CC BY
468
© Л. М. ЦЫБАЛОВА, О. И. КИСЕЛЕВ, 2012 УДК 615.371:578.832.1].012
Л. М. Цыбалова, О. И. Киселев
Универсальные вакцины против гриппа. Разработки, перспективы использования
ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербург
В обзоре дан анализ разработок генно-инженерных вакцин против гриппа на основе консервативных эпитопов поверхностных белков вируса гемагглютинина, нейраминидазы и эктодомена матриксного белка М2. Оценена способность подобных вакцин индуцировать иммунный ответ против широкого спектра вирусов гриппа. Рассмотрены способы повышения иммуногенности и протективных свойств вакцин на основе консервативных эпитопов поверхностных гликопротеидов вируса и перспективы их использования для профилактики гриппа.
Ключевые слова: вирусы гриппа, рекомбинантные белки, универсальные вакцины
universal influenza vaccines: Developments, prospects for use
L. M. Tsybalova, O. I. Kiselev
Research Institute of Influenza, Ministry of Health and Social Development of Russia, Saint Peterburg
The review analyzes the developments of genetic engineering influenza vaccines based on the conservative epitopes of viral surface proteins, such as hemagglutinin, neuraminidase, ectodomain of matrix protein М2. it estimates the capacity of the vaccines to induce an immune response to a wide variety of influenza viruses, considers ways to increase the immunogenicity and protective properties of the vaccines, based on the conservative epitopes of viral surface proteins, and prospects for their use to prevent influenza.
Key words: influenza viruses, recombinant proteins, universal vaccines
Высокая изменчивость поверхностных белков вируса гриппа - гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) - приводит каждые 1-2 года к появлению вирусов с новыми антигенными свойствами, что позволяет ему преодолевать штаммоспецифический иммунитет населения и получать эпидемическое распространение. В связи с этим практически ежегодно требуется замена штаммов вирусов, входящих в состав вакцин против гриппа. Традиционные вакцины, живые и инактивированные, включающие НА, являются вакцинами со стерилизующим эффектом, способными предотвращать развитие инфекции в организме. Однако иммунитет, индуцированный НА в составе гриппозной вакцины, является штаммоспецифическим, т. е. протективным по отношению к идентичным или близкородственным штаммам вируса гриппа. Это существенный недостаток традиционных вакцин. Вторым недостатком является длительный процесс получения производственного вакцинного штамма и производства самих вакцин - 6 мес и более, что не позволяет предупредить стремительное распространение новых вирусов гриппа. Производство современных вакцин требует большого количества куриных яиц - ценного пищевого продукта. Кроме того, яичный белок овальбумин является аллергеном, что также снижает ценность вакцин.
Новые технологии, в первую очередь создание вакцинных штаммов методом генной инженерии, позволяют во многом избежать указанные недостатки и существенно расширяют возможности вакцинопрофилактики. Получаемые генно-инженерным путем рекомбинантные вирусные белки нарабатываются в более рентабельных, чем куриные эмбрионы, системах - бактериальных, дрожжевых, растительных. При этом решаются проблемы биобезопасности, общие для вакцин, основанных на цельном патогене, открываются возможности получения вакцин с заданными свойствами, в том числе с широким спектром
действия - универсальных.
В последнее десятилетие активно разрабатывается идея единой (универсальной) вакцины против всех субтипов вируса гриппа А [8, 10, 18, 19, 26, 28, 39-41]. Эпидемиологические наблюдения подтверждают реальность ее осуществления. Даже во время пандемий гриппа, когда циркулируют вирусы с совершенно новыми для человеческой популяции одним или обоими поверхностными антигенами, заболеваемость среди лиц старшего возраста в несколько раз меньше, чем среди детей и подростков [5, 7]. Такую же закономерность наблюдали на вспышках гриппа, вызванных вирусом птиц А(Н5Ш), имеющим абсолютно новый для человека субтип НА. В возрастной структуре заболевших доля детей 0-9 лет составила 26%, подростков в возрасте 10-19 лет - 29%, а доля лиц 30-39 лет и старше 40 лет составила соответственно 16 и 5,9%.
На примере двух популяций (жители Великобритании и Вьетнама) было показано, что 80-90% здоровых индивидуумов, никогда не инфицированных вирусом А(Н5Ш), имели специфические CD4+ и СD8+-клетки, распознающие эпитопы внутренних белков вируса А(Н5Ш) [35]. При этом иммунодоминантными белками являются ма-триксный белок (М) и нуклеопротеин (NP), что делает их перспективными для включения в состав универсальных вакцин. Вместе с тем поверхностные белки НА и NA имеют высококонсервативные фрагменты, которые также используются при создании вакцин с широким спектром действия [8-10].
В данном обзоре проводится анализ разработок универсальных вакцин на основе поверхностных гликопротеидов вируса гриппа А: НА, NA и эктодомена белка М2.
Вакцины на основе консервативных эпитопов НА и NA
Молекула НА состоит из двух фрагментов, связанных
Контактная информация:
Цыбалова Людмила Марковна, д-р мед. наук, зам. дир.; e-mail: sovet@influenza.spb.ru
9
дисульфидным мостиком: НА1 (320-330 аминокислот) -глобулярная часть, дистальная от вирусной мембраны, и НА2 (~ 180 аминокислот) - стеблеподобная часть, заякоренная в вирусную мембрану. В «головке» апикальной части молекулы НА локализуется 5 антигенных сайтов, и вируснейтрализующая активность антител связана с иммунным ответом на эти сайты. Антитела к НА блокируют взаимодействие вируса с клеточными рецепторами, чем предотвращают инфицирование клеток. Вместе с тем функциональная активность НА нейтрализуется также антителами, реагирующими с эпитопами в стебле молекулы [33] или в сайте расщепления [10]. Молекула НА в стеблевой части содержит консервативные аминокислотные последовательности, характерные для разных субтипов вируса гриппа А [24, 42, 46].
Высоким консерватизмом отличается пептид слияния (fusion-пептид), расположенный в N-терминальной части субъединицы НА2, который обеспечивает в кислой среде (рН < 7,0) прикрепление вируса к мембране клетки и проникновение NP из эндосом в цитоплазму [13]. Его 11 аминокислот на N-конце практически идентичны для НА 16 субтипов вируса гриппа А и имеют всего 2 аминокислотные замены в вирусах гриппа В обеих генетических линий (ямагатской и викторианской) [10]. Показано, что моноклональные антитела (МаЬ1С9) к фрагменту fusion-пептида GLFAIAGF обеспечивают 100% защиту мышей, зараженных 5 LD50 вируса А(Н5Ш) двух различных клайдов [45] и ускоряют очищение легких от вирусов. Аналогичные результаты были получены при инфекции вирусом АН3Ш [23].
При естественной инфекции и вакцинации традиционными вакцинами антитела к этим участкам вырабатываются слабо [48] и обнаруживаются в титрах, близких к неспецифическим показателям. Вместе с тем fusion-пептид, конъюгированный с белковым носителем, и в присутствии адъюванта является достаточно иммуногенным для того, чтобы защитить около 70% особей мышей от смертельных доз вируса гриппа А субтипов Н3 и Н1 [10].
Три эпитопа НА (два из апикальной части молекулы 91-108 и 307-319 аминокислот и один из стеблевой части 354-372 аминокислоты) наряду с эпитопами белков NP, М1 были включены в вакцину, разработанную в Weizmann Institute (Израиль) [8, 9]. Выбранные эпитопы не только имеют высокую степень гомологии для большинства вирусов гриппа А, но и рестриктируются молекулами НLА, превалирующими в человеческой популяции, что обусловливает высокую иммуногенность вакцины. В качестве белкового носителя и одновременно адъюванта был использован рекомбинантный фла-геллин - лиганд ТоИ-подобного рецептора 5 (TLR5). Эта вакцина (Multimeric-001 Universal) успешно прошла I/II фазы клинических испытаний в конце 2009 г., о чем было устно сообщено на 3-й Международной конференции по гриппозным вакцинам. Показано, что направленность как клеточного, так и антительного ответа касалась как вирусов гриппа А, так и вирусов гриппа В.
Антитела ко второму поверхностному белку NА блокируют выделение вирусов инфицированными клетками, снижая скорость распространения инфекции. Антитела к NА, приобретенные в результате естественной инфекции или иммунизации, повышают резистентность к инфекции как у людей, так и у лабораторных животных [25, 30 - 32]. Показана 100% защита лабораторных животных, вакцинированных плазмидной ДНК, кодирующей NА одного из субтипов вируса гриппа, при заражении их разными вирусами, имеющими один субтип NА [12, 36]. Вместе с тем препарат теряет свою протек-тивность при делеции 60 нуклеотидов (20 аминокислот) в 5’-конце или 66 нуклеотидов (22 аминокислоты) в 3’-конце [36].
В современных вакцинах доза NА в отличие от НА не регламентируется, однако целесообразно исследовать количественную связь между дозой NА и кроссреактивностью вакцины и пересмотреть требования к содержанию NА в вакцинах.
Эктодомен матриксного белка М2 как основной элемент универсальной вакцины
Одним из наиболее перспективных кандидатов для создания универсальной вакцины является матриксный М2-белок вируса гриппа А. М2 - один из трех белков вируса гриппа А, экспрессируемых на поверхности вириона. Его внеклеточный фрагмент обозначается как М2е. Белок формирует ионный канал на поверхности вириона и путем регуляции РН способствует процессу «раздевания» вируса в эндосомах инфицированных клеток. Он вносит существенный вклад в развитие окислительного стресса при гриппе, и индукция иммунного ответа на этот белок представляется высокофункциональной для защиты от гриппозной инфекции.
Белок М2 производится трансляцией сплайсированной мРНК, происходящей из сегмента 7, который кодирует также белок М1 [27, 34]. Остаток 1-9 М2 и М1 кодируется одними и теми же нуклеотидами в одной рамке считывания, а остатки 10-24 белка М2 и 10-252 белка М1 имеют разные рамки считывания. Во многом консервативность М2е обусловлена его генетической связью с протеином М1, самым консервативным вирусным белком [22]. В вирусах, циркулирующих в человеческой популяции, белок М2е практически не претерпел изменений с 1933 г. (рис. 1). Однако аминокислотная последовательность М2е вирусов птиц, в том числе субтипов вирусов, патогенных для человека - Н5Ш, Н9№, отличается по 3-6 аминокислотным позициям [51], что следует учитывать при конструировании универсальной вакцины.
Существенным свойством белка М2 является его прямое отношение к двум важнейшим характеристикам пандемических вирусов - контагиозности и способности вызывать ацидоз в пораженных инфекцией тканях, воздействуя на К/Ыа ионные каналы инфицированных клеток. Первый фактор определяет скорость распространения вируса и генетически детерминирован мутациями в положениях 14 и 55 [43]. Второй фактор не имеет такого генетического маркера и относится к структуре белка М2 в целом, если не учитывать мутации резистентности к ремантадину в положении 31 (Ser31Asp), снижающие активность протонного насоса тетрамера этого белка.
Белок М2е имеет чрезвычайно малые размеры (24 аминокислоты) и низкую плотность на вирусной мембране (около 20 тетрамеров), тогда как НА представлен 400 тримерами, а NА - 100 тетрамерами. На инфицированной клетке плотность белка М2е высокая. В процессе естественной инфекции или вакцинации традиционными вакцинами этот пептид проявляет слабые иммуногенные свойства [11] из-за выраженной антигенной конкуренции со стороны НА и NА [22, 29]. Низкие титры антител к М2е исключают иммунопрессинг со стороны популяции. Это, вероятно, вторая причина его высокой консервативности [22]. Вместе с тем было смоделировано появление вирусов-мутантов по М2е путем введения моноклональных антител к М2е-белку иммунодефицитным мышам, инфицированным вирусом А/РЯ/8/34. В таких условиях возникли только 2 мутации в позиции 10 (Р 10L) и (Р 10Н). У мышей линии ВАЬВ, вакцинированных М2е, через 11 пассажей вирусом РЯ/8/34 мутации в М2е получить не удалось [22, 53].
Слабая иммуногенность М2е-белка в вакцинных препаратах преодолевается различным путем. В настоящее время существует несколько эффективных кандидатных вакцин, находящихся в разной стадии разработки. В этих
10
Штаммы — — 2 3 4 5 6 7 8 9 # 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Человеческий A/Singapore/1 /57 (H2N2) S L L T E V E T p I R N E W G C R C N D S S D
A/Leningrad/134/57 (H2N2) S L L T E V E T p I R N E W G C R C N D S S D
A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) S L L T E V E T p I R N E W G C R C N D S S D
A/WSN/33 (H1N1) S L L T E V E T p I R N E W G C R C N D S S D
A/PR/8/34 (H1N1) S L L T E V E T p I R N E W G C R C N G S S D
A/USSR/90/77 (H1N1) S L L T E V E T p I R N E W G C R C N D S S D
А/Port Chalmers/1/73 (H3N2) S L L T E V E T p I R N E W G C R C N D S S D
A/Shiga/25/97 (H3N2) S L L T E V E T p I R N E W G C R C N D S S D
A/Aichi/2/68 (H3N2) S L L T E V E T p I R N E W G C R C N D S S D
A/Bangkok/1/79 (H3N2) S L L T E V E T p I R N E W G C R C N D S S D
A/Guangdong/39/89 (H3N2) S L L T E V E T p I R N E W G C R C N D S S D
A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) S L L T E V E T p I R N E W G C R C N D S s D
A/California/09 (H1N1)v S L L T E V E T p T R S E w E C R C S D S s D
A/Arizona/01/2009 (H1N1)v S L L T E V E T p T R S E w E C R C S D S s D
Птичий A/Duck/Potsdam1402-6/1986 (H5N2) S L L T E V E T p T R N G w E C К C S D S s D
A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) S L L T E V E T p T R N E w E C R C S D S s D
Свиной A/Svine/lowa/15/1930 (H1N1) S L L T E V E T p T R N E w G C R C N D S s D
А/New Jersey/11/1976 (H1N1) S L L T E V E T p I R S E w G C R C N D S s D
Рис. 1. Аминокислотная последовательность эктодомена белка М2 у вирусов гриппа А различного происхождения.
вакцинах М2е представляется в контексте разветвленного синтетического комплекса [39], вирусоподобных частиц [14, 40] или белковых носителей [18, 37], в виде ДНК-вакцины на основе плазмиды, содержащей гены М1 и М2 [41, 49].
Одна из первых удачных конструкций была получена в Гентском университете (Бельгия) группой Walter Fiers. Белок М2е был генетически связан с коровым белком вируса гепатита В (НВс) и ген, кодирующий гибридный белок М2еНВс, был экспрессирован в клетках Е. coli [14, 40].
Белок НВс в процессе синтеза способен к самосборке и формирует наноразмерные частицы, неотличимые по своим иммунологическим и морфологическим признакам от синтезируемых вирусом. Белок НВс легко накапливается в клетках Е. coli с образованием вирусоподобных частиц и является прекрасным иммуногеном. Он индуцирует как Т-зависимый, так и Т-независимый иммунный ответ [38]. НВс генетически нерестриктируем и распространяет эти свойства на фьюжин эпитопы [38]. В работах ряда исследователей показано, что химерные частицы НВс-антигена, экспонирующие на своей поверхности чужеродные эпитопы, способны индуцировать высокий иммунный ответ на встроенные пептиды, и присутствие антител к НВс не влияет на иммуногенность препарата [16].
В настоящие время достаточно полно изучены иммуногенные и протективные свойства гибридного белка М2еНВс, экспрессируемые клетками Е. coli [14, 19, 20, 40]. Антитела, вырабатываемые на М2е, относятся к разным подтипам IgG, что указывает на вовлечение в иммунный ответ клеток как Th1- так и ^2-типов. Внутрибрюшинная иммунизация мышей с адъювантом или интраназальная без адъюванта индуцирует выработку сывороточных антител и обеспечивает полную защиту от последующего заражения летальными для мышей как гомологичными, так и гетерологичными вирусами грип-
па [40]. 100% протективность достигается при уровне 104 IgG2а в сыворотке крови [19]. Защитное действие этой вакцины сохраняется не менее полугода, обусловливается циркулирующими антителами, которые при пассивной иммунизации обеспечивают 100% протективное действие. Защитный эффект рекомбинантной вакцины, полученной на основе эктодомена М2-белка вируса гриппа, показан на разных лабораторных животных, в том числе на хорьках и обезьянах [18, 50].
Высокий протективный эффект имеет созданный путем синтеза полиантигенный пептид, включающий М2е от вируса PR/8/34 и ковалентно связанный с ним пептид, активирующий Т-хелперы [39, 53]. Синтезированный белок М2е-МАР индуцировал сильный ответ антителами и не индуцировал цитотоксические Т-клетки.
Альтернативный подход - стимуляция Т-клеточно-опосредованного иммунитета, особенно вирусспецифич-ных CD8+CTL, направленных к высококонсервативным белкам, так же как и CD4+, которые осуществляют помощь в образовании и сохранении клеток памяти CD8, - используется в ДНК-вакцинах. Хотя СТЬ не предотвращают инфекцию, они способны обеспечивать частичную защиту против гриппа путем вирусного очищения и снижения тяжести симптомов [22, 35]. Иммунизация ДНК-плазмидой с включенными М1- и М2-генами вируса А/PR/8/34 продемонстрировала высокую цитотоксическую активность как при интраназальном, так и при парентеральном способе введения [41]. Антительный ответ также индуцировался, хотя не носил нейтрализующий характер. Протективность препарата составила 70-80% при заражении разными штаммами вируса АНШ1. В работе S. M. Tompkins и соавт. показано, что более эффективна была иммунизация ДНК-плазмидой, содержащей М2-ген, чем плазмидой, содержащей полноразмерный ген М [49].
11
Повышение эффективности вакцинных препаратов с М2е-белком
Усовершенствование препаратов осуществляют несколькими путями. Во-первых, за счет изменения генетической конструкции. Сравнение конструкций с М2е, встроенным в иммунодоминантную петлю НВс и присоединенным к N-концу, не показало существенную разницу в иммуногенности [14]. Заметные улучшения наблюдали при использовании нескольких последовательностей М2е, расположенных тандемно. При увеличении копий М2е на N-конце удалось достичь как наивысшего иммунного ответа, так и 100% защиты лабораторных животных [14]. Во-вторых, существенное значение имеет белковый носитель. Пептиды - слабые иммуногены и быстро деградируют внутри организма. В опытах с использованием М2-пептидов требовалось включение в состав препарата носителей, подобных НВс [22, 40], мембранного белка Neisseria meningitidis (ОМРС) [18], флагеллина [26]. В-третьих, препараты усовершенствуются за счет подбора адъюванта. Адъювант не только увеличивает индукцию антител и Т-клеток, но часто определяет, по какому пути (Th1 или Th2) пойдет иммунная реакция организма. Так, RC-529, синтетический адъювант, испытанный в клинических условиях [14, 44], напрямую действует на TLR4 [17]. При интраназаль-ном введении показана эффективность энтеротоксинов Е. coli и Vibrio cholerae [14, 15]. Добавление адъюванта из термолабильного энтеротоксина Е. соН - LTR 192G - штамма со сниженной токсичностью значительно увеличивает титры циркулирующих антител (IgG1, IgG2a и IgG2b). Кроме того, при интраназальной иммунизации в крови определялись и IgA, отсутствующие при парентеральной. Интраназальное введение М2еНВс с мукозальным адъювантом на основе холерного энтеротоксина СТА1-ДД усиливало иммуногенность вакцины и обеспечивало полную защиту животных [15].
Использование веществ с лигандами к ТоП-подобным рецепторам играет важную роль в инициации адаптивного иммунитета посредством активации дендритных и других антигенпрезентирующих клеток [47]. Введение таких структур в вакцинный белок усиливает иммунный ответ и исключает применение адъювантов. Исследователи из Vaxinnate Corporation [26] сконструировали рекомбинантный белок STF2.4хМ2е, включающий TLR5-лиганд флагеллин, соединенный с 4 копиями М2е и экспрессируемый в Е. соН. Полученная конструкция дала более высокий антительный ответ, чем препарат М2е с традиционным адъювантом А12О3. Вакцинация малой дозой белка STF2.4хМ2е 0,3 мкг приводила к полной защите мышей от смертельной инфекции. При этом антительный ответ напрямую зависел от физической связи белка флагеллина STF2 с М2е. Вакцинация этими белками, не связанными между собой («коктейлем»), сопровождалась слабой выработкой антител. Гуморальный ответ и протективность, индуцируемые STF2.4хМ2е, не зависели от точечных мутаций в М2е-белке в отличие от защиты моноклональными антителами 14С2. Аминокислотная замена в положении 10
снижала распознавание и связывание эпитопа моноклональными антителами 14С2, но не влияла на его взаимодействие с STF2.4хМ2е-иммунной сывороткой [26].
Отрабатываются также схемы иммунизации, пути введения и дозы вакцин. Так, эффект ДНК-М2-вакцины был значительно увеличен при второй иммунизации М2-белком, встроенным в Ad-вирусный вектор [49].
В настоящее время проведены первые клинические испытания кандидитных вакцин [20, 54]. Три компании - производителя вакцин - "Sanofi Pauster" ("Acambis"), "VGX International Inc." и "Vaxinnate Corporation Inc." провели I—II фазы клинических испытаний 3 типов универсальных вакцин [54]. Вакцина АСАМ-FLU включает рекомбинантный белок М2еНВс, продуцируемый Е. соН, и один из двух адъювантов: гидроксид алюминия или новый адъювант на основе сапонина QS-21. Сероконверсии были максимальны (90%) в группе лиц, получавших АСАМ-FLU + QS-21. В параллельных доклинических испытаниях показано, что вакцина с консенсусным М2е вируса гриппа А человека защищает мышей на 70% от летальной дозы вируса высокопатогенного гриппа А(Н5Ш). Компания "Vaxinnate Corporation Inc." успешно провела клинические испытания вакцины VAХ-102, содержащей рекомбинантный белок STF2 + М2е [54]. Компания "VGX International Inc." готовится к клиническим испытаниям ДНК-вакцины VGX-3400, содержащей гены вируса А(Н5Ш). Будет оцениваться Т-клеточный и антительный ответ на НА, NA и М2е-ЫР-белок.
В России разработки универсальной вакцины на основе М2е-белка начались на несколько лет позже, чем в Европе и США, - в 2006-2007 гг. В настоящее время исследования проводятся в Центре «Биоинженерия» РАН, на кафедре вирусологии МГУ им. М. В. Ломоносова, в НИИ гриппа. В Центре «Биоинженерия» создано несколько оригинальных по конструкции и методам сборки препаратов [1, 2, 4]. Их скрининг по иммуногенности и про-тективности на лабораторных животных, проведенный в НИИ гриппа, выявил наиболее перспективные препараты. Отечественными исследователями оптимизируются как бактериальные, так и растительные системы экспрессии вакцинных рекомбинантных белков [3, 6].
Механизм действия и перспективность применения
Факторы иммунной реакции организма, индуцируемые традиционными вакцинами и вакцинами на основе М2е, схематично изображены на рис. 2. Защитный механизм субъединичных инактивированных вакцин реализуется в основном в стадиях адсорбции и почкования вируса и опосредуется соответственно антигемагглютининами и антинейраминидазными антителами. Механизм действия живых вакцин более комплексный и по существу воспроизводит постинфекционный иммунный ответ. Цель-новирионная инактивированная вакцина инициирует как антительный ответ на НА и NA, так и цитотоксичность, но эффективность упомянутых вакцин проявляется в отношении гомологичных вирусов.
Основной иммунный механизм, инициируемый вакцинами с М2е-белком, - это антителозависимая цитотоксич-
Рис. 2. Основные факторы защиты, индуцируемые вакцинами в разные фазы гриппозной инфекции.
жгв
жгв, игв
жгв, игв
(цельновирионные)
ЖГВ, ИГВ М2е-вакцина
&
IgA, IgG IgG CTL IgG IgG, NK
Репродукция в носоглотке Адсорбция вируса Внутриклеточная локализация Почкование вируса (
В и р е м и Я
Санация
12
ность [20, 28], эффекторами которой являются нормальные киллерные клетки (NK). Специфические антитела, связываясь с вирусным белком М2е, на поверхности инфицированных клеток являются аттрактантами для Fс-гамма-рецепторов NK Эти своеобразные «мосты» из антител привлекают NK к инфицированной клетке и способствуют ее уничтожению. Антитела к белку М2е в значительной степени также блокируют освобождение инфекционных вирусных частиц от мембран инфицированных клеток. Установлено, что М2е-пептид содержит и Т-клеточные эпитопы, которые индуцируют выработку М2е-специфических Т-клеток, участвующих в защите от гриппозной инфекции [52]. Разные группы исследователей показали, что препараты, не предотвращая заболевания, характеризуются выраженной протективностью, проявляющейся снижением вирусной репликации в легких, уменьшением тяжести заболевания и предотвращением гибели животных [14, 18, 19, 39, 40].
Вакцины на основе рекомбинантных белков, включающих консервативные эпитопы разных белков вируса гриппа, проигрывая в профилактической эффективности существующим традиционным вакцинам, будут чрезвычайно востребованы при появлении вируса с кардинально измененными НА и NA, т. е. при угрозе развития пандемии для иммунизации широких кругов населения или при эпизоотиях (для защиты профессиональных групп). Универсальные вакцины также важны для праймирова-ния неиммунных контингентов (дети) и вакцинации лиц, имеющих противопоказания к традиционным вакцинам.
ЛИТЕРАТУРА
1. Киселев О. И. Прогресс в создании пандемических противогриппозных вакцин и технологии их производства // Биотехнология. - 2010.
- № 2. - С. 1-17.
2. Котляров Р. Ю., Куприянов В. В., Мигунов А. И. и др. Разработка рекомбинантной вакцины против «свиного» гриппа на основе вирусоподобных наночастиц - носителей внеклеточного домена М2 белка // Acta Naturae. - 2010. - Vol. 2, № 2 (5). - Р 75-80.
3. МардановаЕ. С., Котляров Р. Ю., Равин Р. В. Повышение эффективности продукции рекомбинантных белков в растениях за счет оптимизации трансляции РНК вируса-вектора // Молекул. биол. - 2009.
- Т 43, № 3. - С. 568-571.
4. Мещерякова Ю. А., Эльдаров М. А., Мигунов А. И. и др. Химерные частицы вируса мозаики коровьего гороха, несущие внеклеточный домен М2-белка вируса гриппа типа А: получение и характеристика // Молекул. биол. - 2009. - Т. 43, № 4. - С. 741-750.
5. Пандемии гриппа: прошлое, настоящее, будущее // Грипп и другие респираторные вирусные инфекции: эпидемиология, профилактика, диагностика и терапия / Под ред. О. И. Киселева и др. - СПб., 2003.
6. Равин Н. В., Марданова Е. С., Котляров Р. Ю. и др. Определение полной нуклеотидной последовательности генома нового штамма X вируса картофеля и создание на его основе вирусного вектора для продукции целевых белков в растениях // Биохимия. - 2008. - Т. 73.
- С. 54-61.
7. Цыбалова Л. М., Карпова Л. С., Комиссаров А. Б. и др. Эпидемия гриппа А (H1N1)v в России // Вестн. РАМН. - 2011. - № 7.
8. Adar Y., Singer Y., Levi R. et al. A universal epitope-based influenza vaccine and its efficacy against H5N1 // Vaccine. - 2009. - Vol. 27, N 15. - P 2099-2107.
9. Ben-Yedidia T., Arnon R. Towards an epitope-based human vaccine for influenza // Hum. Vaccine. - 2005. - Vol. 1. - P. 95-101.
10. Bianchi E., Liang X., Ingallinella P. et al. Universal influenza B vaccine based on the maturational cleavage site of the hemagglutinin precursor // J. Virol. - 2005. - Vol. 79. - P 7380-7388.
11. BlackR. A., Rota P. A., Gorodkova N. et al. Antibody response to the M2 protein of influenza A virus expressed in insect cell // J. Gen. Virol. -1993. - Vol. 74. - P 143-146.
12. Chen Ze, Shin-estuKadowaki, Yoshikawa T. et al. Cross-protection against a lethal influenza virus infection by DNA vaccine to the neuraminidase // Vaccine. - 2000. - Vol. 18. - P. 3214-3222.
13. Cross K. J., Langley W. A., Russell R. J. et al. Composition and function of the influenza fusion peptide // Protein Pept. Lett. - 2009. - Vol. 16. - P. 766-778.
14. DeFiletteM., Min Jou W., BirkettA. et al. Universal influenza A vaccine: optimization of M2-based constructs // Virology. - 2005. - Vol. 337, N
I. - P 149-161.
15. De Filjette M., Ramne A., Birkett A. et al. The universal influenza vaccine M2e-HBc administered intranasally in combination with the adjuvant CTA1-DD provides complete protection // Vaccine. - 2006. - Vol. 24. -P. 544-551.
16. De FiletteM., Maztens W., Smet A. et al. Universal influenza A M2e-HBc vaccine protects against discase even in the presence of pre-existing anti-HBc anti-bodies // Vaccine. - 2008. - Vol. 26. - P 6503-6507.
17. Evans J. T., Cluff C. W., Johnson D. A. et al. Enhancement of antigen-specific immunity via the TLR4 ligands MPL adjuvant and Ribi.529 // Expert Rev. Vaccines. - 2003. - Vol. 2. - P. 219-229.
18. Fan J. et al. Preclinical study of influenza virus A M2 peptide conjugate vaccines in mice, ferrets, and rhesus monkeys // Vaccine. - 2004. - Vol. 22. - P. 2993-3003.
19. Fiers W., De Fillette M., Birkett A. et al. A «universal» human influenza A vaccine // Virus Res. - 2004. - Vol. 103. - P 173-176.
20. Fiers W., De Filette M., Bakkouria K. et al. M2e-based universal influenza A vaccine // Vaccine. - 2009. - Vol. 27. - P 6280-6283.
21. Frace A. M., Klimov F. I., Rowe T. et al. Modified M2 proteins produce heterotypic immunity against influenza A virus // Vaccine. - 1999. - Vol. 17. - P. 2237-2244.
22. Gerhard W., Mozdzanowska K., Zharikova D. Prospects for universal influenza virus vaccine // Emerg. Infect. Dis. - 2006. - Vol. 12, N 4. - P 569-574.
23. GocnikM., Fislova T., Sladkova T. et al. Antibodies specific to the HA2 glycopolypeptide of influenza A virus with fusion-inhibition activity contribute to the protection of mice against lethal infection // J. Gen. Virol. - 2007. - Vol. 88. - P 951-955.
24. Graves P. N., Schulman J. L., Young J. F, Palese P. Preparation of influenza virus subviral particles lacking the HA1 subunit of hemagglutinin: unmasking of cross-reactive HA2 determinants // Virology. - 1983. - Vol. 126. - P 106-116.
25. Hocart M., Grajower B., Donabedian A. et al. Preperation and characterization of a purified influenza virus neuraminidase vaccine // Vaccine. - 1995. - Vol. 13. - P 1793-1798.
26. Huleatt J. W., Nakaar V, Desai P. et al. Potent immunogenicity and efficacy of a universal influenza vaccine candidate comprising a recombinant fusion protein linking influenza M2 to TLR5 ligand flagellin // Vaccine. - 2008. - Vol. 26. - P 201-214.
27. Ito T., Gorman O. T., Kawaoka Y. et al. Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the Ml and M2 proteins // J. Viral. - 1991. - Vol. 65. - P 5491-5498.
28. Jegerlehner A., SchmitzN., Storni T., BachmannM. F. Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2: weak protection mediated via antibody-dependent NK cell activity // J. Immunol. - 2004. - Vol. 172. -P. 5598-5605.
29. Johansson B. E., Moran T. M., Kilbourne E. D. Antigen-presenting B cells and helper T cells cooperatively mediate intravirionic antigenic competition between influenza A virus surface glycoproteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1987. - Vol. 84. - P. 6869-6873.
30. Johansson B. E. Kilbourne E. D. Comparative long-term effects in a mouse model system of influenza whole virus and purified neuraminidase vaccines followed by sequential infections // J. Infect. - 1990. - Vol. 162. - P 800-809.
31. Johansson B. E., Matthews J. T., Kilbourne E. D. Supplementation of conventional influenza A vaccine with purified viral neuraminidase results in a balanced and broadened immune response // Vaccine. - 1998.
- Vol. 16. - P 1009-1015.
32. Kilbourne E. D., Couch R. B., Kasel J. A. et al. Purified influenza A virus N2 neuramminidase vaccine is immunogenetic and non-toxic in humans // Vaccine. - 1995. - Vol. 13. - P 1799-1803.
33. Lai A. I., Park H., White J. M., Tamm L. K. Fusion peptide of influenza haemagglutinin requires a fixed angle, boomerang structure for activity //
J. Biol. Chem. - 2006. - Vol. 281. - P 5760-5770.
34. Lamb R. A., Lai C. J., Choppin P. W. Sequences of mRNAs derived from genome RNA segment 7 of influenza virus: colinear and interrupted mRNAs code for overlapping proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1981. - Vol. 78. - P 4170-4174.
35. Lee Y. H., Do Lien Anh Ha, Simmons C. et al. Memory T cell established by seasonal human influenza A infection cross-react with avian influenza A (H5N1) in healthy individuals // J. Clin. Invest. - 2008. - Vol. 118. - P. 3478-3490.
36. LiX.,FangF, YanH. et al. Essential sequence ofinfluenza neuraminindase DNA to provide protection against lethal viral infection // DNA Cell Biol.
- 2006. - Vol. 25. - P 197-205.
37. Liu W., Peng Z. Liu Z. et al. High epitope density in a single recombinant protein molecule of the extracellular domain of influenza A virus M2 protein significantly enhances protective immunity // Vaccine. - 2004. -Vol. 23. - P. 366-371.
38. Milich D. R., McLachlan A. The nucleocapsid of hepatitis S virus is both a T-cell-independent antigen // Science. - 1986. - Vol. 234. - P. 13981401.
13
39. Mozdzanowska K. et al. Induction of influenza type A virus-specific resistance by immunization of mice with a synthetic multiple antigenic peptide vaccine that contains ectodomains of matrix protein 2 // Vaccine. - 2003. - Vol. 21. - P. 2616-2626.
40. NeirynckS. et al. A universal influenza a vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein // Nat. Med. - 1999. - Vol. 5. - P. 157-163.
41. Okuda Kenji, Atsushi Ihata, Setsuko Watebe et al. Protective immunity against influenza A virus induced by immunization with DNA plasmid containing influenza M gene // Vaccine. - 2001. - Vol. 19. - P 36813691.
42. Okuno Y., Isegawa Y, Sasano F, Ueda S. A common neutralizing epitope conserved between the hemagglutinin of influenza A virus HI and H2 strains // J. Virol. - 1993. - Vol. 67. - P 2552-2558.
43. Pan C., Jiang S. E14-F55 combination in protein: a putative molecular determinant responsible for swine-origin influenza A virus transmission in humans // PLoS Curr. - 2009. - Vol. 1. - RRN 1044.
44. PersingD. H., Coler R. N., Lacy M. J. et al. Taking toll:lipid A mimetics as adjuvants and immunomodulators // Trends Microbiol. - 2002. - Vol. 10. - P. 32-37.
45. Prabhu N., PrabakaranM., HoH. T. et al. Momoclonal antibodies against the fusion peptide of hemagglutinin protect mice from lethal influenza A virus H5N1 infection // J. Virol. - 2009. - Vol. 83. - P 2553-2562.
46. Sagava H., Oshima A., Kato J. et al. The immunological activity of adeletion mutant of influenza virus hemagglutinin lacking the globular region // J. Gen. Virol. - 1996. - Vol. 77. - P 1483-1487.
47. Takeda K., Kaisho T., Akira S. Toll-like receptors // Annu. Rev. Immunol. - 2003. - Vol. 21. - P. 1440-1447.
48. Tamura S., Tammoto T., Kurata T. Mechanisms of broad cross-protection provided by influenza virus infection and their application to vaccines // Jpn. J. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 58. - P. 195-207.
49. Tompkins S. M., Zhao Z. S., Lo C.-Y. et al. Matrix protein 2 vaccination and protection against influenza viruses, including sybtype H5N1 // Emerg. Infect. Dis. - 2007. - Vol. 13. - P. 426-434.
50. Tong-Ming Fu, Grimm Karen M., Citron Michael P., Freed Daniel C. Comparative immunogenicity evaluations of influenza A virus M2 peptide as recombinant virus like particle or conjugate vaccines in mice and monkeys // Vaccine. - 2009. - Vol. 27. - P. 1440-1447.
51. Wanli L., Peng Z., Jian D., Ying-Hua C. Sequence comparison between the extracellular domain of M2 protein human and avian influenza A virus provides new information for bivalent influenza vaccine design // Microb. Infect. - 2005. - Vol. 7. - P. 171-177.
52. Wu F, Huang J., Yuan X. et al. Characterization of immunity induced by M2e of influenza virus // Vaccine. - 2007. - Vol. 25. - P. 8868-8873.
53. Zharikova D., Mozdzanowska K., Feng G. et al. Influenza type A virus escape mutants emerge in vivo in the presence of antibody to the ectodomain of matrix protein 2 // J. Virol. - 2005. - Vol. 79. - P. 66446654.
54. http://www.clinicaltrial.gov.
Поступила 28.12.10
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.98:578.832.1]-06:616.24-02]-078
Д. К. Львов1, М. Ю. Щелканов1, Н. В. Бовин2, Н. А. Малышев3, А. Г. Чучалин4, Л. В. Колобухина1, А. Г. Прили-пов1, В. С. Богданова1, С. В. Альховский1, Е. И. Самохвалов1, И. Т. Федякина1, Е. И. Бурцева1, П. Г. Дерябин1,
М. М. Журавлева1, Е. С. Шевченко1, В. В. Лаврищева1, Д. Н. Львов1, Е. С. Прошина1, Н. С. Стариков2, Т. Н. Морозова1, М. В. Базарова3, Т. А. Григорьева1, И. М. Кириллов1, Е. В. Шидловская1, Е. И. Келли3, В. Е. Маликов3, К. Б. Яшкулов5, В. Ю. Ананьев6, Н. И. Баранов6, В. Н. Гореликов6, О. В. Цой6, Ю. А. Гарбуз7, В. И. Резник7, Л. И. Иванов8, И. Ю. Феделеш9, Р. А. Пономаренко10, Е. А. Сахарова9, Г. Б. Лебедев9, А. И. Маслов10
корреляция между рецепторной специфичностью штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09, изолированных в 2009-2011 гг., структурой рецепторсвязывающего сайта и вероятностью развития летальной первичной вирусной пневмонии
'ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России, Москва; 2Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва; 3Инфекционная клиническая больница № 1 Департамента здравоохранения, Москва; 4ФГУ НИИ пульмонологии ФМБА России, Москва; ^Управление Роспотребнадзора по Республике Калмыкия, Элиста;
6ФБУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Приморском крае, Владивосток; 7ФБУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Хабаровском крае, Хабаровск; 8ФБУЗ Хабаровская противочумная станция; 9ФБУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Чукотском автономном округе,
Анадырь; 10ГУЗ Чукотская окружная больница, Анадырь
Изучена рецепторная специфичность (РС) штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09, депонированных в государственную коллекцию вирусов Рф при фгу нии вирусологии им. Д. и. Ивановского Минздравсоцразвития России в эпидсезонах 2009-2010 и 2010-2011 гг., по отношению к панели из 9 сиа-логликополимеров (СГП). Штаммы были разделены на 3 группы в зависимости от значения предложенного нами параметра W3/6, равного отношению суммы реактивностей к неразветвленным а2-3-СГП к сумме реактивностей к неразветвленным а2-6-СГП: W3/6 < 1,0; 1,0 < W3/6 < 1,5; W3/6 > 1,5. В группе W3/6 > 1,5 преобладает а2-3-РС, сопровождаясь высокой частотой летальных первичных вирусных пневмоний (ЛПВП) (60,0%) и аминокислотных замен в рецепторсвязывающем сайте (РСС) НА1 (80,0%): D222{G, N} и Q3223R. Группа 1,0 < W3/6 < 1,5 характеризуется смешанной а2-3/а2-6-РС с частотами ЛПВП и аминокислотных замен в РСС НА1 29,7 и 40,5% (D222{G, N, V} и Q223R) соответственно. В группе W3/6 < 1,0 преобладает а2-6-РС, отсутствуют ЛПВП и лишь в 6,0% случаев встречались аминокислотные замены в РСС НА1 (D222{G, Е}). Число штаммов с повышенной специфичностью к а2-3-сиалозидам возросло в эпидсезоне 2010-2011 гг. по сравнению с предыдущим. При дальнейшем их распространении среди населения может увеличиться число случаев тяжелых первичных вирусных пневмоний с возможными летальными исходами, что, однако, может сопровождаться снижением способности мутантов к воздушно-капельной передаче.
Ключевые слова: вирус, грипп, пневмония, летальность, клеточный рецептор, рецепторсвязывающий сайт, гемагглютинин, сиаловая кислота, сиалозид, олигосахарид
Контактная информация:
Львов Дмитрий Константинович, акад. РАМН, дир. ин-та; e-mail: dk_lvov@mail.ru
14
