CC BY
20
© Коллектив авторов, 2022
Филиппова Ю.Г.1, Кузнецова М.С.1, Шевченко Ю.А.1, Терещенко В.П.1, Фишер М.С.1, Курилин В.В.1, Пашкина Е.А.1, Акахори Я.2, Шику Х.1, 2, Сенников С.В.1
Фенотип и эффекторные функции СБ2-специфичных CAR-T-клеток in vitro
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 630099, г. Новосибирск, Российская Федерация
2 Университет Миэ, г. Цу, Япония
Резюме
Введение. Использование Т-лимфоцитов с химерным антигенным рецептором (CAR) лежит в основе новых перспективных технологий иммунотерапии опухолей, идея которой заключается в адоптивном переносе модифицированных Т-клеток, способных к цитотоксичности, не нуждающихся в дополнительной костимуляции и распознающих поверхностные антигены МНС-независимым образом благодаря отличному от TCR строению рецептора. В данной работе представлена характеристика ex vivo CAR-T-клеток, специфичных к дисиалоганглиозиду GD2, экспрессия которого ограничена злокачественными новообразованиями, что делает эту молекулу перспективной мишенью. Добавление в конструкцию CAR костимулирующих доменов, таких как 4-1BB или CD28, повышает выживаемость и пролиферацию полученных CAR-Т-клеток, а встраивание GITR-лиганда (GITRL) способствует самоподдержанию полученных популяций и улучшению противоопухолевой активности.
Цель исследования - изучение фенотипа и эффекторных функций GD2-специфичных CAR-T-клеток с помощью различных функциональных тестов in vitro.
Материал и методы. Трансдуцированные и нетрансдуцированные GD2-специ-фичным CAR-рецептором лимфоциты взрослых здоровых доноров исследованы с помощью проточной цитометрии на предмет содержания субпопуляций клеточной памяти по маркерам CD45RA и CD62L и явлений клеточного истощения по маркерам PD-1 и TIM-3. Цитотоксичность изучена методом мультиплексного анализа кондиционных сред после совместного культивирования исследуемых генно-модифицирован-ных клеток и клеток опухолевых линий на проточном цитометре и колориметрическим методом по содержанию лактатдегидрогеназы. Эффекторные функции полученных CAR-Т-клеток оценивали после сокультивирования с клетками-мишенями по маркерам клеточной активации 4-1BB, CD40L, CD69 и FasL с помощью проточной цитомет-рии.
Результаты. Трансдуцированные CD4+- и CD8+-лимфоциты представляли собой наименее дифференцированную популяцию эффекторных CD45RA+CD62L+-клеток с высокой жизнеспособностью и пролиферативной активностью, при этом наблюдалась низкая доля истощенных PD-1+TIM-3+-клеток. Полученные трансдуцированные клетки проявляли антиген-специфические свойства в отношении линий опухолевых клеток, несущих целевой антиген. Кроме того, наблюдалась цитотоксическая функция трансдуци-рованных Т-лимфоцитов, несущих маркеры клеточной активации 4-1BB, CD69 и CD40L, а также их цитокин-продуцирующая активность в присутствии GD2-экспрессирующих опухолевых клеток.
Заключение. Полученные GD2-специфичные CAR-Т-клетки проявляют антиген-специфические противоопухолевые свойства in vitro, что обусловливается их цитокин-продуцирующей активностью, повышением экспрессии маркеров клеточной активации 4-1BB, CD69 и CD40L и низкой долей истощенных PD-1+TIM-3+-клеток.
Ключевые слова: CAR-T-клетки; GD2; GITRL; Т-клеточное истощение; маркеры активации; антиген-специфическая цитотоксичность
Статья получена 20.07.2022. Принята в печать 24.08.2022.
Для корреспонденции
Сенников Сергей Витальевич -доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии, главный научный сотрудник лаборатории клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: sennikovsv@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Для цитирования: Филиппова Ю.Г., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Терещенко В.П., Фишер М.С., Кури-лин В.В., Пашкина Е.А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Фенотип и эффекторные функции ОБ2-специ-фичных CAR-T-клеток in vitro. Иммунология. 2022; 43 (5): 525-535. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-525-535
Финансирование. Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 21-65-00004). URL: https://rscf.ru/project/21-65-00004/
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Терещенко В.П., Кури-лин В.В., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В.; сбор и обработка материала - Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Терещенко В.П., Филиппова Ю.Г., Фишер М.С., Пашкина Е.А.; статистическая обработка данных - Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Пашкина Е.А.; написание текста - Филиппова Ю.Г.; редактирование - Филиппова Ю.Г., Кузнецова М.С., Сенников С.В.; утверждение окончательного варианта статьи - Сенников С.В.; ответственность за целостность всех частей статьи - Филиппова Ю.Г.
Philippova J.G.1, Kuznetsova M.S.1, Shevchenko J.A.1, Tereshchenko V.P.1, Fisher M.S.1, Kurilin V.V.1, Pashkina E.A.1, Akahori Ya.2, Shiku H.1 2, Sennikov S.V.1
Phenotype and effector functions of GD2-specific CAR-T lymphocytes in vitro
1 Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology of the Ministry of Science and High Education of Russian Federation, 630099, Novosibirsk, Russian Federation
2 Mie University, Tsu City, Japan
Abstract
Introduction. The application of T lymphocytes with a chimeric antigen receptor (CAR) underlies new promising technologies for tumor immunotherapy, the main idea of which is associated with the adoptive transfer of modified T cells that are capable of cytotoxicity, this does not require additional costimulation and recognize surface antigens in an MHC-independent manner due to their difference from TCR to receptor structure. This paper presents characterization of CAR-T cells specific for disialoganglioside GD2 ex vivo, which expression is restricted to malignant neoplasms, making this molecule a promising target. The addition of costimulatory domains, such as 4-1BB or CD28 to bone CAR cells increases survival and proliferation of the resulting CAR-T cells, and the insertion of the GITR ligand (GITRL) promotes self-maintenance of the resulting populations and improves antitumor activity.
Aim of the study - to research the phenotype and effector functions of GD2-specific CAR-T lymphocytes in vitro using various functional tests.
Material and methods. Transduced and non-transduced GD2-specific CAR lymphocytes from healthy adult donors were examined for the content of cell memory subpopulations by CD45RA and CD62L markers and cell exhaustion by PD-1 and TIM-3 markers using flow cytometry. Cytotoxicity was studied by the multiplex analysis of conditioned media after cocultivation of the studied genetically modified cells and tumor cell lines on a flow cytometer and by the colorimetric method by the content of lactate dehydrogenase. The effector functions of the resulting CAR-T cells were assessed after cocultivation with target cells for cell activation markers 4-1BB, CD40L, CD69 and FasL using flow cytometry.
Results. Transduced CD4+ and CD8+ lymphocytes represented the least differentiated population of CD45RA+CD62L+ effector cells with high viability and proliferative activity, also, a proportion of exhausted PD-1+TIM-3+ cells was low. The resulting transduced cells exhibited antigen-specific properties for tumor cell lines carrying the target antigen. In addition, the cytotoxic function of transduced T lymphocytes carrying cellular activation markers 4-1BB, CD69 and CD40L, as well as their cytokine-producing activity in the presence of GD2-expressing tumor cells, was observed.
Conclusion. The obtained GD2-specific CAR-T cells exhibit antigen-specific antitumor properties in vitro, which is due to their cytokine-producing activity, increased expression of cell activation markers 4-1BB, CD69 and CD40L, and a low proportion of exhausted PD-1+TIM-3+ cells.
For correspondence
Sergey V. Sennikov -MD, PhD, Professor, Head of Laboratory of Molecular Immunology, Chief Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: sennikovsv@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Keywords: CAR-T cells; GD2; GITRL; T cell exhaustion; activation markers; antigen-specific cytotoxicity
Received 20.07.2022. Accepted 24.08.2022.
For citation: Philippova J.G., Kuznetsova M.S., Shevchenko J.A., Tereshchenko V.P., Fisher M.S., Kurilin V.V., Pash-kina E.A., Akahori Ya., Shiku H., Sennikov S.V. Phenotype and effector functions of GD2-specific CAR-T lymphocytes in vitro. Immunologiya. 2022; 43 (5): 525-35. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-525-535 (in Russian)
Funding. The study was supported by the grant of the Russian Science Foundation (project No. 21-65-00004). URL: https://rscf.ru/project/21-65-00004/
Conflict of interests. Authors declare no conflict of interests.
Authors' contributions. The concept and design of the study - Kuznetsova M.S., Shevchenko J.A., Tereshchenko V.P., Kurilin V.V., Akahori Ya., Shiku H., Sennikov S.V.; data collection and processing - Kuzne-tsova M.S., Shevchenko J.A., Tereshchenko V.P., Philippova J.G., Fisher M.S., Pashkina E.A.; statistical data processing - Kuznetsova M.S., Shevchenko J.A., Pashkina E.A.; text writing - Philippova J.G.; editing - Philippo-va J.G., Kuznetsova M.S., Sennikov S.V.; approval of the final version of the article - Sennikov S.V.; responsibility for the integrity of all parts of the article - Philippova J.G.
Введение
Использование Т-клеток с химерным антигенным рецептором (chimeric antigen receptor, CAR) лежит в основе новых перспективных технологий в иммунотерапии опухолей. CAR представляет собой комбинацию 4 основных участков: (1) внеклеточного антиген-связывающего домена в виде одноцепочеч-ного вариабельного фрагмента (scFv), полученного из моноклональных антител (МкАт); (2) шарнирного связывающего домена; (3) трансмембранного домена; (4) внутриклеточного активирующего домена (рис. 1А) [1]. Основная идея CAR-Т-клеточных технологий, таким образом, заключается в адоптивном переносе генно-модифицированных Т-лимфоцитов, способных к реализации цитотоксичности, не нуждающихся в дополнительной костимуляции и распознающих поверхностные антигены МНС-независимым образом благодаря отличному от TCR строению рецептора [2]. Опубликованные ранее клинические исследования в области лечения гематологических злокачественных новообразований показали перспективные результаты. В частности, это касается применения CAR-T-клеток, специфичных к молекуле CD 19, для В-клеточных опухолей [3, 4]. Такой терапевтический подход значительно улучшал прогноз и общую выживаемость пациентов, в том числе при рецидивирующем и/или рефрактерном остром лимфобластном лейкозе [5]. В то же время лечение CAR-T-клетками солидных новообразований имеет ограниченный успех, который лимитируется множеством факторов, такими как иммуносу-прессивное микроокружение опухоли и токсичность, связанная с нежелательной внеопухолевой антигенной специфичностью [6]. Кроме того, раннее истощение Т-клеток, связанное со снижением пролиферативной способности, влечет за собой снижение эффекторных функций и раннюю гибель клеток [7]. Однако ведущей проблемой лечения солидных опухолей CAR-Т-клетками остается отсутствие специфичного опухолевого антигена, на который может быть нацелен CAR [8]. В связи с этим активно ведутся исследования по оптимизации CAR-рецептора, которые обеспечат вы-
сокую противоопухолевую эффективность, а подбор универсального антигена-мишени позволит направленно элиминировать злокачественные новообразования и уменьшить побочные эффекты проводимой терапии.
При выборе мишени необходимо учитывать ее экспрессию на нормальных клетках организма, чтобы избежать нежелательной токсичности против нетранс-формированных тканей [8]. Одной из таких молекул является дисиалоганглиозид GD2, который экспресси-руется на поверхности опухолевых клеток различного происхождения у взрослых и детей, включая меланому, нейробластому, глиобластому, астроцитому, ретиноблас-тому, саркому Юинга, рабдомиосаркому, остеосаркому, лейомиосаркому, липосаркому, фибросаркому, мелкоклеточный рак легкого и рак молочной железы [9].
В то же время уровень экспрессии ганглиозида снижен в нормальных тканях, что потенциально уменьшает риски связывания CAR-рецептора с антигеном-мишенью и разрушения здоровых клеток и органов [10]. Кроме того, многие исследования подтвердили эффективность нацеливания на антиген GD2 с помощью моноклональных антител (МкАт) при солидных новообразованиях. Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA) были одобрены 2 препарата на основе химерных мышиных МкАт Динутуксимаб (Унитуксин®) и Динутуксимаб бета (Карзиба®), которые могут быть рекомендованы в качестве дополнительного средства лечения нейробластомы у детей, находящихся в группе высокого риска, а также для пациентов с рефрактерной или рецидивирующей опухолью [11].
Что касается CAR-T-терапии, на данный момент времени нет официально одобренных препаратов на основе GD2-специфичных CAR-T-клеток, однако некоторые из них находятся на стадии активных клинических исследований (NCT04539366, NCT03373097, NCT05298995, NCT04196413, NCT01953900, NCT04099797, NCT03294954, NCT03721068, NCT01822652). Полученные данные говорят о неоднозначных результатах
^ GD2-no3HTHBHaa опухолевая клетка
Опухоль-специфичное антитело CD28
GD2-CAR-T-клетки
GD2 CAR
Э
LTR
f > /• N Г >| г ->
scFvCL TMD ICD Zeta ' > P2A GITRL LTR
^ >
;
Рис. 1. Строение CAR-Т-клеточного рецептора (А) и схематичное изображение структуры вектора, кодирующего GD2-специфичные CAR-T-клетки (Б)
VH - вариабельный домен тяжелой цепи (heavy chain variable domain); VL - вариабельный домен легкой цепи (light chain variable domain); CH - константный домен тяжелой цепи (heavy chain constant domain); CL - константный домен легкой цепи (light chain constant domain); LTR - длинный концевой повтор (long terminal repeat); scFvCL - одноцепочечный вариабельный фрагмент (single chain variable fragment), объединенный с константным шарнирным связывающим участком легкой цепи; TMD - трансмембранный домен (trans-membrane domain); ICD - внутриклеточный домен (intra-cellular domain); GITRL - лиганд глюкокорти-коид-индуцированного TNFR-родственного белка (glucocorticoid induced TNFR-relatedprotein ligand); P2A - пептид, связывающий последовательности, кодирующие GD2-специфичный CAR-рецептор и GITRL. Строение CAR-рецептора: (1) антиген-связывающий домен; (2) - шарнирная область; (3) - трансмембранный домен; (4) - внутриклеточный домен.
внеклеточный
T-клеточной терапии, поэтому поиск оптимальных подходов к получению CAR-Т-лимфоцитов, специфичных к ганглиозиду GD2, не теряет своей актуальности.
В настоящей работе мы отработали получение CAR-T-клеток, специфичных к GD2, путем трансдукции вирусным вектором, и предполагаем перспективность такого подхода, поскольку включение в конструкцию CAR-рецептора костимулирующих доменов 4-1BB и/или CD28 повышает противоопухолевую активность и персистенцию, а глюкокортикоид-индуцированный TNFR-родственный белок (GITR) обладает способностью стимулировать функции эффекторных Т-клеток и подавлять эффекты Т-регуляторных клеток [4, 12-14]. Ранее уже было показано, что CD3.4-1BB.GITR-CAR-T-клетки обладают лучшей цитотоксичностью по сравнению с CD3.4-1BB-CAR-T-клетками, а также повышенной секрецией ИФН-у [15]. Для оценки получаемых клеток мы провели исследования in vitro эффективности трансдукции, оценили фенотипические особенности и цитотоксический потенциал клеток в тестах против GD2-позитивной опухолевой клеточной линии.
Материал и методы
Ретровирусный вектор, кодирующий CAR-рецептор. Для получения CAR-Т-клеток, специфичных к антигену GD2, использовались вирусные частицы, которые ранее были разработаны на базе Высшей школы медицины Университета Миэ (Япония) под руководством профессора Х. Шику. Для разработки вирионов использовался гаммаретровирусный вектор, кодирующий GD2-специфичный CAR-рецептор и GITRL. Структура вектора схематично представлена на рис. 1.
Получение генно-модифицированных ОБ2-спе-цифичных CAR-Т-лимфоцитов. Забор периферической крови здоровых взрослых доноров был одобрен локальным этическим комитетом НИИФКИ Минобр-науки России, решение №139 от 30.05.2022 Мононук-леарные клетки (МНК) выделяли из периферической крови 6 условно здоровых доноров центрифугированием над слоем фиколл-урографина. МНК в концентрации 1 • 106 на 2 мл среды GT-T551 (Takara Bio, Япония), содержащей 300 ЕД/мл ИЛ-2 (Ронколейкин, Россия)
и 6 мкл/мл сыворотки IV группы крови, высевали в лунку 12-луночного планшета, предварительно покрытого 400 мкл раствора PBS с добавлением 25 мг/мл рет-ронектина (Takara Bio, Япония) и 5 мг/мл anti-CD3-антител (Biolegend, США), со сменой половины среды на 2-й и на 3-й день культивирования.
Планшеты для ретровирусной трансдукции подготавливали на 3-й день. Растворы ретровирусов (любезно предоставлены Х. Шику, Высшая школа медицины Уни -верситета Миэ, Япония) разбавляли в 4 раза раствором PBS, содержащим 2 % сывороточного альбумина человека, и 5 % раствором цитратного буфера с добавлением глюкозы (ACD-A).
В лунку 24-луночного планшета, предварительно покрытого 400 мкл раствора PBS, который содержит 25 мг/мл ретронектина (Takara Bio, Япония), добавляли 1 мл раствора ретровирусов и центрифугировали с ускорением 2000 g в течение 2 ч при 32 оС. После удаления раствора ретровирусов в лунки добавляли полученные активированные лимфоциты в концентрации 1,5-2 • 105 на 1 мл (преимущественно CD3+-Т-лим-фоцитов) и центрифугировали при ускорении 1000 g в течение 10 мин при 32 оС. Вирусную трансдукцию повторяли на 4-й день, далее через 4-5 ч клетки переносили в 6-луночные планшеты в 3,5 мл культуральной среды.
Эффективность трансдукции и оценка фенотипа.
Оценка эффективности трансдукции и фенотипа проводилась с помощью проточной цитометрии для транс-дуцированных и нетрансдуцированных Т-лимфоцитов от 6 условно здоровых доноров на 7-й день культивирования.
Аликвоты клеток в объеме 100 мкл метили последовательно биотинилированными коммерческими антителами Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG, F(ab')2 fragment specific (Jackson Immunoresearch, США) и PE-конъюгированным стрепт-авидином (Biolegend, США) для визуализации прошедших трансдукцию клеток. Затем клетки инкубировали 20 мин в темноте при комнатной температуре и отмывали дважды 2 мл PBS с NaN3.
Для изучения фенотипа те же аликвоты метили флуоресцентными специфичными к антигенам человека антителами: анти-CD4-Bv570, анти-CD8-PeCy7, анти-CD3-AF700, анти-CD45RA-Bv711, анти-CD62L-AF488, анти-CD95(Fas)-PerCP-Cy5.5, анти-CD69-AF647, анти-TIM-3-APC/Cy7, анти-PD-1 -Bv421 (Biolegend, США). Клетки инкубировали 20 мин в темноте при комнатной температуре, отмывали 2 мл PBS c NaN3 и анализировали с помощью проточного цитометра Attune NxT (Thermo Fisher, США). Клетки с поврежденной мембраной выявляли красителем Zombie Aqua (Biolegend, США). Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo v10.8.1 (BD Bioscience, США).
Оценка цитотоксичности колориметрическим методом. Антиген-индуцированную CAR-Т-клеточную цитотоксичность оценивали колориметрическим ме-
тодом по содержанию лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в кондиционных средах на 8-й день трансдукции после совместного культивирования трансдуцированных Т-лимфоцитов с GD2-позитивной и GD2-негативной опухолевыми клеточными линиями S6 и V9 соответственно [16]. Перед проведением оценки цитотоксичности проводили калибровку с целью определения оптимального соотношения клеток эффекторов и мишеней, а также оптимальной временной точки анализа. В плоскодонные 96-луночные планшеты высевали по 4 • 103 клеток соответствующих опухолевых линий, позитивных и негативных по экспрессии антигена GD2. Через 17-18 ч к опухолевым клеточным линиям добавляли по 20 • 103 клеток из трансдуцированных или нетрансдуцированных культур Т-лимфоцитов в соотношении эффектор/мишень 5 : 1, а затем после 7-8 ч совместного культивирования из лунок забирали 50 мкл кондиционной среды, которую анализировали на предмет содержания ЛДГ с помощью коммерческого набора CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, США) согласно инструкции производителя. Линии S6 и V9 были предоставлены из коллекции клеточных культур Высшей школы медицины Университета Миэ под руководством профессора Х. Шику.
Экспрессия маркеров активации и цитотоксичности. Экспрессию маркеров активации и цитотоксич-ности оценивали на 8-й день трансдукции. Полученные генно-модифицированные Т-лимфоциты культивировали совместно с опухолевыми клетками, позитивных и негативных по экспрессии антигена GD2. К опухолевым клеткам добавляли соответствующие трансдуци-рованные или нетрансдуцированные клетки в количестве 4 • 104 на лунку в соотношении эффектор/мишень 10 : 1. Совместные культуры GD2-специфичных CAR-T-и опухолевых клеток инкубировали в течение 4-5 ч, после чего для выявления антиген-специфичных клеток с помощью проточной цитометрии клетки собирали и метили биотин-конъюгированными антителами AffiniPure F(ab')2 fragment specific, а далее дополнительно метили PE-конъюгированным стрептавидином (Biolegend, США). Затем клетки метили моноклональными антителами для проточной цитометрии анти-CD4-Bv570, анти-CD8-PeCy7, анти-ОТ3^700, анти-ОТ69^647, анти-Ш178^Ь)^421™, анти-Ш154(Ш40Ь)-PerCP/Cy5.5, анти-CD 137(4- 1BB)-B V711™ (Biolegend, США), а также красителем Zombie Aqua (Biolegend, США) для выявления клеток с поврежденной мембраной.
Продукцию цитокинов оценивали методом мультиплексного анализа на проточном цитометре BD FACS-Canto™ II (Becton Dickinson, США) после совместного культивирования в течение 24 ч трансдуцированных и нетрансдуцированных клеток и клеток опухолевых линий, экспрессирующих и неэкспрессирующих целевой антиген GD2, с использованием коммерческого набора LEGENDplex HU Th Cytokine Panel (12-plex) согласно инструкции производителя.
1000
< 500
All Events - All Abs Donor 1 RV+
0,001
102 0 103 104 105 106 CD3 -Alexa Fluor™700-A
106
105
< 104
E P
t Si
CD3+ - All Abs Donor 1 RV+
10
Transduced Live: 72.2...
0
103
104 105 106
106 105 Т.
104
V
И
D
C
103
-103
-104
Transduced Live - All Abs Donor 1 RV+
CD4+: 18,473 %
Live/Dead - ZA-A
CD8+: 63,870 %
0 103 104 105 106 CD8 - PE-Cy7-A
3
0
-A106
°g 105 С 104
or
£ 103
a x le Al
hJ
(N ЧО
102 0 -102
0,00*102
Transduced Live - All Abs Donor 1 RV+
11,49... ■■ '..л? is?: 68,354 % Ж
v!>V<3 ifyCijX ■ 7,960 % 12,194 %
0 103
104
105 10
Transduced Live - All Abs Donor 1 RV+
106 < 105
£ 104 PC
ÜR 103
D
C
-103
' 85,620 % ' W 9,989 %
i 3,811 % 0,580 %
CD45RA - BV711-A
0 103 104 105 106 CD69 -Alexa Fluor™647-A
Transduced Live - All Abs Donor 1 RV+
D P
106 105
104
103
4,093 % 1,333 %
84 444 %"' 10,130 %
0 103 TIM-3 - APC-Cy7-A
104
Рис. 2. Схема гейтирования для оценки фенотипа и эффективности трансдукции полученных ОБ2-специфичных СЛЯ-Т-клеток
Данные представлены для одного из исследуемых образцов и являются примером результатов проточной цитометрии.
0
Статистическая обработка данных. Для статистической обработки данных использовали программное обеспечение GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, США). Полученные данные проверяли на нормальность тестами Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Значимые различия между выборками оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA с применением критериев множественного сравнения Тьюки, Сидака или Данна. Различия между сравниваемыми группами считались статистически достоверными при p < 0,05. Данные представлены как средняя и стандартная ошибка средней.
Результаты
Эффективность трансдукции и фенотип трансдуцированных клеток
После трансдукции клеток условно-здоровых доноров с помощью проточной цитометрии была выявлена относительно высокая эффективность трансдукции по реализуемому протоколу для GD2-специфичных CAR-T-клеток, которая составила 61,6 ± 5,39 % (средняя и стандартная ошибка средней, n = 6). Для трансдуцированных CD4+- и CD8+-лимфоцитов наблюдалось количественное преобладание эффекторных клеток (29,71 ±
3,45 и 52,8 ± 3,97 % соответственно, средняя и стандартная ошибка средней, п = 6). Жизнеспособность трансдуцированных и нетрансдуцированных клеток в среднем составила > 95 %. Пример результатов проточной цитометрии и схема гейтирования представлены на рис. 2.
Среди изучаемых клеток памяти доля трансдуцированных клеток с фенотипом наивных Т-лимфоцитов СБ45РЛ+СБ62Ь+ и с фенотипом Т-лимфоцитов центральной памяти СВ45РЛ-СБ62Ь+ составила 50 % (47,58 ± 6,14, средняя и стандартная ошибка средней, п = 6) и 20 % (23,66 ± 6,8, средняя и стандартная ошибка средней, п = 6) соответственно. Доля терминально дифференцированных эффекторных Т-лимфоцитов СБ45РЛ+СБ62Ь- и Т-лимфоцитов эффекторной памяти СБ45КЛ СВ62Ь- составила около 15 % (14,49±3,75 и 14,27±2,63 соответственно, средняя и стандартная ошибка средней, п = 6) для каждой субпопуляции трансдуцированных клеток. Анализ функциональных маркеров выявил, что лишь небольшая доля трансдуцирован-ных клеток несла маркер истощения Т1М-3 и маркер активированных клеток РБ-1 (16,07 ± 6,58 и 3,78 ± 1,59 соответственно, средняя и стандартная ошибка средней, п = 6).
Экспрессия маркеров активации и цитотоксичности GD2-специфичных CAR-T-лимфоцитов после совместного культивирования с опухолевыми клетками
Анализ экспрессии маркеров цитотоксичности (FasL) и активации (CD40L, CD69, 4-1BB) с помощью проточной цитометрии после совместного культивирования трансдуцированных клеток с клетками-мишенями показал, что большая статистически значимая доля CD69+- и 4-1ВВ+-клеток обнаруживалась после культивирования с GD2-позитивной клеточной линией по сравнению с GD2-негативной и по сравнению с клетками без совместного культивирования с опухолевой клеточной линией (рис. 3). Аналогичные тенденции наблюдались для маркеров FasL и CD40L.
Цитотоксические функции GD2-специфичных CAR-Т-лимфоцитов in vitro
Оценка цитотоксической функции трансдуциро-ванных клеточных культур с использованием метода измерения ЛДГ в кондиционных средах после культивирования с опухолевыми клетками выявил, что полученные GD2-специфичные CAR-T-лимфоциты оказывают статистически значимый цитотоксический эффект на опухолевую GD2-позитивную клеточную линию S6 по сравнению с нетрансдуцированными клетками и со-культивированием с контрольной GD2-негативной клеточной линей V9 (рис. 4).
Анализ цитокин-продуцирующей функции GD2-специфичных CAR-Т-лимфоцитов
Был проведен анализ концентрации цитокинов в супернатантах после сокультивирования полученных GD2-специфичных CAR-T-клеток с GD2-позитивной и GD2-негативной культурами опухолевых клеток. В качестве контроля использовали нетрансдуцирован-ные клетки этих же доноров с аналогичными клеточными опухолевыми культурами. Данные показывают, что после культивирования CAR-T-клеток с клеточной линией S6, несущей антиген GD2, наблюдается повышение концентрации провоспалительных цитоки-нов, таких как ИФН-у, ИЛ-2 и ФНОа (рис. 5). В то же время наблюдалась низкая продукция тех же цитокинов CAR-T-клетками без присутствия опухолевых клеток-мишеней.
Обсуждение
В работе представлена характеристика полученных генно-модифицированных Т-клеток и исследованы их эффекторные функции по отношению к GD2-позитивным опухолевым клеточным линиям. Результаты показали, что среди клеток памяти трансдуцированных GD2-специфичных CAR-T-клеток преобладает субпопуляция наименее дифференцированных CD45RA+CD62L+-Т-лимфоцитов с высокой жизнеспособностью и пролиферативной активностью [17]. В то же время наблюдается примерно одинаковое содержание субпопуляций трансдуцированных клеток, относящихся к Т-клеткам центральной памяти и терминально
« 60-
3- 40
и ц
о s
и
^
3D
C
Ï
и
я 20 ц
D
G
JL
£
X
i
Т
Г-Ц J,
т
4-1BB+ CD40L+ CD69+
FasL
□ CAR-T □ CAR-T+S6 (GD2+) □ CAR-T+V9 (GD2-)
Рис. 3. Экспрессия маркеров активации и цитотоксичности на поверхности GD2-специфичных CAR-T-лимфоцитов после сокультивирования с опухолевыми клетками CAR-T - клетки без сокультивирования с опухолевыми клетками; CAR-T+S6(GD2+) - клетки, культивированные с линией S6, клетки которой несут на своей поверхности антиген GD2; CAR-T+V6(GD2-) - клетки, культивированные с линией V6, клетки которой не несут на своей поверхности антиген GD2 (n = 6). Стрелками указаны значимые отличия; * - p < 0,05; стандартный two-way ANO VA с применением критерия множественных сравнений Тьюки.
дифференцированным Т-клеткам, т. е. долгоживу-щим Т-клеткам с потенциалом к хомингу в лимфоид-ные органы и высокой пролиферативной активностью и короткоживущим Т-клеткам с большей цитотоксич-ностью и наименьшей пролиферативной способностью соответственно. Трансдуцированные клетки включали в себя СБ4+- и СБ8+-лимфоциты, при этом наблюдалось повышение доли СБ8+-клеток-эффекторов.
Механизмы, приводящие к истощению тонической передачи сигналов в Т-клетках, до конца не изучены, однако авторами многих работ показано, что включе-
50 -,
g 40-
30-
20-
10-
RV-трансдукция Без трансдукции □ GD2+ (S6) □ GD2- (V9)
Рис. 4. Цитотоксичность GD2-специфичных CAR-Т-лимфо-цитов (RV-трансдукция) против GD2 экспрессирующей (S6) и неэкспрессирующей (V9) клеточных опухолевых линий (n = 6)
Стрелками указаны значимые отличия; p < 0,05; двухфак-торный дисперсионный анализ с применением критерия множественных сравнений Сидака.
0
0
1,0-1 0,80,60,40,20,050,040,030,020,01 -0,00--
1
сУ
ut
5
\
э
60-| 50403030 -г
-
с 2010-
0,0
1==1
О >
^ с/' é"
.о4- и4-
с? с**
Э
15 —I 1050,50,40,30,20,10,0 —
□Г
S
о*
5
* /
/
Рис. 5. Продукция ИЛ-2 (А), ИФН-у (Б) и ФНОа (В) культурами трансдуцированных клеток, содержащих GD2-специфичные CAR-T-лимфоциты, после сокультивирования с клетками опухолевых линий, экспрессирующими соответствующий антиген, или без него
CAR-T+S6(GD2+) - совместная культура Т-клеток, трансдуцированных вектором, кодирующим GD2--специфичный CAR-рецептор, и GD2+-опухолевых клеток линии S6; CAR-T+V9(GD2) - совместная культура Т-клеток, трансдуцированных вектором, кодирующим GD2-специфичный CAR-рецептор, и GD2~-опухолевых клеток линии V9; CAR-T - культура Т-клеток, трансдуцированных вектором, кодирующим GD2-специфичный CAR-рецептор, без совместного культивирования с опухолевыми клетками; nonRV+S6(GD2+) - совместная культура нетрансдуцированных Т-клеток и GD2+-опухолевых клеток линии S6 (n = 6); стрелками указаны значимые отличия; * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001; **** - p < 0,0001; стандартный two-way ANOVA с применением критерия множественных сравнений Данна.
*
*
*
*
**
ние в конструкцию CAR-рецептора костимулирующих доменов, таких как OX40, 4-1ВВ и/или CD28, приводит к повышению выживаемости и персистенции CAR-Т-клеток [7]. Ранее было подтверждено, что домен 4-1ВВ связан с повышенной персистенцией CAR-T-лимфоцитов, в то время как включение домена CD28 в конструкцию CAR-рецептора усиливает их цитоток-сические функции [18]. Кроме того, было обнаружено, что CAR-Т-клетки с костимулирующим доменом CD28 обладают повышенной секрецией цитокинов ИФН-у, ФНОа и ИЛ-2 по сравнению с Т-лимфоцитами, экспрессирующими домен 4-1ВВ [19].
В настоящем исследовании для трансдукции Т-клеток использовалась CAR-конструкция c включением последовательности, кодирующей GITRL. Фенотип трансдуцированных клеток характеризовался высоким содержанием менее дифференцированных клеток. Кроме того, доля клеток, экспрессирующих TIM-3 и PD-1, оставалась незначительной. Подобно 4-1ВВ и OX40, GITR представляет собой костимули-рующий домен, который способствует пролиферации и продукции цитокинов активированными Т-клетками, повышает их эффекторную функцию путем снижения специфической чувствительности к супрессии, а также ингибирования активности Т-регуляторных клеток [20]. Встраивание в конструкцию CAR-рецептора последовательности GITRL предполагает самоподдержание CART- клеточной популяции за счет повышенной экспрессии GITRL на Т-клетках, тем самым увеличивая их актив-
ность и персистенцию. Результаты показали низкую долю истощенных трансдуцированных клеток с фенотипом TIM-3+PD-1+, что, в свою очередь, позволяет сделать предположение об увеличении противоопухолевой активности полученных генно-модифицированных Т-лимфоцитов, в том числе за счет низкого потенциала к раннему Т-клеточному истощению [21].
Среди трансдуцированных клеток также отмечается большая доля клеток, несущих маркеры CD69 и 4-1ВВ. Наличие данных маркеров может говорить о ранней активации T-клеток и их способности к продолжительной персистенции и пролиферации [7, 22, 23].
Совместное культивирование трансдуцированных Т-лимфоцитов и клеточных опухолевых линий, несущих антиген GD2, продемонстрировало значительную цитотоксическую эффективность по сравнению с культивированием нетрансдуцированных клеток с клетками-мишенями, что говорит об антиген-специфичной активности полученных GD2-специфичных CAR-T-лимфоцитов. Данный эффект подтверждается как анализом высвобождения ЛДГ, так и с помощью проточной цитометрии. Однако, если сравнивать количественные показатели экспрессии клеточных маркеров на трансдуцированных клетках, можно говорить только о тенденции к повышению экспрессии CD40L и FasL, которые являются модуляторами активации различных иммунных клеток (В-клеток, Т-клеток, дендритных клеток и др.) и вызывает Fas-опосредованную гибель опухолевых клеток соответственно [24, 25].
Тем не менее взаимодействие Fas-FasL представляет собой лишь альтернативный путь элиминации опухоли, потому что основной цитотоксический эффект CAR-T-клеток осуществляется за счет высвобождения перфо-рина и гранзима [26]. Кроме того, противоопухолевую активность трансдуцированных клеток можно проследить при анализе секреции противовоспалительных цитокинов при сокультивировании с GD2-позитивными клеточными линиями, в частности ИФН-у и ФНОа.
Заключение
В ходе проведенного исследования была проведена оценка in vitro цитотоксической активности GD2-специфических CAR-T-лимфоцитов в отношении опухолевой клеточной линии S6, несущей целевой антиген GD2, а также оценка особенностей фенотипа полученных трансдуцированных клеток. Различные функциональные тесты in vitro подтвердили не только опухоль-специфическую цитотоксичность, но и нали-
чие маркеров, характерных для ранней активации, что способствует повышенной противоопухолевой активности. Большая доля трансдуцированных клеток обладала фенотипом менее дифференцированной популяции, и лишь небольшое количество трансдуцированных лимфоцитов несли маркеры активации и истощения, что является основными факторами, которые зачастую являются решающими в вопросах эффективности CAR-Т-терапии. Усиление цитотоксической активности полученных генно-модифицированных Т-лимфоцитов можно объяснить включением GITRL в конструкцию CAR-рецептора. Полученные результаты указывают на применимость и перспективность используемой конструкции для получения in vitro жизнеспособных популяций GD2-специфичных CAR-T-лимфоцитов, обладающих противоопухолевым цитотоксическим потенциалом для дальнейшей разработки клинически эффективной технологии CAR-T-клеточной иммунотерапии GD2-позитивных опухолей.
■ Литература
1. Oldham R.A.A., Medin J.A. Practical considerations for chimeric antigen receptor design and delivery. Expert Opin. Biol. Ther. 2017; 17 (8): 961-78. DOI: https://doi.org/10.1080/14712598.2017.1339687
2. Sadelain M., Brentjens R., Riviere I. The basic principles of chimeric antigen receptor (CAR) design. Cancer Discov. 2013; 3 (4): 388-98. DOI: https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-12-0548
3. Kochenderfer J.N., Wilson W.H., Janik J.E., Dudley M.E., Stetler-Stevenson M., Feldman S.A., Maric I., Raffeld M., Nathan D.A., Lanier B.J., Morgan R.A., Rosenberg S.A. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 2010; 116 (20): 4099-102. DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2010-04-281931
4. Porter D.L., Levine B.L., Kalos M., Bagg A., June C.H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N. Engl. J. Med. 2011; 365 (8): 725-33. DOI: https://doi.org/10.1056/ NEJMoa1103849
5. Zhang L.N., Song Y., Liu D. CD19 CAR-T cell therapy for relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia: factors affecting toxicities and long-term efficacies. J. Hematol. Oncol. 2018; 11 (1): 41. DOI: https:// doi.org/10.1186/s13045-018-0593-5
6. Zhang H., Ye Z.L., Yuan Z.G., Luo Z.Q., Jin H.J., Qian Q.J. New strategies for the treatment of solid tumors with CAR-T cells. Int. J. Biol. Sci. 2016; 12 (6): 718-29. DOI: https://doi.org/10.7150/ijbs.14405
7. Long A.H., Haso W.M., Shern J.F., Wanhainen K.M., Murgai M., Ingaramo M., Smith J.P., Walker A.J., Kohler M.E., Venkateshwara V.R., Kaplan R.N., Patterson G.H., Fry T.J., Orentas R.J., Mackall C.L. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nat. Med. 2015; 21 (6): 581-90. DOI: https:// doi.org/10.1038/nm.3838
8. Киселевский М.В., Чикилева И.О., Ситдикова С.М., Вла-сенко Р.Я., Караулов А.В. Перспективы применения генетически модифицированных лимфоцитов с химерным Т-клеточным рецептором (CAR-T-клеток) для терапии солидных опухолей. Иммунология. 2019; 40 (4): 48-55. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-14006
9. Suzuki M., Cheung N.K. Disialoganglioside GD2 as a therapeutic target for human diseases. Expert Opin. Ther. Targets. 2015; 19 (3): 349-62. DOI: https://doi.org/10.1517/14728222.2014.986459
10. Nazha B., Inal C., Owonikoko T.K. Disialoganglioside GD2 expression in solid tumors and role as a target for cancer therapy. Front. Oncol. 2020; 10: 1000. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2020. 01000
11. Keyel M.E., Reynolds C.P. Spotlight on dinutuximab in the treatment of high-risk neuroblastoma: development and place in therapy. Biol. Targets Ther. 2019; 13: 1-12. DOI: https://doi.org/10.2147/BTT. S114530
12. Savoldo B., Ramos C.A., Liu E., Mims M.P., Keating M.J., Car-rum G., Kamble R.T., Bollard C.M., Gee A.P., Mei Z., Liu H., Grilley B., Rooney C.M., Heslop H.E., Brenner M.K., Dotti G. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 2011; 121 (5): 1822-6. DOI: https://doi.org/10.1172/JCI46110
13. Ronchetti S., Nocentini G., Bianchini R., Krausz L.T., Migliorati G., Riccardi C. Glucocorticoid-induced TNFR-related protein lowers the threshold of CD28 costimulation in CD8+ T cells. J. Immunol. 2007; 179 (9): 5916-26. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.179.9.5916
14. Ko K., Yamazaki S., Nakamura K., Nishioka T., Hirota K., Ya-maguchi T., Shimizu J., Nomura T., Chiba T., Sakaguchi S. Treatment of advanced tumors with agonistic anti-GITR mAb and its effects on tumor-infiltrating Foxp3+CD25+CD4+ regulatory T cells. J. Exp. Med. 2005; 202 (7): 885-91. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.20050940
15. Golubovskaya V. M., Berahovich R., Xu Q., Zhou H., Xu S., Guan J., Harto H., Li L., Wu L. GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer. Front. Biosci. (Landmark ed.). 2018; 23 (12): 2245-54. DOI: https://doi.org/10.2741/4703
16. Ohmi Y., Kambe M., Ohkawa Y., Hamamura K., Tajima O., Takeuchi R., Furukawa K., Furukawa K. Differential roles of ganglio-sides in malignant properties of melanomas. PLoS One. 2018; 13 (11): e0206881. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206881
17. Golubovskaya V., Wu L. Different subsets of T cells, memory, effector functions, and CAR-T immunotherapy. Cancers. 2016; 8 (3): 36. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers8030036
18. Andersch L., Radke J., Klaus A., Schwiebert S., Winkler A., Schumann E., Grunewald L., Zirngibl F., Flemmig C., Jensen M.C., Rossig C., Joussen A., Henssen A., Eggert A., Schulte J.H., Kunkele A. CD171-and GD2-specific CAR-T cells potently target retinoblastoma cells in pre-clinical in vitro testing. BMC Cancer. 2019; 19 (1): 895. DOI: https://doi. org/10.1186/s12885-019-6131-1
19. Hudecek M., Lupo-Stanghellini M.T., Kosasih P.L., Sommermeyer D., Jensen M.C., Rader C., Riddell S.R. Receptor affinity and extracellular domain modifications affect tumor recognition by ROR1-specific chimeric antigen receptor T cells. Clin. Cancer Res. 2013; 19 (12): 315364. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-13-0330
20. Zhao M., Fu L., Chai Y., Sun M., Li Y., Wang S., Qi J., Zeng B., Kang L., Gao G.F., Tan S. Atypical TNF-TNFR superfamily binding interface in the GITR-GITRL complex for T cell activation. Cell Rep. 2021; 36 (12): 109734. DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021. 109734
21. Yang R., Sun L., Li C.F., Wang Y.H., Yao J., Li H., Yan M., Chang W.C., Hsu J.M., Cha J.H., Hsu J.L., Chou C.W., Sun X., Deng Y., Chou C.K., Yu D., Hung M.C. Galectin-9 interacts with PD-1 and TIM-3
to regulate T cell death and is a target for cancer immunotherapy. Nat. Commun. 2021; 12 (1): 832. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-021-21099-2
22. Bloemberg D., Nguyen T., MacLean S., Zafer A., Gadoury C., Gurnani K., Chattopadhyay A., Ash J., Lippens J., Harcus D., Pagé M., Fortin A., Pon R.A., Gilbert R., Marcil A., Weeratna R.D., McComb S. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2020; 16: 238-54. DOI: https://doi.org/10.1016/j.omtm.2020.01.012
23. Philipson B.I., O'Connor R.S., May M.J., June C.H., Albelda S.M., Milone M.C. 4-1BB costimulation promotes CAR T cell survival through noncanonical NF-kB signaling. Sci. Signal. 2020; 13 (625): eaay8248. DOI: https://doi.org/10.1126/scisignal.aay8248
24. Kuhn N.F., Purdon T.J., van Leeuwen D.G., Lopez A.V., Curran K.J., Daniyan A.F., Brentjens R.J. CD40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 2019; 35 (3): 473-88. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2019.02.006
25. Malarkannan S. Molecular mechanisms of FasL-mediated «re-verse-signaling». Mol. Immunol. 2020; 127: 31-37. DOI: https://doi. org/10.1016/j.molimm.2020.08.010
26. Benmebarek M.R., Karches C.H., Cadilha B.L., Lesch S., Endres S., Kobold S. Killing mechanisms of chimeric antigen receptor (CAR) T cells. Int. J. Mol. Sci. 2019; 20 (6): 1283. DOI: https://doi. org/10.3390/ijms20061283
■ References
1. Oldham R.A.A., Medin J.A. Practical considerations for chimeric antigen receptor design and delivery. Expert Opin. Biol. Ther. 2017; 17 (8): 961-78. DOI: https://doi.org/10.1080/14712598.2017.1339687
2. Sadelain M., Brentjens R., Riviere I. The basic principles of chi-meric antigen receptor (CAR) design. Cancer Discov. 2013; 3 (4): 388-98. DOI: https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-12-0548
3. Kochenderfer J.N., Wilson W.H., Janik J.E., Dudley M.E., Stetler-Stevenson M., Feldman S.A., Maric I., Raffeld M., Nathan D.A., Lanier B.J., Morgan R.A., Rosenberg S.A. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 2010; 116 (20): 4099-102. DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2010-04-281931
4. Porter D.L., Levine B.L., Kalos M., Bagg A., June C.H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N. Engl. J. Med. 2011; 365 (8): 725-33. DOI: https://doi.org/10.1056/ NEJMoa1103849
5. Zhang L.N., Song Y., Liu D. CD19 CAR-T cell therapy for relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia: factors affecting toxicities and long-term efficacies. J. Hematol. Oncol. 2018; 11 (1): 41. DOI: https:// doi.org/10.1186/s13045-018-0593-5
6. Zhang H., Ye Z.L., Yuan Z.G., Luo Z.Q., Jin H.J., Qian Q.J. New strategies for the treatment of solid tumors with CAR-T cells. Int. J. Biol. Sci. 2016; 12 (6): 718-29. DOI: https://doi.org/10.7150/ijbs.14405
7. Long A.H., Haso W.M., Shern J.F., Wanhainen K.M., Murgai M., Ingaramo M., Smith J.P., Walker A.J., Kohler M.E., Venkateshwara V.R., Kaplan R.N., Patterson G.H., Fry T.J., Orentas R.J., Mackall C.L. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nat. Med. 2015; 21 (6): 581-90. DOI: https:// doi.org/10.1038/nm.3838
8. Kiselevsky M.V., Chikileva I.O., Sitdikova S.M., Vlasenko R.Ya., Karaulov A.V. Prospectives of application of the genetically modified lymphocytes with chimeric T-cell receptor (CAR-T-cells) for the therapy of solid tumors. Immunologiya. 2019; 40: 48-55. DOI: https://doi. org/10.24411/0206-4952-2019-14006 (in Russian)
9. Suzuki M., Cheung N.K. Disialoganglioside GD2 as a therapeutic target for human diseases. Expert Opin. Ther. Targets. 2015; 19 (3): 349-62. DOI: https://doi.org/10.1517/14728222.2014.986459
10. Nazha B., Inal C., Owonikoko T.K. Disialoganglioside GD2 expression in solid tumors and role as a target for cancer therapy. Front. Oncol. 2020; 10: 1000. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2020.01000
11. Keyel M.E., Reynolds C.P. Spotlight on dinutuximab in the treatment of high-risk neuroblastoma: development and place in therapy. Biol. Targets Ther. 2019; 13: 1-12. DOI: https://doi.org/10.2147/BTT. S114530
12. Savoldo B., Ramos C.A., Liu E., Mims M.P., Keating M.J., Car-rum G., Kamble R.T., Bollard C.M., Gee A.P., Mei Z., Liu H., Grilley B., Rooney C.M., Heslop H.E., Brenner M.K., Dotti G. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 2011; 121 (5): 1822-6. DOI: https://doi.org/10.1172/JCI46110
13. Ronchetti S., Nocentini G., Bianchini R., Krausz L.T., Miglio-rati G., Riccardi C. Glucocorticoid-induced TNFR-related protein lowers the threshold of CD28 costimulation in CD8+ T cells. J. Immunol. 2007; 179 (9): 5916-26. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.179.9.5916
14. Ko K., Yamazaki S., Nakamura K., Nishioka T., Hirota K., Ya-maguchi T., Shimizu J., Nomura T., Chiba T., Sakaguchi S. Treatment of
advanced tumors with agonistic anti-GITR mAb and its effects on tumor-infiltrating Foxp3+CD25+CD4+ regulatory T cells. J. Exp. Med. 2005; 202 (7): 885-91. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.20050940
15. Golubovskaya V. M., Berahovich R., Xu Q., Zhou H., Xu S., Guan J., Harto H., Li L., Wu L. GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer. Front. Biosci. (Landmark ed.). 2018; 23 (12): 2245-54. DOI: https://doi.org/10.2741/4703
16. Ohmi Y., Kambe M., Ohkawa Y., Hamamura K., Tajima O., Takeuchi R., Furukawa K., Furukawa K. Differential roles of ganglio-sides in malignant properties of melanomas. PLoS One. 2018; 13 (11): e0206881. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206881
17. Golubovskaya V., Wu L. Different subsets of T cells, memory, effector functions, and CAR-T immunotherapy. Cancers. 2016; 8 (3): 36. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers8030036
18. Andersch L., Radke J., Klaus A., Schwiebert S., Winkler A., Schumann E., Grunewald L., Zirngibl F., Flemmig C., Jensen M.C., Rossig C., Joussen A., Henssen A., Eggert A., Schulte J.H., Künkele A. CD171-and GD2-specific CAR-T cells potently target retinoblastoma cells in pre-clinical in vitro testing. BMC Cancer. 2019; 19 (1): 895. DOI: https://doi. org/10.1186/s12885-019-6131-1
19. Hudecek M., Lupo-Stanghellini M.T., Kosasih P.L., Sommermeyer D., Jensen M.C., Rader C., Riddell S.R. Receptor affinity and extracellular domain modifications affect tumor recognition by ROR1-specific chi-meric antigen receptor T cells. Clin. Cancer Res. 2013; 19 (12): 3153-64. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-13-0330
20. Zhao M., Fu L., Chai Y., Sun M., Li Y., Wang S., Qi J., Zeng B., Kang L., Gao G.F., Tan S. Atypical TNF-TNFR superfamily binding interface in the GITR-GITRL complex for T cell activation. Cell Rep. 2021; 36 (12): 109734. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.celrep.2021.109734
21. Yang R., Sun L., Li C.F., Wang Y.H., Yao J., Li H., Yan M., Chang W.C., Hsu J.M., Cha J.H., Hsu J.L., Chou C.W., Sun X., Deng Y., Chou C.K., Yu D., Hung M.C. Galectin-9 interacts with PD-1 and TIM-3 to regulate T cell death and is a target for cancer immunotherapy. Nat. Commun. 2021; 12 (1): 832. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-021-21099-2
22. Bloemberg D., Nguyen T., MacLean S., Zafer A., Gadoury C., Gurnani K., Chattopadhyay A., Ash J., Lippens J., Harcus D., Pagé M., Fortin A., Pon R.A., Gilbert R., Marcil A., Weeratna R.D., McComb S. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2020; 16: 238-54. DOI: https://doi.org/10.1016/j.omtm.2020.01.012
23. Philipson B.I., O'Connor R.S., May M.J., June C.H., Albelda S.M., Milone M.C. 4-1BB costimulation promotes CAR T cell survival through noncanonical NF-kB signaling. Sci. Signal. 2020; 13 (625): eaay8248. DOI: https://doi.org/10.1126/scisignal.aay8248
24. Kuhn N.F., Purdon T.J., van Leeuwen D.G., Lopez A.V., Curran K.J., Daniyan A.F., Brentjens R.J. CD40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 2019; 35 (3): 473-88. DOI: https://doi. org/10.1016/j.ccell.2019.02.006
25. Malarkannan S. Molecular mechanisms of FasL-mediated «re-verse-signaling». Mol. Immunol. 2020; 127: 31-37. DOI: https://doi. org/10.1016/j.molimm.2020.08.010
26. Benmebarek M.R., Karches C.H., Cadilha B.L., Lesch S., Endres S., Kobold S. Killing mechanisms of chimeric antigen receptor (CAR) T cells. Int. J. Mol. Sci. 2019; 20 (6): 1283. DOI: https://doi. org/10.3390/ijms20061283
Сведения об авторах
Филиппова Юлия Григорьевна - лаборант-исследователь лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: airyuka@mail.ru http://orcid.org/0000-0002-1158-887X
Кузнецова Мария Сергеевна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: maria.kuz17.03@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-9834-9328
Шевченко Юлия Александровна - канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: shevcen@ngs.ru http://orcid.org/0000-0001-8773-0599
Терещенко Валерий Павлович - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: tervp91@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-1620-6447
Фишер Марина Сергеевна - мл. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: msolshanova@gmail.com http://orcid.org/0000-0001-6261-7557
Курилин Василий Васильевич - канд. мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: 2221910@ngs.ru http://orcid.org/0000-0002-5617-0450
Пашкина Екатерина Александровна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. клинической иммунопатологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: pashkina.e.a@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-4912-5512
Акахори Ясуши - PhD, доцент каф. иммунной генной терапии, Университет Миэ, Цу, Япония E-mail: yakahori@med.mie-u.ac.jp
Шику Хироши - MD, PhD, зав. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация; проф. каф. иммунной генной терапии, Университет Миэ, Цу, Япония E-mail: shiku@med.mie-u.ac.jp http://orcid.org/0000-0002-0362-755X
Сенников Сергей Витальевич - д-р мед. наук, проф., зав. лаб. молекулярной иммунологии, гл. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобр-науки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: sennikovsv@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Authors' information
Julia G. Philippova - Research Assistant of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: airyuka@mail.ru http://orcid.org/0000-0002-1158-887X
Maria S. Kuznetsova - PhD, Senior Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: maria.kuz17.03@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-9834-9328
Julia A. Shevchenko - PhD, Leader Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: shevcen@ngs.ru http://orcid.org/0000-0001-8773-0599
Valeriy P. Tereshchenko - PhD, Senior Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: tervp91@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-1620-6447
Marina S. Fisher - Junior Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: msolshanova@gmail.com http://orcid.org/0000-0001-6261-7557
Vasiliy V. Kurilin - PhD, Leader Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: 2221910@ngs.ru http://orcid.org/0000-0002-5617-0450
Ekaterina A. Pashkina - PhD, Senior Researcher of Clinical Immunopathology Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: pashkina.e.a@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-4912-5512
Yasushi Akahori - PhD, Assistant Prof. of Immuno-gene Therapy Dept., Mie University, Tsu, Japan E-mail: yakahori@med.mie-u.ac.jp
Hiroshi Shiku - MD, PhD, Head of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation; Prof. of Immuno-gene Therapy Dept., Mie University, Tsu, Japan E-mail: shiku@med.mie-u.ac.jp http://orcid.org/0000-0002-0362-755X
Sergey V. Sennikov - MD, PhD, Prof., Head of Molecular Immunology Lab., Chief Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: sennikovsv@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
