Научная статья на тему 'ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА СТАБИЛЬНЫХ АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИХ Т-РЕГУЛЯТОРНЫХ КЛЕТОК С ПОМОЩЬЮ БЛОКАТОРОВ ЦИКЛИН-ЗАВИСИМЫХ КИНАЗ ВАКЦИНЫ И ВАКЦИНАЦИЯ'

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА СТАБИЛЬНЫХ АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИХ Т-РЕГУЛЯТОРНЫХ КЛЕТОК С ПОМОЩЬЮ БЛОКАТОРОВ ЦИКЛИН-ЗАВИСИМЫХ КИНАЗ ВАКЦИНЫ И ВАКЦИНАЦИЯ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

  • … еще 2
CC BY
78
17
Читать
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Иммунология
Scopus
ВАК
CAS
RSCI
Ключевые слова
CD4+-Т-КЛЕТКИ / Т-РЕГУЛЯТОРНЫЕ КЛЕТКИ / АНТИГЕНЫ / FOXP3 / CDK8/19 / AS2863619

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Булыгин Алексей Сергеевич, Хантакова Юлия Николаевна, Фишер Марина Сергеевна, Терещенко Валерий Павлович, Курилин Василий Васильевич

Введение. В иммунной системе регуляторные CD4+CD25highFoxP3+-T-клетки (Трег) являются важными участниками индукции толерантности. Трег подавляют воспалительные реакции различной этиологии, включая аутоиммунные и трансплантационные. Используя заложенный регуляторный потенциал Трег, индуцированных in vitro, можно добиться подавления воспалительных реакций на конкретный антиген, не затрагивая иммунный ответ в целом. Цель исследования получение антиген-специфичных FoxP3+-Трег, обладающих иммуносупрессивными свойствами, в смешанной культуре лимфоцитов. Материал и методы. В исследовании использовали самцов мышей линий C57BL/6 и Balb/c. Полученные дендритные клетки от мышей линии C57BL/6 и CD4+-спленоциты от мышей линии Balb/c сокультивировали для получения антиген-специфических CD4+-Т-клеток. Далее CD4+-Т-клетки культивировали с добавлением AS2863619, ТФРр и ИЛ-2 для трансдифференцировки антиген-специфических эффекторных Т-лимфоцитов в ан-тиген-специфические CD4+CD25highFoxP3+-Трег. Фенотип полученных Трег оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии. Оценку толерогенного потенциала Трег проводили с помощью смешанной культуры лимфоцитов. Результаты. Показано, что совместное использование анти-CD3 и AS2863619 приводит к 10-кратному увеличению относительного количества CD25highFoxP3+-Трег в культуре CD4+-Т-лимфоцитов по сравнению с нестимулированными лимфоцитами. Анализ с помощью проточной цитометрии показал, что в культуре антиген-специфичных Трег (Аг-Трег) преобладает популяция эффекторных Т-клеток памяти. При этом в культуре не Аг-Трег резидентные Т-клетки памяти составляли лишь около половины субпопуляции. В смешанной культуре лимфоцитов было выявлено, что в присутствии не Аг-Трег в 2,5 раза увеличивается пролиферация CD4+-Т-лимфоцитов Balb/c в ответ на добавление антигена C57Bl/6. Однако в присутствии Аг-Трег даже при добавлении антигенов C57Bl/6 уровень пролиферации CD4+-Т-лимфоцитов Balb/c не отличается от контрольной группы. Заключение. Применение AS2863619 при культивировании антиген-специфичных CD4+-лимфоцитов усиливает генерацию Аг-Трег. При этом получаемые Аг-Трег обладают фенотипическими свойствами эффекторных регуляторных Т-клеток памяти и функционально подавляют пролиферацию CD4+-лимфоцитов на антигены, что делает целесообразным изучение их способности к индукции иммунологической толерантности и подавлению иммунного ответа.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Булыгин Алексей Сергеевич, Хантакова Юлия Николаевна, Фишер Марина Сергеевна, Терещенко Валерий Павлович, Курилин Василий Васильевич

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
Предварительный просмотр
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

GENERATION AND CHARACTERIZATION OF STABLE ANTIGEN-SPECIFIC T-REGULATORY CELLS USING BLOCKERS OF CYCLIN-DEPENDENT PROTEIN KINASES

Introduction. In the immune system, regulatory CD4+CD25highFoxP3+T cells (Treg) are important players in tolerance induction. Treg suppress inflammatory reactions of various etiologies, including autoimmune and transplant reactions. Using the inherent regulatory potential of Treg induced in vitro, it is possible to achieve suppression of inflammatory responses to a specific antigen without affecting the immune response as a whole. Aim of the study obtaining antigen-specific FoxP3+Treg with characteristic immunosuppressive properties in mixed lymphocyte culture. Material and methods. Object of this study were male mice of C57BL/6 and Balb/c lines. The resulting dendritic cells from C57BL/6 mice and CD4+ splenocytes from Balb/c mice were co-cultured to obtain antigen-specific CD4+ T cells. After that, CD4+ T cells were cultured with AS2863619, TGFp and IL-2 to transdifferentiate antigen-specific effector T lymphocytes to antigen-specific CD4+CD25lughFoxP3+Treg. The phenotype of the resulting Treg was assessed using flow cytometry. The tolerogenic potential of Treg was assessed using a mixed lymphocyte culture. Results. It was shown that the combination of anti-CD3 and AS2863619 leads to a 10-fold increase in the relative number of CD25highFoxP3+Tregs in a culture of CD4+ T lymphocytes compared to unstimulated lymphocytes. Flow cytometrm: analysis showed that the population of effector memory T cells predominate in the antigen-specific Treg culture. At the same time, in the culture of non-antigen-specific Treg, only about half of the subpopulations consisted of resident memory T cells. In a mixed culture of lymphocytes, it was found that in the presence of non-Ag-Treg the proliferation of Balb/c CD4+ T lymphocytes increased by 2.5 times in response to the addition of the C57Bl/6 antigen. However, in the presence of Ag-Treg, even with the addition of C57Bl/6 antigens, the level of proliferation of Balb/c CD4+ T lymphocytes does not differ from the control group. Conclusion. The use of AS2863619 in the cultivation of antigen-specific CD4+ lymphocytes enhances the generation of Ag-Treg. At the same time, the resulting Ag-Tregs have the phenotypic properties of effector memory Treg and functionally suppress the proliferation of CD4+ lymphocytes against antigens, which makes it reasonable to study their ability to induce immunological tolerance and suppress the immune response.

Текст научной работы на тему «ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА СТАБИЛЬНЫХ АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИХ Т-РЕГУЛЯТОРНЫХ КЛЕТОК С ПОМОЩЬЮ БЛОКАТОРОВ ЦИКЛИН-ЗАВИСИМЫХ КИНАЗ ВАКЦИНЫ И ВАКЦИНАЦИЯ»

© Коллектив авторов, 2023

Булыгин А.С., Хантакова Ю.Н., Фишер М.С., Терещенко В.П., Курилин В.В., Шкаруба Н.С., Сенников С.В.

Получение и характеристика стабильных антиген-специфических Т-регуляторных клеток с помощью блокаторов циклин-зависимых киназ

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 630099, г. Новосибирск, Российская Федерация

Резюме

Введение. В иммунной системе регуляторные СВ4+СБ25Ы811РохР3+-Т-клетки (Трег) являются важными участниками индукции толерантности. Трег подавляют воспалительные реакции различной этиологии, включая аутоиммунные и трансплантационные. Используя заложенный регуляторный потенциал Трег, индуцированных in vitro, можно добиться подавления воспалительных реакций на конкретный антиген, не затрагивая иммунный ответ в целом.

Цель исследования - получение антиген-специфичных БохР3+-Трег, обладающих иммуносупрессивными свойствами, в смешанной культуре лимфоцитов.

Материал и методы. В исследовании использовали самцов мышей линий C57BL/6 и Balb/c. Полученные дендритные клетки от мышей линии C57BL/6 и СБ4+-спленоциты от мышей линии Balb/c сокультивировали для получения антиген-специфических CD4+-Т-клеток. Далее ОТ4+-Т-клетки культивировали с добавлением AS2863619, ТФРß и ИЛ-2 для трансдифференцировки антиген-специфических эффекторных Т-лимфоцитов в антиген-специфические ОТ4+ОТ25Ы811РохР3+-Трег. Фенотип полученных Трег оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии. Оценку толерогенного потенциала Трег проводили с помощью смешанной культуры лимфоцитов.

Результаты. Показано, что совместное использование анти-CD3 и AS2863619 приводит к 10-кратному увеличению относительного количества CD25hi8hFoxP3+-Трег в культуре CD4+-Т-лимфоцитов по сравнению с нестимулированными лимфоцитами. Анализ с помощью проточной цитометрии показал, что в культуре антиген-специфичных Трег (Аг-Трег) преобладает популяция эффекторных Т-клеток памяти. При этом в культуре не Аг-Трег резидентные Т-клетки памяти составляли лишь около половины субпопуляции. В смешанной культуре лимфоцитов было выявлено, что в присутствии не Аг-Трег в 2,5 раза увеличивается пролиферация CD4+^-лимфоцитов Balb/c в ответ на добавление антигена C57B1/6. Однако в присутствии Аг-Трег даже при добавлении антигенов C57B1/6 уровень пролиферации CD4+-Т-лимфоцитов Balb/c не отличается от контрольной группы.

Заключение. Применение AS2863619 при культивировании антиген-специфичных CD4+-лимфоцитов усиливает генерацию Аг-Трег. При этом получаемые Аг-Трег обладают фенотипическими свойствами эффекторных регуляторных Т-клеток памяти и функционально подавляют пролиферацию CD4+-лимфоцитов на антигены, что делает целесообразным изучение их способности к индукции иммунологической толерантности и подавлению иммунного ответа.

Ключевые слова: CD4+-Т-клетки; Т-регуляторные клетки; антигены; FoxP3; CDK8/19; AS2863619

Статья получена 16.02.2023. Принята в печать 17.03.2023.

Для цитирования: Булыгин А.С., Хантакова Ю.Н., Фишер М.С., Терещенко В.П., Курилин В.В., Шкаруба Н.С., Сенников С.В. Получение стабильных антиген-специфических Т-регуляторных клеток с помощью блокаторов ци-клин-зависимых киназ. Иммунология. 2023; 44 (2): 147-156. DOI: https://doi.oig/10.33029/0206-4952-2023-44-2-147-156

Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 21-7510089). URL: https://rscf.ru/project/21-75-10089

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Булыгин А.С., Хантакова Ю.Н., Сенников С.В., Терещенко В.П.; сбор и обработка материала - Фишер М.С., Курилин В.В., Булыгин А.С.; статистическая обработка - Булыгин А.С., Шкаруба Н.С.; написание текста - Булыгин А.С., Хантакова Ю.Н.; редактирование -Сенников С. В., Хантакова Ю. Н.

Для корреспонденции

Сенников Сергей Витальевич -доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: sennikovsv@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-7366-7768

Bulygin A.S., Khantakova J.N., Fisher M.S., Tereshchenko V.P., Kurilin V.V., Shkaruba N.S., Sennikov S.V.

Generation and characterization of stable antigen-specific T-regulatory cells using blockers of cyclin-dependent protein kinases

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology, Ministry of Science and High Education of Russian Federation, 630099, Novosibirsk, Russian Federation

Abstract

Introduction. In the immune system, regulatory CD4+CD25highFoxP3+T cells (Treg) are important players in tolerance induction. Treg suppress inflammatory reactions of various etiologies, including autoimmune and transplant reactions. Using the inherent regulatory potential of Treg induced in vitro, it is possible to achieve suppression of inflammatory responses to a specific antigen without affecting the immune response as a whole.

Aim of the study - obtaining antigen-specific FoxP3+Treg with characteristic immunosuppressive properties in mixed lymphocyte culture.

Material and methods. Object of this study were male mice of C57BL/6 and Balb/c lines. The resulting dendritic cells from C57BL/6 mice and CD4+ splenocytes from Balb/c mice were co-cultured to obtain antigen-specific CD4+ T cells. After that, CD4+ T cells were cultured with AS2863619, TGFp and IL-2 to transdifferentiate antigen-specific effector T lymphocytes to antigen-specific CD4+CD25MghFoxP3+Treg. The phenotype of the resulting Treg was assessed using flow cytometry. The tolerogenic potential of Treg was assessed using a mixed lymphocyte culture.

Results. It was shown that the combination of anti-CD3 and AS2863619 leads to a 10-fold increase in the relative number of CD25highFoxP3+Tregs in a culture of CD4+ T lymphocytes compared to unstimulated lymphocytes. Flow cytometrmc analysis showed that the population of effector memory T cells predominate in the antigen-specific Treg culture. At the same time, in the culture of non-antigen-specific Treg, only about half of the subpopulations consisted of resident memory T cells. In a mixed culture of lymphocytes, it was found that in the presence of non-Ag-Treg the proliferation of Balb/c CD4+ T lymphocytes increased by 2.5 times in response to the addition of the C57Bl/6 antigen. However, in the presence of Ag-Treg, even with the addition of C57Bl/6 antigens, the level of proliferation of Balb/c CD4+ T lymphocytes does not differ from the control group.

Conclusion. The use of AS2863619 in the cultivation of antigen-specific CD4+ lymphocytes enhances the generation of Ag-Treg. At the same time, the resulting Ag-Tregs have the phenotypic properties of effector memory Treg and functionally suppress the proliferation of CD4+ lymphocytes against antigens, which makes it reasonable to study their ability to induce immunological tolerance and suppress the immune response.

Keywords: CD4+T cells; regulatory T cells; antigens; FoxP3; CDK8/19; AS2863619

Received 16.02.2023. Accepted 17.03.2023.

For citation: Bulygin A.S., Khantakova J.N., Fisher M.S., Tereshchenko V.P., Kurilin V.V., Shkaruba N.S., Sennikov S.V. Generation of stable antigen-specific T-regulatory cells using blockers of cyclin-dependent protein kinases. Immunology. 2023; 44 (2): 147-56. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-2-147-156 (in Russian)

Funding. The research was supported by the grant of the Russian Science Foundation (project No. 21-75-10089), https://rscf.ru/project/21-75-10089

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.

Authors' contributions. The concept and design of the study - Bulygin A.S., Khantakova J.N., Sennikov S.V.; collection and processing of material - Fisher M.S., Kurilin V.V., Bulygin A.S.; statistical processing - Bulygin A.S., Shkaruba N.S.; writing the text - Bulygin A.S., Khantakova J.N.; editing - Sennikov S.V., Khantakova J.N.

For correspondence

Sergey V. Sennikov -MD, PhD, Professor, Head of Molecular Immunology Laboratory, RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: sennikovsv@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-7366-7768

Введение

Иммунная система представляет собой сложную сеть взаимодействий различных типов клеток и белковых молекул. Давно известно, что в организме постоянно появляются и циркулируют аутореактивные клоны лимфоцитов [1]. Но у здоровых людей их активность ограничивается пулом регуляторных Т-клеток (Трег). Трег быстро привлекаются к участкам воспаления, накапливаются и способны к длительному сохранению, формируя пул регуляторных Т-клеток памяти (Трег памяти) [2]. Например, воспаление кожного покрова в условиях аутоиммунного заболевания приводит к образованию и привлечению Трег. Их количество в очаге воспаления может составлять до 60-80 % от пула местных СБ4+-Т-лимфоцитов, что помогает разрешить воспалительный процесс [3].

Сегодня разрабатываются различные подходы для получения Трег, способных подавлять воспалительные реакции различной этиологии, включая аутоиммунные и трансплантационные реакции. Используя заложенный регуляторный потенциал Трег, индуцированных in vitro, теоретически возможно добиться подавления воспалительных реакций на конкретный антиген, не затрагивая иммунный ответ в целом. Это колоссальное преимущество Трег-клеточной терапии перед традиционной иммуносупрессией глюкокортикоидными гормонами.

Однако классический способ индукции РохР3+-Трег in vitro с помощью активации Т-клеточного рецептора (TCR) в присутствии ТФРр и ИЛ-2 вызывает индукцию экспрессии FoxP3 в основном из наивных лимфоцитов. В свою очередь, перепрограммирование ранее активированных эффекторных Т-клеток или Т-клеток памяти в супрессорные FoxP3+-Трег может быть целесообразно для более эффективного подавления иммунных реакций [4, 5]. Также FoxP3+-Tрег, индуцированные in vitro с помощью стимулирования TCR, ТФРр и ИЛ-2, не приобретают эпигенетических (деметилирование ДНК, модификации гистонов) и транскрипционных изменений, характерных для естественных FoxP3+-Трег организма [6], что приводит к нестабильной экспрессии FoxP3 и снижению супрессорной функции, особенно в провоспалительных условиях и при рестимуляции [7, 8].

Известно, что в моделях аутоиммунных заболеваний и трансплантации антиген-специфичные FoxP3+-Трег-клетки (Аг-Трег) обладают более выраженным супрессорным потенциалом, чем поликлональные FoxP3+-Tрег-клетки [9]. Но индукция Аг-Трег in vitro осложнена выбором целевого антигена, поскольку конкретный антиген, на который возникает патологическая аутоиммунная или нежелательная трансплантационная реакция, в большинстве случаев неизвестен.

Таким образом, нерешенной проблемой остается получение Аг-Трег, стабильно реализующих иммуно-супрессивную функцию в условиях подавления нежелательных трансплантационных и патологических аутоиммунных реакций.

Для решения данной задачи в работе оценивали влияние ингибиторов циклин-зависимых киназ 8/19 (CDK8/19) на формирование пула Трег in vitro. Фармакологические ингибиторы циклин-зависимых киназ 8/19 (CDK8/19), в отличие от ТФРß, способны к индукции экспрессии FoxP3 не только в наивных лимфоцитах, но и в активированных CD4-лимфоцитах [10]. Также было выявлено, что ингибиторы CDK8/19 (AS2863619, CCT251921, Сенексин А) при индукции экспрессии FoxP3+-Трег in vitro действуют синергично с ТФРß, не теряя своего эффекта в присутствии провос-палительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-12, ИФН-у), увеличивают экспрессию некоторых Трег-специфичных генов (Foxp3, Ctla4, TnfrsflS, Il2ra), но не приводят к Трег-специфичному деметилированию. Полученные с помощью ингибиторов CDK8/19 FoxP3+-Tрег проявили определенную способность к подавлению иммунных реакций in vitro и реакции гиперчувствительности замедленного типа, а также экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей in vivo [11].

Материал и методы

Лабораторные животные. В исследовании использовали самцов мышей C57BL/6 и BALB/c в возрасте 2-6 мес. Мышей содержали в виварии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России в условиях естественного освещения и неограниченного доступа к еде и воде. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ НИИФКИ (2022) в соответствии с директивой ЕС D-559 2010/63/ЕС для экспериментов на животных, проводимых в соответствии с Европейской конвенцией ETS № 123 по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или научных целей (Страсбург) (1986 г. с приложением от 2006 г.), Международному соглашению по гуманному обращению с животными (1986 г.), Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, 2010 г., 8-е изд.) [12].

Получение дендритных клеток. Дендритные клетки (ДК) получали из клеток красного костного мозга. Для этого выделенные по стандартной методике из бедренных костей 3 • 106 клеток костного мозга культивировали в 6-луночных планшетах (TPP, Швейцария) в 3 мл полной среды RPMI-1640 («Вектор», Россия) с добавлением 100 нг/мл ГМ-КСФ (Biolegend, США) и ИЛ-4 (Biolegend, США) в течение 5 сут. На 3-и сутки среду меняли и добавляли ростовые факторы. На 5-е сутки полученные дендритные клетки обрабатывали 25 мкг/мл цитостатическим препаратом митомицином-С. Обработанные ДК высаживались в 6-луночный планшет (TPP, Швейцария) по 1 • 106 клеток на лунку в 1 мл полной среды RPMI-1640. Для следующего этапа ДК обрабатывали митомицином С по стандартной методике. Схема эксперимента представлена на рис. 1.

Получение антиген-специфических Трег из эф-фекторных CD4+-Т-лимфоцитов. Аг-Трег получали

Генерация ДК C57BL/6

1 (4-5 дней) Сортировка Аг-004+-Т-клеток

Г

Получение Ar-CD4 -Т-клеток

ДК C57BL/6 CD4+-Balb/c

(4-5 дней)

Генерация Трег

2

Аг^4-Т-клетка Balb/c

(4-5 дней)

Проточная цитофлуориметрия

Оценка толерогенного потенциала Трег

CD4+-T-клетки Balb/c

Оценка фенотипа Трег

АГ-Трег Balb/c

ДК C57BL/6

Однонаправленная СКЛ, Аг-Трег мышей Balb/c против антигенов мышей C57BL/6

Рис. 1. Схема эксперимента

Шаг 1. Постановка сокультуры ДК мышей линии C57BL/6 и меченных CFSE СВ4+-спленоцитов мышей линии Balb/c. Шаг 2. Сортировка CFSE+CD4+-T-memoK с помощью BD FACSAria™ I, посев клеток с AS (AS2863619), ТФРв, ИЛ-2 для генерации Трег. Шаг 3. Оценка полученных Трег с помощью Attune NxT и однонаправленная смешанная культура лимфоцитов (СКЛ), Аг-Трег мышей Balb/c против антигенов мышей C57BI/6. ДК - дендритные клетки; СКЛ - смешанная культура лимфоцитов.

3

из СБ4+-фракции спленоцитов. Для этого на первом этапе спленоциты метили витальным красителем CFSE (Biolegend, США) (5 мМоль/мл) в течение 20 мин по стандартному протоколу. Магнитную сортировку CFSE+CD4+-лимфоцитов проводили согласно протоколу производителя (Mojosort, США). Чистота сортировки составляла 98-99 %. CFSE+CD4+-лимфоциты сокульти-вировали c обработанными митомицином ДК в соотношении 1 : 5 в течение 5 сут.

Смену половины среды проводили на 3-и сутки культивирования. Пролиферирующую и непролифе-рирующую фракции CFSE+CD4+-лимфоцитов выделяли с помощью проточного цитофлуориметра с функцией сортировки BD FACSAria™ I (BD Biosciences, США). Полученные фракции CD4+-лимфоцитов высаживали в 24-луночные планшеты (TPP, Швейцария) в концентрации 1 млн/мл в полной среде RPMI-1640 с добавлением 1 мМ/мл AS2863619 (Cayman, США), 300 тыс. U/мл ИЛ-2 (R&D system, США) и 2,5 мкг/мл ТФРß (Elabscience, США) для трансдифференцировки Аг-специфических эффекторных Т-лимфоцитов в Трег.

Культивирование проводилось в течение 5 сут с последующей оценкой субпопуляционного состава Трег.

В качестве контроля для получения Аг-неспецифичес-ких Трег использовали популяцию СБ4+-Т-лимфо-цитов, культивированных без присутствия ДК.

Проточная цитометрия. Для определения различных субпопуляций Трег использовали анти-СБ3-Бу711, анти-СБ4-Бу605, анти-СБ25-РеСу7, анти-СБ44-APC-Cy7, анти-СБ62Ь-РегСР, анти-СБ95-ЛРС, анти-СБ122-РБ, анти-СБ69-Бу421, анти-СБ103-ЛБ488, анти-РохРЗ-РБ-антитела (Biolegend, США). Окрашивание проводили согласно стандартному протоколу производителя. Анализ выполнялся на проточном цитометре Attune NxT (Life Technologies, США). Схема гейтирова-ния представлена на рис. 2.

Оценка толерогенного потенциала полученных антиген-специфических Трег. Способность полученных Аг-Трег подавлять пролиферацию эффекторных СБ4+-Т-лимфоцитов оценивали в смешанной культуре лимфоцитов. Для этого проводили сокультивирова-ние ДК мышей C57BL/6 с СБ4+-лимфоцитами мышей BALB/c в присутствии Аг-Трег и без них в соотношении 1 : 5 : 1 соответственно. Сокультивирование проводили в течение 5 сут, со сменой половины объема среды на 3-и сутки. Оценку уровня пролиферации СБ4+-

Из CD25+FoxP3+

106

V 105

О

а.

С

It 104

О

о

-

х

О -103

о

а.

с

о

о

-

х

I

с

О

Comp-BL3-A:: CD62L-Pe: CP-Cy5.5-A Comp-BL1-A:: CD103-Alexa Fluor 488-A

Comp-BL2-A:: CD12 2-PE-A

10

10

10

10

0

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

0

Рис. 3. Пример цитометрического анализа субпопуляций памяти полученных Трег

Тп - наивные Т-клетки (СВ44-СВ62Ь+); Тзст - стволовые Т-клетки памяти (СВ44-СВ62Ь+СВ122+); Тст - Т-клетки центральной памяти (СВ44+СВ62Ь+); Тет - Т-клетки эффекторной памяти (СВ44+СВ62Ь-СВ69-СВ103-); Тгт - резидентные Т-клетки памяти (СВ44+СВ62ВСВ69+ или СВ103+).

лимфоцитов проводили с помощью реактива WST (Ta-kara, Япония) согласно протоколу производителя. Результаты были получены в виде оптической плотности с помощью многофункционального ридера Varioskan LUX (Thermo Scientific™, США). Индекс пролиферации смешанной культуры лимфоцитов рассчитывали как отношение оптической плотности среды культур без добавления Аг-Трег (спонтанная пролиферация) к оптической плотности среды культур при добавлении Аг-Трег.

Статистическую обработку данных выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США). Полученные данные проверяли на нормальность тестами Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Значимость различий между выборками оценивали с помощью одно- или двухфакторного дисперсионного анализа с множественными сравнениями по Сидаку или Тьюки и непарным /-тестом (использованные статистические методы указаны в подписях к рисункам). Различия сравниваемых параметров считались статистически значимыми при p < 0,05. Значимые отличия проиллюстрированы на рисунках скобками или символами. Данные на гистограммах показывают среднюю и стандартное отклонение.

Результаты

Применение AS2863619 усиливает индукцию эффекторных Трег

Показано, что совместное использование анти-СБ3 и AS2863619 приводит к увеличению относительного количества СВ25Ы81РохР3+-Трег (46,95 ± 2,74 %) в культуре CD4+-T-лимфоцитов по сравнению с нестимулиро-ванными лимфоцитами (5,36 ± 0,72 %) (рис. 2).

Исследование субпопуляционного состава полученных культур лимфоцитов показало присутствие как наивных Трег, так и различных субпопуляций Трег памяти. Пример схемы гейтирования представлен на рис. 3.

Показано, что в культуре Аг-Трег, 95,35 ± 2,62 % составляют эффекторные Т-клетки памяти (Тет, СВ44+СВ62ЬСВ69СВ103) и резидентные Т-клетки памяти (Тгт, СВ44+СБ62ЬСВ69+ или СБ103+). Большинство из них (81,49 ± 3,35 %) составляют Тет (табл. 1). При этом в культуре не Аг-Трег только 49,20 ± 4,42 % клеток дифференцировалась в Тет/гт клетки с преобладанием резидентных Т-клеток памяти (см. табл. 1).

Также среди не Аг-Трег присутствовало 12,20 ± 1,61 % низкодифференцированных наивных Т-клеток (СБ44-СБ62Ь+) и 29,40 ± 2,97 % Т-клеток центральной памяти (Тст) (СБ44+СБ62Ь+). Меньше всего в культуре полученных не АГ-Трег наблюдается стволовых Т-клеток памяти (ТБст) (СБ44-СВ62Ь+СБ122+). В отличие от не Аг-Трег, в культуре Аг-Трег количество наивных Т-клеток, Трег центральной памяти и стволовых Трег памяти составляло 1,22 ± 0,62 % для каждой субпопуляции, что подтверждает формирование эффекторного фенотипа памяти на представленные антигены С57В1/6.

Аг-Трег не вызывают пролиферацию эффекторных клеток

Показано, что в присутствии не Аг-Трег в 2,5 раза увеличивается пролиферация СБ4+-Т-лимфоцитов Ва1Ь/с в ответ на добавление антигена С57В1/6 (рис. 4). Однако в присутствии Аг-Трег даже при добавлении антигенов С57В1/6 уровень пролиферации СБ4+-Т-лимфоцитов Ва1Ь/с не отличается от контрольной группы наивных СБ4+-Т-лимфоцитов (см. рис. 4).

Таким образом, полученные данные подтверждают, что именно Аг-Трег вносят существенный вклад в подавление иммунного ответа на чужеродные антигены. Полученные с помощью А82863619 Аг-Трег подавляют пролиферацию эффекторных лимфоцитов в ответ на представленный антиген преимущественно за счет формирования регуляторных Тет памяти.

Примечание. п = 3-4. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего; * - достоверность различий субпопуляций стТрег между группами не Аг-Трег и Аг-Трег (р < 0,001); @ - достоверность различий между субпопуляциями етТрег и стТрег в группе не Аг-Трег (р < 0,05); # - достоверность различий между субпопуляциями rmTreg и етТрег в группе не Аг-Трег (р < 0,05); « - достоверность различий субпопуляций етТрег между группами Аг-Трег и не Аг-Трег (р < 0,01). Статистическая обработка данных проведена с помощью двухфакторного дисперсионного анализа.

Taблицa 1. Содержание субпопуляций Трег-клеток памяти in vitro

Группы/ субпопуляции nT-клетки scmTpег cmTpег em/rm Tpcr emTpcr rmTpcr

Не Ar-Трег, % 12,2 i 1,61 2,19 i 1,G1 29,4* i 2,97 49,2 i 4,42 44,3@ i 2,43 33,1G# i 2,32

AT-Трег, % 1,22 i G,62 G G,6G i G,21 93,33 i 2,62 81,49" i 3,33 2,78 i 1,G4

Обсуждение

В исследовании был отработан протокол получения Аг-Трег с помощью AS2863619 in vitro. Проведена оценка фенотипических и функциональных свойств популяции Трег для решения вопроса о возможности применения AS2863619 в клеточных технологиях по модуляции иммунного ответа.

Согласно данным исследования, было выявлено, что культивирование СБ4+-спленоцитов в присутствии стимулятора AS2863619 приводило к увеличению популяции Трег с 5 до 50 % in vitro (см. рис. 3). Данные результаты исследования говорят о том, что AS2863619 способен усилить генерацию Трег при ИЛ-2-зависимом механизме in vitro, так как в недавнем исследовании M. Akamatsu и соавт. было продемонстрировано, что у клеток, индуцированных с помощью AS2863619, при ингибировании CDK8/19 наблюдается активация транскрипционного фактора STAT5, что ведет к экспрессии гена Foxp3 и, следовательно, генерации Трег in vitro [11].

Исследование субпопуляций Трег показало, что добавление AS2863619 к антиген-специфическим CD4+-спленоцитам, вызывает трансдифференциацию клеток в сторону эффекторных Трег памяти in vitro (см. табл. 1). Интересно, что AS2863619 имеет решающую роль в трансдифференцировке антиген-специфических эф-фекторных Т-клеток памяти в сторону Бохр3+-Трег.

Механически AS2863619 поддерживает активность STAT5 (за счет фосфорилирования тирозина в С-концевом домене), который связывается с консервативной некодирующей областью (CNS) локуса Foxp3. CNS2, получивший сильную стимуляцию от TCR, поддерживает экспрессию многочисленных генов в локусе Foxp3, критически важных для функций Tрег (IL2ra, Tnfrsf18, Foxol, Ccr4 и Icos) [11, 13]. Более того, в культурах Аг-Трег относительное количество эффекторных Трег памяти наблюдалось больше, чем остальных субпопуляций Трег in vitro (81,49 ± 3,35 %, см. табл. 1), а в культурах не Аг-Трег присутствовало больше резидентных Трег памяти (55,10 ± 2,52 %) in vitro (см. табл. 1).

Известно, что эффекторные Трег локализуются в не-лимфоидных органах и являются мощными ингибиторами противоспалительных реакций, что имеет важное значение в устранении локального воспаления и поддержания тканевого гомеостаза при трансплантации [14, 15].

В исследовании регуляции пролиферации лимфоцитов выявлено, что в сокультуре не Аг-Трег наблюдается высокая пролиферация СБ4+-лимфоцитов in vitro (см. рис. 4), а это может говорить о том, что аутоанти-гены влияют на пластичность и изменение стабильности экспрессии Рохр3+-Трег в независимости от количества ТФРр в культуре, вследствие чего происходит трансдифференцировка Трег в сторону эффекторных Т-клеток [16].

Влияние внешних факторов имеет ключевое значение в длительности экспрессии Foxp3 в Трег. Например, в случае воспаления Трег могут дифференцироваться в FoxP3lowRORyt+Тh17-клетки, которые поспособствуют развитию аутоиммунных заболеваний [17]. Как и ожидалось, в сокультуре Аг-Трег наблюдается снижение пролиферации CD4+-лимфоцитов in vitro (см. рис. 4). Эти результаты подразумевают, что полученные Аг-Трег обладают способностью подавлять пролиферацию наивных Т-клеток и их дифференцировку в эффекторные Т-клетки in vitro [2, 18]. Помимо Т-клеточной линии, Трег ингибируют и активность ДК. Например, Трег подавляют пролиферацию и продукцию цитокинов (в частности, ИЛ-2) у эффекторных Т-клеток при усло-

Пролиферация С04+-лимфоцитов

1,5 -

+СБ4 +СБ4

Рис. 4. Оценка подавления пролиферации СБ4+-лимфоцитов с помощью Аг-Трег

п = 3-4. Только СБ4 - культура СБ4+-лимфоцитов без добавления ДК или Трег; ДК+СБ4 - культура СБ4+-лимфоцитов с добавлением ДК; ДК + Аг-Трег + СБ4 - культура СБ4+-лимфоцитов с добавлением ДК и антиген-специфических Трег; ДК + не Аг-Трег + СБ4 - культура СБ4+-лимфоцитов с добавлением ДК и не Аг-Трег. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Скобками указаны статистически значимые отличия (однофакторный дисперсионный анализр < 0,05).

вии, что 2 популяции культивируются совместно и стимулируются антигеном в присутствии антиген-презен-тирующих клеток в условиях in vitro [19, 20].

Вышеизложенные результаты показывают, что фармакологическое вещество AS2863619 способно модулировать генерацию АГ-Трег памяти из активированных СБ4+-Т-клеток. АГ-Трег памяти, в свою очередь, могут внести весомый вклад в регуляцию различных иммунных реакций in vitro.

Заключение

Таким образом, можно сказать, что применение AS2863619 при культивировании антиген-специфичных СБ4+-лимфоцитов усиливает генерацию Аг-Трег.

При этом получаемые Аг-Трег обладают фенотипичес-кими свойствами эффекторных регуляторных Т-клеток памяти и функционально подавляют пролиферацию СБ4+-лимфоцитов в ответ на антигены, что делает целесообразным изучение их способности к индукции иммунологической толерантности и подавлению иммунного ответа. Также изучение генетического разнообразия субпопуляций Трег памяти дадут дополнительные сведения об морфофункциональной организации клеток в условиях in vitro и in vivo. Наконец исследования зависимости индукции Foxp3 от сигнала CDK8/19-STAT5, позволят получить терапевтические преимущества для их использования в клинической практике.

■ Литература

1. Esensten J.H., Helou Y.A., Chopra G., Weiss A., Bluestone J.A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 2016; 44 (5): 973-88. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.immuni.2016.04.020

2. Khantakova J.N., Bulygin A.S., Sennikov S.V. The regulatory-T-cell memory phenotype: what we know. Cells. 2022; 11 (10): 1687. DOI: https://www.doi.org/10.3390/cells11101687

3. Gratz I.K., Campbell D.J. Organ-specific and memory treg cells: specificity, development, function, and maintenance. Front Immunol. 2014; 5: 333. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fimmu.2014.00333

4. Schmidt A., Oberle N., Krammer P.H. Molecular mechanisms of Treg-mediated T cell suppression. Front Immun. 2012; 3: 51. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fimmu.2012.00051

5. Sonar S.A., Lal G. Differentiation and Transmigration of CD4 T Cells in Neuroinflammation and Autoimmunity. Front Immunol. 2017; 8: 1695. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fimmu.2017.01695

6. Ohkura N., Sakaguchi S. Transcriptional and epigenetic basis of Treg cell development and function: its genetic anomalies or variations in autoimmune diseases. Cell Res. 2020; 30 (6): 465-74. DOI: https://www. doi.org/10.1038/s41422-020-0324-7

7. Сенников С. В., Хантакова Ю.Н. Роль субпопуляций Т-клеток в индукции иммунологической толерантности. Иммунология. 2017; 38 (4): 239-44. DOI: https://www.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-4-239-244

8. d'Hennezel E., Yurchenko E., Sgouroudis E., Hay V., Piccirillo C.A. Single-cell analysis of the human T regulatory population uncovers functional heterogeneity and instability within Foxp3+ cells. J Immunol. 2011; 186 (12): 6788-97. DOI: https://www.doi.org/10.4049/jimmunol. 1100269

9. Selck C., Dominguez-Villar M. Antigen-specific regulatory T cell therapy in autoimmune diseases and transplantation. Front Immunol. 2021; 12: 661875. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fimmu.2021. 661875

10. Guo Z., Wang G., Lv Y., Wan Y.Y., Zheng J. Inhibition of Cdk8/ Cdk19 activity promotes Treg cell differentiation and suppresses autoimmune diseases. Front. Immunol. 2019; 10: 1988. DOI: https://www.doi. org/10.3389/fimmu.2019.01988

11. Akamatsu M., Mikami N., Ohkura N., Kawakami R., Kitagawa Y., Sugimoto A., Hirota K., Nakamura N., Ujihara S., Kurosaki T., Hamaguchi H., Harada H., Xia G., Morita Y., Aramori I., Narumiya S., Sakaguchi S. Conversion of antigen-specific effector/memory T cells into Foxp3-expressing Treg cells by inhibition of CDK8/19. Sci Immunol. 2019; 4 (40): eaaw2707. DOI: https://www.doi.org/10.1126/sciimmunol.aaw2707

12. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. ETS 123 - Protection of Vertebrate Animals, 18.III.1986.

13. Bonam S.R., Bayry J. For antigen-specific effector or Foxp3+ regulatory T cell fate, cyclin-dependent kinases hold the trump card. Cell Mol Immunol. 2020; 17 (4): 310-2. DOI: https://www.doi.org/10.1038/ s41423-019-0349-3

14. Teh P.P., Vasanthakumar A., Kallies A. Development and function of effector regulatory T cells. Prog Mol Biol Transl Sci. 2015; 136: 155-74. DOI: https://www.doi.org/10.1016/bs.pmbts.2015.08.005

15. Koizumi S.I., Ishikawa H. Transcriptional regulation of differentiation and functions of effector T regulatory cells. Cells. 2019; 8 (8): 939. DOI: https://www.doi.org/10.3390/cells8080939

16. Qiu R., Zhou L., Ma Y., Zhou L., Liang T., Shi L., Long J., Yuan D. Regulatory T cell plasticity and stability and autoimmune diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 2020; 58 (1): 52-70. DOI: https://www.doi. org/10.1007/s12016-018-8721-0

17. Shevyrev D., Tereshchenko V. Treg heterogeneity, function, and homeostasis. Front Immunol. 2020 14; 10: 3100. DOI: https://www.doi. org/10.3389/fimmu.2019.03100

18. Hall B.M. T Cells: soldiers and spies - the surveillance and control of effector T cells by regulatory T cells. Clin J Am Soc Nephrol. 2015; 10 (11): 2050-64. DOI: https://www.doi.org/10.2215/CJN.06620714

19. Vignali D.A., Collison L.W., Workman C.J. How regulatory T cells work. Nat Rev Immunol. 2008; 8 (7): 523-32. DOI: https://www. doi.org/10.1038/nri2343

20. Wardell C.M., MacDonald K.N., Levings M.K., Cook L. Cross talk between human regulatory T cells and antigen-presenting cells: Lessons for clinical applications. Eur J Immunol. 2021; 51 (1): 27-38. DOI: https://www.doi.org/10.1002/eji.202048746

■ References

1. Esensten J.H., Helou Y.A., Chopra G., Weiss A., Bluestone J.A. CD28 costimulation: from mechanism to therapy. Immunity. 2016; 44 (5): 973-88. DOI: https://www.doi.org/10.10167j.immuni.2016.04.020

2. Khantakova J.N., Bulygin A.S., Sennikov S.V. The regulatory-T-cell memory phenotype: what we know. Cells. 2022; 11 (10): 1687. DOI: https://www.doi.org/10.3390/cells11101687

3. Gratz I.K., Campbell D.J. Organ-specific and memory treg cells: specificity, development, function, and maintenance. Front Immunol. 2014; 5: 333. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fimmu. 2014.00333

4. Schmidt A., Oberle N., Krammer P.H. Molecular mechanisms of Treg-mediated T cell suppression. Front. Immun. 2012; 3: 51. DOI: https:// www.doi.org/10.3389/fimmu.2012.00051

5. Sonar S.A., Lal G. Differentiation and transmigration of CD4 T cells in neuroinflammation and autoimmunity. Front. Immunol. 2017; 8: 1695. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fimmu.2017.01695

6. Ohkura N., Sakaguchi S. Transcriptional and epigenetic basis of Treg cell development and function: its genetic anomalies or variations in autoimmune diseases. Cell Res. 2020; 30 (6): 465-74. DOI: https://www. doi.org/10.1038/s41422-020-0324-7

7. Sennikov S.V., Khantakova J.N. Role of T-cell subpopulations in the immunologic tolerance induction. Immunologiya. 2017; 38 (4): 239-44. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-4-239-244 (in Russian)

8. d'Hennezel E., Yurchenko E., Sgouroudis E., Hay V., Picciril-lo C.A. Single-cell analysis of the human T regulatory population uncovers functional heterogeneity and instability within FOXP3+ cells. J Immunol. 2011; 186 (12): 6788-97. DOI: https://www.doi.org/10.4049/jim-munol.1100269

9. Selck C., Dominguez-Villar M. Antigen-specific regulatory T cell therapy in autoimmune diseases and transplantation. Front Immunol. 2021; 12: 661875. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fimmu.2021. 661875

10. Guo Z., Wang G., Lv Y., Wan Y.Y., Zheng J. Inhibition of Cdk8/ Cdk19 activity promotes Treg cell differentiation and suppresses autoimmune diseases. Front. Immunol. 2019; 10: 1988. DOI: https://www.doi. org/10.3389/fimmu.2019.01988

11. Akamatsu M., Mikami N., Ohkura N., Kawakami R., Kitagawa Y., Sugimoto A., Hirota K., Nakamura N., Ujihara S., Kurosaki T., Hamaguchi H., Harada H., Xia G., Morita Y., Aramori I., Narumiya S., Sakagu-chi S. Conversion of antigen-specific effector/memory T cells into Foxp3-expressing Treg cells by inhibition of CDK8/19. Sci Immunol. 2019; 4 (40): eaaw2707. DOI: https://www.doi.org/10.1126/sciimmunol. aaw2707

12. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. ETS 123 - Protection of Vertebrate Animals, 18.III.1986.

Сведения об авторах

Булыгин Алексей Сергеевич - аспирант лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: aleksej.bulygin95@mail.ru http://orcid.org/0000-0001-9055-6069

Хантакова Юлия Николаевна - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация

E-mail: khantakovain@bionet.nsc.ru https://orcid.org/0000-0001-9281-9002

Фишер Марина Сергеевна - аспирант лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: msolshanova@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-6261-7557

Терещенко Валерий Павлович - канд. мед. наук, науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: tervp91@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-1620-6447

Курилин Василий Васильевич - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: 2221910@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-5617-0450

13. Bonam S.R., Bayry J. For antigen-specific effector or Foxp3+ regulatory T cell fate, cyclin-dependent kinases hold the trump card. Cell Mol Immunol. 2020; 17 (4): 310-2. DOI: https://www.doi.org/10.1038/ s41423-019-0349-3

14. Teh P.P., Vasanthakumar A., Kallies A. Development and function of effector regulatory T cells. Prog Mol Biol Transl Sci. 2015; 136: 155-74. DOI: https://www.doi.org/10.1016/bs.pmbts.2015.08.005

15. Koizumi S.I., Ishikawa H. Transcriptional regulation of differentiation and functions of effector T regulatory cells. Cells. 2019; 8 (8): 939. DOI: https://www.doi.org/10.3390/cells8080939

16. Qiu R., Zhou L., Ma Y., Zhou L., Liang T., Shi L., Long J., Yuan D. Regulatory T cell plasticity and stability and autoimmune diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 2020; 58 (1): 52-70. DOI: https://www.doi. org/10.1007/s12016-018-8721-0

17. Shevyrev D., Tereshchenko V. Treg Heterogeneity, function, and homeostasis. Front Immunol. 2020 14; 10: 3100. DOI: https://www.doi. org/10.3389/fimmu.2019.03100

18. Hall B.M. T Cells: Soldiers and spies - the surveillance and control of effector T cells by regulatory T cells. Clin J Am Soc Nephrol. 2015; 10 (11): 2050-64. DOI: https://www.doi.org/10.2215/CJN.06620714

19. Vignali D.A., Collison L.W., Workman C.J. How regulatory T cells work. Nat Rev Immunol. 2008; 8 (7): 523-32. DOI: https://www. doi.org/10.1038/nri2343

20. Wardell C.M., MacDonald K.N., Levings M.K., Cook L. Cross talk between human regulatory T cells and antigen-presenting cells: Lessons for clinical applications. Eur J Immunol. 2021; 51 (1): 27-38. DOI: https://www.doi.org/10.1002/eji.202048746

Authors' information

Aleksey S. Bulygin - PhD Student of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: aleksej.bulygin95@mail.ru, http://orcid.org/0000-0001-9055-6069

Julia N. Khantakova - PhD, Senior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: khantakovain@bionet.nsc.ru https://orcid.org/0000-0001-9281-9002

Marina S. Fisher - PhD Student of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: msolshanova@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-6261-7557

Valeriy P. Tereshchenko - PhD, Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: tervp91@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-1620-6447

Vasily V. Kurilin - PhD, Senior Researcher of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: 2221910@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-5617-0450

Шкаруба Надежда Сергеевна - канд. мед. наук, врач-ревматолог, отд. ревматологии, клиника иммунопатологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: sen-nadezhda@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-7676-6166

Сенников Сергей Витальевич - д-р мед. наук, проф., зав. лаб. молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Мин-обрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: sennikovsv@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-7366-7768

Nadezhda S. Shkaruba - PhD, Rheumatologist, Division of Rheumatology, Clinic of Immunopathology, RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: sen-nadezhda@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-7676-6166

Sergey V. Sennikov - MD, PhD, Prof., Head of the Molecular Immunology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: sennikovsv@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-7366-7768

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.