета, длительности его сохранения и широты защитного действия. •
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 15-14-00043).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Fan J., Liang X., Horton M.S., Perry H.C., Citron M.P., Heidecker G.J., Fu T.M., Joyce J., Przysiecki C.T., Keller P.M., et al. // Vaccine. 2004. V. 22. № 23-24. P. 2993-3003.
2. Huleatt J.W., Nakaar V., Desai P., Huang Y., Hewitt D., Jecobs A., Tang J., McDonald W., Song L., Evans R.K., et al. // Vaccine. 2008. V. 26. № 2. P. 201-214.
3. Fiers W., De Filette M., El Bakkouri K., Schepens B., Roose K., Schotsaert M., Birkett A., Saelens X. // Vaccine. 2009. V. 27. № 45. P. 6280-6283.
4. Schotsaert M., De Filette M., Fiers W., Saelens X. // Expert Rev. Vaccines. 2009. V. 8. № 4. P. 499-508.
5. Turley C.B., Rupp R.E., Johnson C., Taylor D.N., Wolfson J., Tussey L., Kavita U., Stanberry L., Shaw A. // Vaccine. 2011. V. 29. № 32. P. 5145-5152.
6. Stepanova L.A., Kotlyarov R.Y., Kovaleva A.A., Potapchuk M.V., Korotkov A.V., Sergeeva M.V., Kasianenko M.A., Kupri-anov V.V., Ravin N.V., Tsybalova L.M., et al. // PLoS One. 2015. V. 10. № 3. P. e0119520.
7. Tsybalova L.M., Stepanova L.A., Kuprianov V.V., Blokhina E.A., Potapchuk M.V., Korotkov A.V., Gorshkov A.N., Kasy-anenko M.A., Ravin N.V., Kiselev O.I. // Vaccine. 2015. V. 33. № 29. P. 3398-3406.
8. Neirynck S., Deroo T., Saelens X., Vanlandschoot P., Jou W.M., Fiers W. // Nat. Med. 1999. V. 5. № 10. P. 1157-1163.
9. Mozdanovska K., Maiese K., Furchner M., Gerhard W. // Virology. 1999. V. 254. № 1. P. 138-146.
10. Tompkins S.M., Zhao Z.C., Lo C.Y., Misplon J.A., Liu T., Ye Z., Hogan R.J., Wu Z., Benton K.A., Tumpey T.M., Epstein S.L. // Emerg. Infect. Dis. 2007. V. 13. № 3. P. 426-435.
11. Beerli R.R., Bauer M., Schmitz N., Buser R.B., Gwerder M., Muntwiler S., Renner W.A., Saudan P., Bachmann M.F. // Virol. J. 2009. V. 6. P. 224-235.
12. Jegerlehner A., Schmitz N., Storni T., Bachmann M.F. // J. Immunol. 2004. V. 172. P. 5598-5605.
13. El Bakkouri K., Descamps F., De Filette M., Smet A., Festjens E., Birkett A., van Rooijen N., Verbeek S., Fiers W., Saelens X. // J. Immunol. 2011. V. 186. P. 1022-1031.
14. Treanor J. J., Tierney E.L., Zebedee SL., Lamb R.A., Murphy B.R. // J. Virol. 1990. V. 64. P. 1375-1377.
15. Gerhard W., Mozdzanowska K., Zharikova D. // Emerg. Infect. Dis. 2006. V. 12. № 14. P. 569-574.
16. Trosby M., van den Brink E., Jongeneelen M., Poon L.L., Alard P., Cornelissen L., Bakker A., Cox F., van Deventer E., Guan Y., et al. // PLoS One. 2008. V. 3. № 12. P. e3942.
17. Prabhu N., Prabakaran M., Ho H.T., Velumani S., Qiang J., Goutama M., Kwang J. // J. Virol. 2009. V. 83. № 6. P. 25532562.
18. Wang T.T., Tan G. S., Hai R., Pica N., Petersen E., Moran T.M., Peter Palese P. // PLoS Pathogens. 2010a. V. 6. № 2. P. e1000796.
19. Wei C.J., Boyington J.C., McTamney P.M., Kong W.P., Pearce M.B., Xu L., Andersen H., Rao S., Tumpey T.M., Yang Z.Y., et al. // Science. 2010. V. 329. № 5995. P. 1060-1064.
20. Corti D., Voss J., Gamblin S.J., Codoni G., Macagno A., Jarrossay D., Vachieri S.G., Pinna D., Minola A., Vanzetta F., et al. // Science. 2011. V. 333. № 6044. P. 850-856.
21. Wrammert J., Koutsonanos D., Li G.M., Edupuganti S.,
Sui J., Morrissey M., McCausland M., Skountzou I., Hornig M., Lipkin W.I., et al. // J. Exp. Med. 2011. V. 208. № 1. P. 181-193.
22. Ekiert D.C., Friesen R.H., Bhabha G., Kwaks T., Jongeneelen M., Yu W., Ophorst C., Cox F., Korse H.J., Brandenburg B., et al. // Science. 2011. V. 333. № 6044. P. 843-850.
23. Wang T.T., Tan G.S., Hai R., Pica N., Ngai L., Ekiert D.C., Wilson I.A., Garcia-Sastre A., Moran T.M., Palese P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010b. V. 107. № 44. P. 18979-18984.
24. Bommakanti G., Citron M.P., Hepler R.W., Callahan C., Heidecker G.J., Najar T.A., Lu X., Joyce J.G., Shiver J.W., Casimiro D.R., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. № 31. P. 13701-13706.
25. Schneemann A., Speir J.A., Tan G.S., Khayat R., Ekiert D.C., Matsuoka Y., Wilson I.A. // J. Virol. 2012. V. 86. № 21. P. 11686-11697.
26. Stanekova Z., Adkins I., Kosova M., Janulikova J., Sebo P., Vareckova E. // Antiviral Res. 2013. V. 97. № 1. P. 24-35.
27. Stepanova L.A., Sergeeva M.V., Shuklina M.A., Shaldzhyan
A.A., Potapchuk M.V., Korotkov A.V., Tsybalova L.M. // Acta Naturae. 2016. V. 8. № 2. P. 116-126.
28. Delaney K.N., Phipps J.P., Johnson J.B., Mizel S.B. // Viral Immunol. 2010. V. 23. P. 201-210.
29. Cuadros C., Lopez-Hernandez F.G., Dominguez A.L., McClelland M., Lustgarten J. // Infect. Immun. 2004. V. 72. P. 2810-2816.
30. Honko A.N., Sriranganathan N., Lees C.J., Mizel S.B. // Infect. Immun. 2006. V. 74. P. 1113-1120.
31. Bates J.T., Honko A.N., Graff A.H., Kock N., Mizel S.B. // Mech. Ageing Dev. 2008. V. 129. P. 271-281.
32. Song L., Zhang Y., Yun N.E., Poussard A.L., Smith J.N., Smith J.K., Borisevich V., Linde J. J., Zacks M.A., Li H., et al. // Vaccine. 2009. V. 27. № 42. P. 5875-5884.
33. Wang B.-Z., Xu R., Quan F.-S., Kang S.M., Wang L., Compans R.W. // PLoS One. 2010. V. 5. P. e13972.
34. Liu G., Tarbet B., Song L., Reiserova L., Weaver B., Chen Y., Li H., Hou F., Liu X., Parent J., et al. // PLos One. 2011. V. 6. № 6. P. e20928.
35. Katoh K., Misawa K., Kuma K., Miyata T. // Nucl. Acids Res. 2002. V. 30. № 14. P. 3059-3066.
36. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M. // Bioinformatics. 2012. V. 28. № 8. P. 1166-1167.
37. Vita R., Zarebski L., Greenbaum J.A., Emami H., Hoof I., Sa-limi N., Damle R., Sette A., Peters B. // Nucl. Acids Res. 2010. V. 38. Database issue. P. D854-D862.
38. Stranzl T., Larsen M.V., Lundegaard C., Nielsen M. // Im-munogenetics. 2010. V. 62. № 6. P. 357-368.
39. Pettersen E.F., Goddard T.D., Huang C.C., Couch G.S., Greenblatt D.M., Meng E.C., Ferrin T.E. // J. Comput. Chem. 2004. V. 25. № 13. P. 1605-1612.
40. Kelley L.A., Sternberg M.J. // Nat. Protoc. 2009. V. 4. № 3. P. 363-371.
41. Grant S., Jessee J., Bloom F., Hanahan D. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. № 12. P. 4645-4649.
42. Laemmli U.K. // Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-685.
43. Zharikova D., Mozdzanowska K., Feng J., Zhang M., Gerhard W. // J. Virol. 2005. V. 79. P. 6644-6654.
