CC BY
23
© Коллектив авторов, 2020
Терещенко В.П.1, Булыгин А.С.1, Заводский Р.Ю.2, Куликова Е.В.1, Сенников С.В.1' 3
Получение дендритных клеток мышей in vitro с помощью Flt3-L и их характеристика
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 630099, г. Новосибирск, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 630091, г. Новосибирск, Российская Федерация
3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 630090, г. Новосибирск, Российская Федерация
Резюме
Введение. В настоящее время для модуляции адаптивного иммунного ответа с целью коррекции тех или иных заболеваний человека активно разрабатываются клеточные вакцины на основе миелоидных дендритных клеток (мДК). Однако об эффективности применения плазмацитоидных дендритных клеток (пДК) в тех же целях все еще мало данных.
Цель исследования - разработка протокола получения пДК мышей с помощью ре-комбинантного Flt3-L in vitro и описание фенотипических и функциональных свойств полученных дендритных клеток (ДК) для решения вопроса о возможности их использования при создании клеточных вакцин.
Материал и методы. ДК получали путем культивирования клеток костного мозга мышей в присутствии Flt3-L. Относительное количество и фенотип ДК оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии, а морфологию ДК - с помощью флуоресцентной микроскопии. Функциональные свойства ДК изучали по их способности индуцировать Трег-клетки и пролиферацию СБ4+-лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов. Экспрессию рецептора хемотаксиса CCR9 на ДК оценивали с помощью проточной ци-тофлуориметрии.
Результаты. Показано, что c помощью Flt3-L из клеток костного мозга мышей возможно in vitro получение культур ДК с относительно высоким содержанием B220+CD11c+-пДК и Sirpa+CD11с+-мДК. B220+CD11c+-пДК и Sirpa+CD11c+-мДК в полученных культурах отличались морфологией и степенью зрелости. В смешанной культуре лимфоцитов полученные in vitro ДК, обладали свойствами незрелых ДК, что проявлялось в их способности генерировать повышенное количество Трег и вызывать сниженную пролиферацию CD4+-лимфоцитов. При стимуляции полученных ДК с помощью CpG ДНК наблюдалось их созревание, и снижение способности к индукции Трег и увеличение способности к индукции пролиферации CD4+-лимфоцитов, т. е. приобретение иммуногенной функции. Относительно небольшое количество B220+CD11c+-пДК и Sirpa+CD11c+-мДК несли на поверхности рецептор хемотаксиса CCR9, однако количество B220+CD11c+-пДК и Sirpa+CD11c+-мДК, несущих CCR9 внутриклеточно, стремилось к 100 %.
Заключение. Таким образом, с помощью Flt3-L из клеток костного мозга мышей возможно in vitro получение культур B220+CD11c+-пДК и Sirpa+CD11c+-мДК, пригодных к применению при разработке клеточных вакцин для подавления нежелательного адаптивного иммунного ответа и для индукции желательного.
Ключевые слова: Flt3-L; плазмацитоидные дендритные клетки; миелоидные дендритные клетки; CCR9
Статья поступила 03.03.2020. Принята в печать 16.04.2020.
Для цитирования: Терещенко В.П., Булыгин А.С., Заводский Р.Ю., Куликова Е.В., Сенников С.В. Получение дендритных клеток мышей in vitro с помощью Flt3-L и их характеристика. Иммунология. 2020; 41 (3): 215-226. DOI: 10.33029/0206-4952-2020-41-3-215-226
Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16-1500086).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для корреспонденции
Сенников Сергей Витальевич -доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: sennikovsv@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Tereshchenko V.P.1, Bulygin A.S.1, Zavodskii R.Yu.2, Kulikova E.V.1, Sennikov S.V.1' 3
Generation of murine dendritic cells in vitro using Flt3-L and their characteristics
1 Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology, Ministry of Science and High Education of Russian Federation, 630099, Novosibirsk, Russian Federation
2 Novosibirsk State Medical University of the Ministry of Healthcare of Russian Federation, 630091, Novosibirsk, Russian Federation
3 Novosibirsk State University, 630090, Novosibirsk, Russian Federation
Abstract
Introduction. Currently, cell vaccines based on myeloid dendritic cells (mDCs) are being
actively developed to modulate an adaptive immune response in order to correct certain human
diseases. However, there is still little data on the effectiveness of the use of plasmacytoid
dendritic cells (pDCs) for the same purposes.
Aim of the study. Development of the protocol for in vitro generation of mice pDCs using
recombinant Flt3-L and description of the phenotypic and functional properties of the obtained
dendritic cells (DCs) to address the possibility of their use in the development of cell vaccines. E-mail: sennik°vsv@gmail.c°m
. Af u „ p,.,, t https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Material and methods. DCs were generated from mouse bone marrow cells using Flt3-L.
Frequency and phenotype of the DCs were assessed by flow cytometry. DC's morphology was
assessed using fluorescent microscopy. Treg frequency and CD4+-lymphocytes proliferation
induced by DCs were assessed in mixed lymphocyte culture. The expression of CCR9 on DCs
was assessed using flow cytometry.
Results. It was shown that the use of Flt3-L provides in vitro generation of bone marrow-
derived cultures with a relatively high content of B220+CD11c+-pDCs and Sirpa+CD11c+-
mDCs. The B220+CD11c+-pDCs and the Sirpa+CD11c+-mDCs obtained differed in morphology
and degree of maturity. In a mixed lymphocytes culture, the dendritic cells were able to
generate an increased amount of Treg and cause a reduced proliferation of CD4+-lymphocytes,
thus manifesting an immature phenotype. Further maturation of the DCs via CpG DNA
stimulation led to an increased immunogenicity, according the Treg reduction and enhanced
CD4+-lymphocytes proliferation in mixed lymphocytes culture. We found that a relatively
small number of B220+CD11c+-pDCs and Sirpa+CD11c+-mDCs carried the CCR9 chemotaxis
receptor on their surface, however, the number of B220+CD11c+-pDCs and the Sirpa+CD11c+-
mDCs carrying intracellular CCR9 tended to 100 %. Thus, the use of Flt3-L provides the
opportunity of in vitro generation of B220+CD11c+ pDCs and Sirpa+CD11c+-mDCs that can
be useful in the field of cell vaccine development to direct an adaptive immune response
decreasing undesirable immune reactions or increasing desirable.
Keywords: Flt3-L; plasmacytoid dendritic cells; myeloid dendritic cells; CCR9
Received 03.03.2020. Accepted 16.04.2020.
For citation: Tereshchenko V.P., Bulygin A.S., Zavodskii R.Yu., Kulikova E.V., Sennikov S.V. Generation of murine dendritic cells in vitro using Flt3-L and their characteristics. Immunologiya. 2019; 41(3): 215-26. DOI: 10.33029/ 0206-4952-2020-41-3-215-226 (in Russian)
Funding. The research was supported by the grant of the Russian Science Foundation (project no.16-15-00086). Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
For correspondence
Sergey V. Sennikov -MD, PhD, Professor, Head of Laboratory of molecular immunology RIFCI, Novosibirsk, Russian Federation
Введение
В настоящее время для коррекции тех или иных заболеваний человека активно разрабатываются подходы к модуляции адаптивного иммунного ответа с помощью дендритных клеток (ДК). Так, ДК предложено использовать для индукции противоопухолевого иммунного ответа [1, 2], подавления патологического иммунного ответа при аутоиммунных заболеваниях [3-5] и супрессии
трансплантационных реакций, таких как реакция отторжения [6] и реакция «трансплантат против хозяина» [7].
Однако для всех этих целей применяют миелоидные ДК (мДК), полученные из моноцитов периферической крови человека или костного мозга мышей с помощью ГМ-КСФ. При этом свойства и эффективность плазма-цитоидных ДК (пДК) в тех же моделях остаются малоизученными.
Применение пДК может быть особенно целесообразно при необходимости индукции иммунной толерантности, т. е. подавления нежелательного иммунного ответа, поскольку показано активное участие незрелых Б220+СБ11с+-пДК в негативной селекции тимоцитов и поддержании центральной иммунной толерантности. Так, незрелые Б220+СБ11с+-пДК захватывают в периферических тканях собственные антигены и под действием сигналов рецептора хемотаксиса CCR9 мигрируют в тимус, где, представляя захваченные антигены развивающимся тимоцитам, обеспечивают процесс негативной селекции и поддержание центральной иммунной толерантности к собственным антигенам [8].
Б220+СБ11с+-пДК могут быть получены с помощью Flt3-L - фактора роста ДК. In vivo получение пДК осуществляется с помощью введения лабораторным животным клеточной линии, экспрессирующей Flt3-L, и последующего выделения Б220+СБ11с+-пДК из лим-фоидных органов животного [9-12]. Данный метод позволяет генерировать in vivo незрелые пДК с фенотипом, не отличающимся от фенотипа пДК, полученных в физиологичных условиях [9]. Однако в результате данного способа получают относительно небольшие количества Б220+СБ11с+-пДК (около 15 % от всех СБ11с+-ДК, при-
сутствующих в лимфоидных органах [11]), чего может быть недостаточно для реализации клеточных технологий модуляции иммунного ответа. Более того, данный способ - введение реципиенту FltS-L-продуцирующих клеточных линий - не может быть применен для человека при трансляции подобных технологий в клиническую практику.
Альтернативой является генерация B220+CD11c+-пДК с помощью рекомбинантного Flt3-L in vitro. Так, B220+CD11c+-пДК получают при культивировании отсортированных предшественников ДК [13, 14] или костного мозга мышей [15, 16] в присутствии различных доз рекомбинантного Flt3-L. Однако функциональные и фенотипические свойства генерируемых in vitro B220+CD11c+-пДК, а также экспрессия ими CCR9, отражающего способность клеток мигрировать к источнику его лиганда CCL25 (например, в тимус) [9, 17], слабо охарактеризованы.
Таким образом, для решения вопроса о возможности использованияB220+CD11c+-пДК,индуцированныхin vitro с помощью рекомбинантного Flt3-L, для модуляции иммунного ответа требуется отработать протокол получения достаточного количества ДК и охарактеризовать фенотипические и функциональные свойства получаемых ДК, что и стало целью данного исследования.
0
3-|
g 2
1-
Выход при посадке 106 клеток КМ
I
Сутки
8070-
us
S 60-
* 40« 3°-
о
чо 2010 0
CDllc-ДК
\Ь
Сутки
35 -|
30-
>Я
и
т 25-
О
С О 20-
X
и о 15-
2
т
С 10-
5-
0-
Б220+СШ1с+-пДК
i
Сутки
30 п
3 20
ю с
10-
81гра+СШ1с+-мДК
i
i
ifl
Сутки
i
□ 100 нг/мл Flt3-L
□ 200 нг/мл Flt3-L
Рис. 1. Культуры дендритных клеток (ДК) на 5, 7 или 9-е сутки, полученные с помощью 100 или 200 нг/мл ШЗ-Ь А - абсолютное количество получаемых клеток при посадке 106 клеток костного мозга (КМ); Б - относительное количество полученных СБ11с+-ДК в культуре; В - относительное количество полученных Б220+СВ11с+-пДК в культуре; Г - относительное количество полученных Б1гра+СВ11с+-мДК в культуре; п = 6. Здесь и на рис. 4, 5 скобками указаны статистически значимые отличия (двухфакторный дисперсионный анализ с множественными сравнениями Тьюки, р < 0,05).
«= 50
0
9
0
9
2501
200
< 150 О Й 100
50
0
250^
200
< 150 О Й 100
50
0-
50 100 150 200 250 FSC-A х1000
5-100 7d - All Events
DC
0
50 100 150 200 250
FSC-A х1000
80 и
IS
я
60-
ю
12
40-
ffl
ё 20-
V©
rfi
□ 0d (KM) T □ 7d (Flt3-L)
xC
0
х1000 250т
200
-A150
C
% 100 50 0J
4 0d - DC
CD11c
0 -103 0 103
104 10
,5
0
х1000 250n
200
-A150
C S
и 100 50 0
CD11c PE-Cy7-A 5-100 7d - DC
CD11c
0 -103 0 10:
104
105
CD11c PE-Cy7-A
4 0d - CD11c
B220
0-103 0 103 104 105 B220 V500-A
y
-C PC
s-<D
P
s &
0
-105
-104-
-103
03
B220
0-103 0 103
10
,4
105
B220 V500-A
Рис. 2. Содержание Б220+СБ11с+-пДК и 8ира+СВ11с+-мДК в костном мозге мышей и культурах дендритных клеток (ДК), полученных с помощью т3-Ь за 7 сут
А - относительные количества ДК в костном мозге (0ф и культурах, полученных с помощью ЕН3-Ь за 7 сут, п = 6. Скобками указаны достоверные отличия тест, р < 0,05); Б - пример цитофлуориметрии ДК костного мозга; В - пример цитофлуориме-трии ДК, полученных с помощью ЕЫ3-Ь к 7-м суткам.
0
0
+
+
Материал и методы
Лабораторные животные. В исследовании использовали самцов мышей C57BL/6 и BALB/c в возрасте 2-6 мес. Мышей содержали в виварии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России в условиях естественного освещения и неограниченного доступа к еде и воде.
Получение культур дендритных клеток. Клетки костного мозга выделяли из бедренных костей мышей С57В1/6 промыванием костномозгового канала фос-фатно-солевым буферным раствором (ФСБ). Далее клетки центрифугировали 7 мин при 1500 об/мин, су-пернатант удаляли и клетки ресуспендировали в полной среде RPMI-1640. Клетки высаживали в 24-луночный планшет (TPP, Швейцария) по 1 х 106 клеток на лунку в 1 мл полной среде RPMI-1640. В лунки добавляли F1t3-L (R&D systems, США) в концентрации 100 нг/мл или 200 нг/мл. Половину среды с фактором роста меняли каждые 2-3 сут. Культуры снимали на 5, 7
и 9-е сутки для цитометрического анализа. В экспериментах по анализу фенотипа ДК после созревания, а также в экспериментах смешанной культуры лимфоцитов на последние сутки культивирования к дендритным клеткам добавляли 2 мкг/мл липополисахарида (ЛПС) O55:B5 (Sigma, США) или 6 мкг/мл CpG ODN 1826 ДНК (Invivogen, США).
Смешанная культура лимфоцитов. Смешанную культуру лимфоцитов получали путем сокультивиро-вания ДК мышей С57BL/6 c CD4+-лимфоцитами мышей BALB/c. ДК мышей C57B1/6 получали с помощью культивирования клеток костного мозга в течение 7 сут в присутствии 100 нг/мл F1t3-L c или без добавления ЛПС или CpG ДНК на последние сутки культивирования. CD4+-лимфоциты мышей BALB/c получали путем магнитной сортировки спленоцитов мышей BALB/c с помощью коммерческого набора CD4 MicroBeads mouse (Miltenyi Biotec, США). Чистота сортировки составляла 98-99 %. Половину полученных CD4+-
лимфоцитов метили витальным красителем CFSE путем инкубирования 10-12 млн клеток в 1 мл ФСБ с 5,6 мкг CFSE в течение 10-15 мин c последующей 2-кратной отмывкой в ФСБ с 50 % FCS. ДК мышей C57Bl/6 со-культивировали с CD4+-лимфоцитами мышей BALB/c в соотношении 1:10 в течении 5 сут со сменой У объема среды на 3-и сутки культивирования. Через 5 сут сокультивирования в полученных культурах методом проточной цитометрии оценивали относительное коли -чество CD3+CD4+CD25hlghFoxP3+-Tрег и уровень пролиферации CFSE-меченых CD4+-лимфоцитов.
Цитометрия. Для цитометрического анализа культуры ДК снимали на 5, 7, 9-е сутки культивирования и разводили в концентрации 0,5 млн клеток на 100 мкл полной среды RPMI-1640. Клеточные суспензии метили антителами, коньюгированными с флуорохромами: CD11c - Ре/Су7; B220 - BV510, Sirpa - PercP/Cy5.5; PDCA-1 - BV421; CCR9 - PE; I-A(b) - APC; CD83 -FITC; CD86 - APC/Cy7 (Biolegend, США), 20 мин в темноте при комнатной температуре. Внутриклеточное мечение CCR9 проводили с помощью антитела антиССR9-PE (Biolegend, США) и коммерческого набора для фиксации и пермеабилизации True-Nuclear™ Transcription Factor Staining (Biolegend, США) согласно инструкции производителя. Меченые суспензии клеток отмывали однократно в 2 мл ФСБ с NaN3 и анализировали на проточном цитометре BD FacsVerse (BD, США).
Для оценки относительного количества FoxP3+-Tрег-клеток в смешанной культуре лимфоцитов 0,5 млн клеток полученных культур разводили в 100 мкл полной среды RPMI-1640 и метили антителами к поверхностным антигенам CD3 - BV421, CD4 - PerCP, CD25 -FITC (Biolegend, США). Мечение внутриядерного транскрипционного фактора FoxP3 проводили с помощью антитела анти-FoxP3-PE (Biolegend, США) и коммерческого набора для фиксации и пермеабилиза-ции True-Nuclear™ Transcription Factor Staining (Biolegend, США), согласно инструкции производителя.
Пролиферацию в смешанной культуре лимфоцитов оценивали методом проточной цитометрии по уменьшению флуоресценции CFSE в делящихся клетках.
А
Л
Флуоресцентная микроскопия. Для флуоресцентной микроскопии культуры ДК снимали и метили антителами анти-B220-BV510, анти-Slrpa-PercP/Cy5.5 (Biolegend, США) 20 мин в темноте. Далее клетки отмывали в растворе ФСБ и высаживали в 24-луночные пластиковые планшеты (TPP, Швейцария). Через 4 ч выполняли флуоресцентную микроскопию на аппарате InCell Analyzer 6000 (GE, США).
Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Prism 7.0 (GraphPad Software, США). Согласно тесту Шапиро-Уилка, все исследованные выборки имели нормальное распределение. Значимость различий между выборками оценивали с помощью однофакторного или двухфакторного дисперсионного анализа с множественными сравнениями по Сидаку или Тьюки и t-тестом (конкретный статистический метод указан в подписях к рисункам). Различия сравниваемых параметров считались статистически значимыми при p < 0,05. Значимые отличия проиллюстрированы на рисунках скобками. Данные на гистограммах показывают среднюю и стандартное отклонение.
Результаты
Количество дендритных клеток, получаемых in vitro с помощью Flt3-L
Согласно данным литературы, для получения B220+CD11c+-пДК in vitro применяется культивирование предшественников ДК, отсортированных из костного мозга мышей, в присутствии 100 нг/мл Flt3-L в течение
6-9 сут [13, 14]. Также для получения B220+CD11c+-пДК возможно культивирование клеток костного мозга мышей в присутствии 200 нг/мл Flt3-L в течение
7-9 сут [15, 16]. Поэтому для генерации B220+CD11c+-пДК было решено опробовать протоколы культивирования клеток костного мозга мышей C57Bl/6 в течение 5, 7, 9 дней в присутствии 100 или 200 нг/мл Flt3-L.
Абсолютное количество клеток, генерируемых в культурах под действием 100 и 200 нг/мл Flt3-L, оказалось значимо больше на 7 и 9-е сутки по сравнению с 5-ми сутками (рис. 1 А). Также на 7 и 9-е сутки в куль-
Б
Рис. 3. Микроскопия культур дендритных клеток (ДК), полученных с помощью БЮ-Ь
А - микроскопия в проходящем свете; Б - флуоресцентная микроскопия того же фрагмента; зеленым цветом выделены пДК, меченые анти-Б220-БУ510; красным - мДК, меченые анти-81гра-РвгСР/Су5.5. х20.
Э
150-|
И -
и
100-
50-
Э
и -
и
60-,
40-
20-
[fl
I-Ab+
7
Сутки CD86+
¿1
7
Сутки
I-1
гЯ-
э
и
с
и
И с
и
-
и
И S
20 п
15-
И 10-
5-
150—1
100 -
50-
f
CD83+
-7
7
Сутки
PDCA-1+
7
Сутки
i
Рис. 4. Фенотип B220+CD11c+-пДК и Sirpa+CD11c+-мДК, полученных in vitro с помощью 100 нг/мл F1t3-L Относительное количество клеток, несущих: I-Ab (MHCII) (А), CD83 (Б), CD86 (В); PDCA-1 (Г); n = 6.
0
0
9
9
0
0
9
9
□ Sirpa+'мДК
□ В220+-пДК
турах наблюдалось значимо большее относительное количество CD11c+-ДК и B220+CD11c+-пДК по сравнению с 5-ми сутками (рис. 1Б, В). Под действием F1t3-L в культурах также наблюдалась генерация Sirpa+CD11c+-мДК в количествах, сопоставимых с количеством B220+CD11c+-пДК (рис. 1Г).
Две выбранные дозы F1t3-L не отличались значимо в своей способности генерировать изучаемые виды ДК в культурах. Также количества всех изучаемых видов ДК значимо не отличались на 7 и 9-е сутки культивирования при использовании обеих выбранных доз F1t3-L (см. рис. 1).
Для определения целесообразности генерации B220+CD11c+-пДК in vitro с помощью F1t3-L было изучено количество ДК в костном мозге мышей сразу после его выделения. Относительные количества CD!^-,^, B220+CD11c+-пДК и Sirpa+CD11c+-мДК в костном мозге оказались значимо меньшими по сравнению с относительными количествами аналогичных ДК, генерируемых in vitro с помощью F1t3-L к 7-м суткам (рис. 2А). Пример цитофлуориметрии ДК костного мозга и культур ДК, полученных с помощью F1t3-L представлен на рис. 2 (Б, В).
Морфология и фенотип дендритных клеток, полученных in vitro с помощью Flt3-L
Морфологически B220+CD11c+-пДК имели округлую или неправильную округлую форму с единичными
мелкими отростками (рис. 3). 81гра+СБПс+-мДК являлись более крупными клетками с фибробластоподобной морфологией (см. рис. 3).
Относительные количества Б220+СБПс+-пДК и 81гра+СБПс+-мДК, экспрессирующих на своей поверхности 1-АЬ (МНС II), СБ83 и СБ86, увеличивались с возрастанием сроков культивирования (рис. 4А-В). При этом экспрессия данных молекул обнаруживалась на значимо большем количестве 81гра+СБПс+-мДК по сравнению с Б220+СБПс+-пДК на всех исследуемых сроках культивирования. Экспрессия специфичного для пДК маркера РБСА-1 наблюдалась на большинстве Б220+СБПс+-пДК и 81гра+СБПс+-мДК на всех исследуемых сроках культивирования (рис. 4Г). Описанная картина наблюдалась при использовании обеих выбранных доз БЮ-Ь. При этом фенотип ДК, полученных с помощью 100 и 200 нг/мл РЮ-Ь, значимо не отличался.
По сравнению с ДК, полученными в культурах, значимо меньшее количество Б220+СБПс+-пДК и 81гра+СБПс+-мДК костного мозга экспрессировали 1-АЬ (МНС II) (рис. 5). Также относительное количество РБСА-1+81гра+СБПс+-мДК костного мозга оказалось значительно ниже по сравнению с относительным количеством РБСА-1+Б220+СБ11с+-пДК костного мозга и РБСА-1+81гра+СБ11с+-мДК, полученных в культурах (см. рис. 5).
При стимуляции полученных культур ДК ЛПС или Срв ДНК значимо увеличивалось относительное ко-
личество B220+CD11c+-пДК и Sirpa+CD11c+-мДК экс-прессирующих CD83 и СD86, при этом относительное количество I-Ab+Sirpa+CD11c+-мДК значимо снижалось (см. рис. 5). Аналогичный характер ответа на стимуляцию демонстрировали и ДК костного мозга. Но также при стимуляции ДК костного мозга ЛПС или CpG ДНК происходило значимое увеличение относительного количества I-Ab+B220+CD11c+-пДК и PDCA-1+Sirpa+CD11c+-мДК и снижение PDCA-1+ B220+CD11c+-пДК (см. рис. 5).
Функциональные свойства дендритных клеток, полученных in vitro с помощью Flt3-L
В смешанной культуре лимфоцитов ДК, полученные за 7 сут с помощью 100 нг/мл Flt3-L, вызывали генерацию значимо большего количества СD25highFoxP3+-Трег и значимо меньшего количества пролифериру-ющих CD4+-лимфоцитов по сравнению с культурами ДК, стимулированными CpG ДНК и по сравнению с количествами аналогичных клеток, присутствующих в CD4+-лимфоцитах, нестимулированных ДК (рис. 6). При этом нестимулированные культуры ДК и культуры, стимулированные ЛПС, не отличались значимо в своей способности генерировать Трег и индуцировать пролиферацию CD4+-лимфоцитов.
Характеристика экспрессии CCR9 на дендритных клетках костного мозга и дендритных клетках, полученных in vitro с помощью Flt3-L
Относительно небольшое количество B220+CD11c+-пДК и Sirpa+CD11c+-мДК свежевыделенного костного мозга и полученных 7-дневных культур имели на своей поверхности CCR9 (рис. 7А). Также средняя геометрическая интенсивности флуоресценции ССR9,
меченного антителом, на данных клетках принимала относительно низкие значения (рис. 7Б). Однако было отмечено, что через сутки после забора костного мозга в культурах значимо увеличивалось относительное количество Б220+СБ11с+-пДК и 81гра+СБ11с+-мДК, несущих на своей поверхности ССЯ9. При этом количество ССК9+Б220+СБ11с+-пДК на 1-е сутки культивирования оказалось значимо больше по сравнению с количеством ССЯ9+ 81гра+СБ11с+-мДК (рис. 7А). Средняя геометрическая интенсивности флуоресценции ССЯ9, меченного антителом, проявляла аналогичный характер изменений на 1-е сутки культивирования (рис. 7Б). Пример цито-метрии поверхностного ССЯ9 на Б220+СБ11с+-пДК и 81гра+СВ11с+-мДК на 0, 1 и 7-е сутки культивирования приведен на рис. 7 (В-Д).
Также было выявлено, что на всех сроках культивирования ССЯ9 локализуется преимущественно внут-риклеточно, что проявлялось в относительно высоком количестве Б220+СБ11с+-пДК и 81гра+СБ11с+-мДК, позитивных по ССЯ9 при внутриклеточном окрашивании, а также в относительно высоких значениях средней геометрической интенсивности флуоресценции ССЯ9, меченого внутриклеточно (рис. 8А, Б). При этом количество 81гра+СБ11с+-мДК, несущих ССЯ9 внутрикле-точно, а также средняя геометрическая интенсивности флуоресценции ССЯ9, меченого внутриклеточно, в 81гра+СБ11с+-мДК возрастали с увеличением сроков культивирования. Количество Б220+СБ11с+-пДК, несущих ССЯ9 внутриклеточно, на всех исследуемых сроках стремилось к 100%. Средняя геометрическая интенсивности флуоресценции внутриклеточно меченого ССЯ9 в Б220+СБ11с+-пДК на 1 и 7-е сутки культивирования
100
и
с
И S
50
i-1
1
J3
I-1 Г"
Ш
J
л^ ^ л^ ^ л1" ^ л1" ^ л^ ^ л1" ^ л1" ^ л1" ^
х#х#х/х/ сЛ Л eft сЛ oto ato о!р q!p \ \ ,\ ,\
d> <9 <9 лУ л? л?
V* ^ V* V*
□ Без стимуляции □ ЛПС □ СрG ДНК
Рис. 5. Фенотип Б220+СБ11с+-пДК и 8гтра+СБ11с+-мДК костного мозга (0-й день) и полученных культур (7-й день), нестимулированных или стимулированных липополисахаридом (ЛПС) или СрО ДНК, п = 6
0
Э
с
о
5 -I
4-
3 -
8 2
1 -
СD25highFoxP3+-Трег
—I-1-1-г
CD4 Flt3 ЛПС CpG ДНК
Э
60
м 40
us
20
Пролиферация CD4+-лимфоцитов
CD4 Flt3
Ш
ЛПС CpG ДНК
Рис. 6. Генерация СБ25Ы81гРохР3+-Трег (А) и пролиферация СБ4+-лимфоцитов (Б) в смешанных культурах СБ4+-лимфоцитов мышей БЛЬБ/е и дендритных клеток (ДК) мышей С57Б1/6, полученных с помощью И3-Ь
ЛПС - липополисахарид. Скобками указаны статистически значимые отличия (однофакторный дисперсионный анализ с множественными сравнениями Тьюки, р < 0,05), п = 6.
0
0
достигала максимальных из наблюдаемых во всем эксперименте значений (рис. 8А, Б). Примеры цитометрии внутриклеточно локализованного CCR9 приведены на рис. 8В-Д.
Добавление к свежевыделенным клеткам костного мозга CCL25 - лиганда CCR9 - в дозировках 20, 40, 80, 160 нг/мл значимо не влияло на относительное количество B220+CD11c+-nflK и Sirpa+CD11с+-мДК, несущих CCR9 поверхностно и внутриклеточно после 1-х суток культивирования, и на среднюю геометрическую интенсивности флуоресценции CCR9, меченого поверхностно и внутриклеточно (рис. 9).
Обсуждение
В настоящем исследовании был отработан протокол получения B220+CD11c+-пДК с помощью Flt3-L in vitro, а также проведена фенотипическая и функциональная характеристика полученных клеток для решения вопроса о возможности их использования при разработке клеточных технологий модуляции иммунного ответа.
Результаты показали, что культивирование клеток костного мозга мышей в присутствии Flt3-L в течение 7 сут приводит к почти двукратному увеличению абсолютного количества клеток в культурах (см. рис. 1А). При этом около 25 % из всех полученных клеток в культурах составляли B220+CD11c+-пДK (см. рис. 1В), что больше, чем относительное количество B220+CD11c+-пДК, присутствующее в лимфоидных органах мышей, стимулированных Flt3-L-продуцирующей клеточной линией (15 %) [11] и больше, чем относительное количество B220+CD11c+-пДК, присутствующее в костном мозге мышей в физиологических условиях (см. рис. 2А).
В присутствии Flt3-L к 7-м суткам в культурах клеток костного мозга также генерировалось значимое количество (около 20 % от общего количества клеток в культурах, см. рис. 1Г) Sirpa+CD11c+-мДК. Поскольку мДК в современных исследованиях генерируют в ос-
новном с помощью ГМ-КСФ [1-7] и, таким образом, свойства мДК, полученных in vitro с помощью Flt3-L, также слабо изучены, полученные Sirpa+CD11c+-мДК были включены в дальнейший анализ.
Используемые в проведенном исследовании дозы Flt3-L в 100 и 200 нг/мл не отличались значимо в своей способности генерировать какой-либо вид ДК в культурах клеток костного мозга (см. рис. 1), что позволяет снизить предложенную в некоторых источниках литературы дозу Flt3-L в 200 нг/мл [15, 16] для генерации ДК из клеток костного мозга.
B220+CD11c+^K и Sirpa+CDHc+^flK, полученные с помощью Flt3-L, обладали различной морфологией. Так, B220+CD11c+-пДК имели круглую или неправильную округлую форму с единичными мелкими дендритными отростками, в то время как Sirpa+CD!^^,^ являлись более крупным фибробластоподобными клетками (см. рис. 3).
Как показал анализ экспрессии MHC II (I-Ab), маркера зрелости CD83 и костимуляторной молекулы CD86, B220+CD1 ^-пДК и Sirpa+CDUc+^flK увеличивали степень зрелости с возрастанием сроков культивирования (см. рис. 4А-В). При этом Sirpa+CD11c+-мДК обладали более зрелым фенотипом по сравнению с B220+CD11c+^,K на всех сроках культивирования (см. рис. 4А-В). Использование 100 или 200 нг/мл Flt3-L значимо не влияло на фенотип B220+CD11c+-пДК и Sirpa+CDHc+^^HK в культурах. Экспрессия MHC II (I-Ab) на B220+CD11c+-пДK и Sirpa+CDHc+^flK све-жевыделенного костного мозга оказалась значимо меньше по сравнению с экспрессией данных молекул на B220+CD11c+-пДK и Sirpa+CDHc+^flK, полученных in vitro c помощью Flt3-L к 7-м суткам (см. рис. 5), что может говорить о более зрелом фенотипе ДК, полученных в культурах. Однако при стимулировании культур ДК ЛПС или CpG ДНК B220+CD11c+-пДK и Sirpa+CD11c+-мДK приобретали еще более зрелый фенотип путем увеличения доли клеток, несущих CD83 и CD86 (см. рис. 5).
э
«
с -
« s
100 -,
80'
60-
40-
20-
% CCR9+-№
m
мДК
Г=~1
пДК
Э
2000 п
1500'
1000-
500-
CCR9 GeoMean
мДК
пДК
□ 0-й день (КМ) □ 1-й день □ 7-й день (Flt3)
0
0
-103 0 103 CCR9 PE-A 104 -103 0 103 CCR9 PE-A 104 -103 0 103CCR9 PE-A104
■ ЕЫО-контроль ■ мДК ■ пДК
Рис. 7. Относительное количество В220+СБ11с+-пДК и 8ира+СБ11с+-мДК, несущих поверхностный ССЯ9 (А) и средняя геометрическая интенсивности флуоресценции поверхностно меченого ССЯ9 на Б220+СБ11с+-пДК и 81гра+СБ11с+-мДК (Б) Скобками указаны статистически значимые отличия (сравнения между видами ДК выполнены двухфакторным дисперсионным анализом с множественными сравнениями Сидака, сравнения между сутками культивирования выполнены двухфакторным дисперсионным анализом с множественными сравнениями Тьюки; р < 0,05); В-Д- примеры цитометрии ССЯ9 на Б220+СВ11с+-пДК и Б1гра+СВ11е+-мДК на 0, 1, 7-е сутки, соответственно; п = 6.
Согласно данным литературы, пДК специализируются на противовирусном иммунном ответе, в большом количестве несут TLR7 и TLR9 и отвечают созреванием на агонист данных рецепторов - CpG ДНК [18], а мДК, несущие преимущественно TLR2 и TLR4, отвечают созреванием на их агонист - ЛПС [19]. Однако в нашем исследовании B220+CD11c+-пДK и Sirpa+CD11c+-мДК, полученные с помощью Flt3-L, созревали под действием как CpG ДНК, так и ЛПС. Но аналогичный ответ на стимуляцию CpG ДНК или ЛПС демонстрировали и B220+CD11c+-пДK, и Sirpa+CD11c+-мДK свежевыде-ленного костного мозга (см. рис. 5).
Несмотря на более зрелый фенотип по сравнению с ДК костного мозга, ДК, полученные in vitro с помощью Flt3-L, вызывали повышенную индукцию CD4+CD25hi8hFoxP3+-Tрег и сниженную пролиферацию
CD4+-лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов по сравнению с ДК, стимулированными CpG ДНК (см. рис. 6), что говорило о выполнении полученными ДК функций незрелых ДК [3, 19] и их созревании и приобретении ими иммуногенной функции при стимуляции CpG ДНК.
Интересно, что культуры ДК, стимулированные ЛПС, значимо не отличались в своей способности индуцировать CD4+CD25hi8hFoxP3+-Трег и пролиферацию CD4+ лимфоцитов от нестимулированных ДК (см. рис. 6), что может говорить о преобладании функциональных свойств пДК в культурах ДК, полученных in vitro с помощью Flt3-L, несмотря на фенотипические признаки созревания ДК в культурах под действием ЛПС. Также о преобладании плазмацитоидного фенотипа ДК в культурах, полученных с помощью Flt3-L, говорило то, что большое количество Sirpa+CD11c+-мДK в таких культурах несли PDCA-1
(см. рис. 4) - специфичный маркер пДК, основной функцией которого является участие в противовирусном иммунном ответе [15, 16]. При этом значимо меньшее количество 81гра+СБ11с+-мДК свежевыделенного костного мозга имели PDCA-1 на своей поверхности по сравнению с Sirpа+CD11c+-мДК, полученных с помощью Flt3-L, и по сравнению с B220+CD11c+-пДК свежевыделенного костного мозга (см. рис. 5).
Относительно небольшое количество B220+CD11c+-пДК и Sirpa+CD11c+-^K свежевыделенного костного мозга и культур, полученных за 7 сут с помощью Flt3-L, имело на своей поверхности относительно невысокий уровень CCR9 (см. рис. 7А-В, Д). Однако было отмечено, что через сутки после экстракции костного мозга в культурах значимо увеличивалось количество B220+CD1 ^+-пДК и Sirpa+CD11c+-мДK, несущих на
своей поверхности ССЯ9 (см. рис. 7А, Г). В литературе также было показано, что количество В220+СБ11с+-пДК, несущих поверхностный ССЯ9, увеличивается на 2-е и 3-и сутки в культуре [12]. Возможным объяснением данному явлению служит то, что, являясь рецептором гомеостатического хемокина ССЬ25, т. е. рецептором, находящимся под постоянным воздействием своего лиганда в организме [21], а также принадлежащим к семейству рецепторов, связанных с в-белками, одним из механизмов регуляции которых является интернализация в клетку после связывания с лигандом [22], ССЯ9 в клетках организма локализуется преимущественно внутриклеточно [23]. При выделении клеток из организма и потере ССЬ25-сигналинга ССЯ9 может выводиться на поверхность клетки. В нашем исследовании также подтвердилась пре-
э
и
с -
И
100
50
% ССЯ9+-ДК
мДК
пДК
Э
S 3
8000 -|
6000
4000
2000-
CCR9 GeoMean
i-1
□ 0-й день (КМ) □ 1-й день □ 7-й день (Flt3)
мДК
пДК
з
0
350 i
300
250
200
О
150
100
50
0-й день
BM 2m vnutri Sirpa+, B220+
-103 0 103
CCR9 PE-A
10
0
100 -
о
50
0
4
1-е сутки
3m-vnutr - CCL25 - Sirpa+, B220"
э
0
7-е сутки
DC 7d Flt3-L vnutri - Sirpa+, B220+
-103 0 103
CCR9 PE-A Изотопический контроль И мДК
104
пДК
-103 0 103
104
CCR9 PE-A
Рис. 8. Относительное количество В220+СБ11с+-пДК и 81гра+СБ11с+-мДК, несущих внутриклеточный ССЯ9 (А) и геометрическая средняя интенсивности флуоресценции внутриклеточно меченого ССЯ9 на В220+СБ11с+-пДК и 8ггра+СБПс+-мДК (Б) Скобками указаны статистически значимые отличия (сравнения между видами ДК выполнены двухфакторным дисперсионным анализом с множественными сравнениями Сидака, сравнения между сутками культивирования выполнены двухфакторным дисперсионным анализом с множественными сравнениями Тьюки, р < 0,05). В—Д- примеры цитометрии ССЯ9 на Б220+СВ11с+-пДК и 5ггра+СВ11с+-мДК на 0, 1, 7-е сутки, соответственно; п = 6.
0
0
0
э €
КМ neEP CCR9 poverh 1d - Sirpa, B220+
М » М
250 -
200
C
100
50
150
150 H H ^ 100'
50
—-г 0-103 0 103 104 -103 0 103 104
CCR9 PE-A CCR9 PE-A
■ мДК без CCL25 □ мДК c CCL25 ■ пДК без CCL25 ■ пДК c CCL25
Рис. 9. Примеры цитометрических данных поверхностного (А) и внутриклеточного (Б) окрашивания ССЯ9 на Б220+СБ11с+-пДК и Бкра+СБ! 1с+-мДК на 1-е сутки культивирования с добавлением или без добавления ССЬ25
0
имущественная внутриклеточная локализация CCR9 в B220+CD1 ^-пДК и Sirpa+CD11c+-мДK на всех сроках культивирования (см. рис. 8). Однако добавление к свежевыделенным клеткам костного мозга различных доз CCL25 значимо не влияло на поверхностное и внутриклеточное содержание CCR9 в B220+CD11c+-пДK и Sirpa+CD11c+-мДK после первых суток культивирования (см. рис. 9). Также B220+CD11c+-пДK и Sirpa+CD11c+-мДK, полученные с помощью Flt3-L в течение 7 сут без воздействия CCL25, несли CCR9 преимущественно внутриклеточно, а не поверхностно, что может говорить о более сложной регуляции локализации CCR9 в клетке, требующей дальнейшего изучения.
Поскольку интенсивность миграции клеток к источнику CCL25 не коррелирует с количеством клеток, несущих CCR9 на поверхности [17], и не все клетки, мигрировавшие под действием CCL25, несут CCR9 на своей поверхности [23], но в подавляющем большинстве клеток, способных к миграции, обнаруживался высокий уровень внутриклеточного CCR9 [23], то полученные в данном исследовании с помощью Flt3-L B220+CD11c+-пДK и Sirpa+CDUc+^K, несущие CCR9 преимущественно внутриклеточно, могут быть предложены для изучения их способности к миграции в тимус и индукции центральной иммунной толерантности.
■ Литература
1. Kuznetsova M., Lopatnikova J., Shevchenko J., Silkov A., Maksyutov A., Sennikov S. cytotoxic activity and memory t cell subset distribution of in vitro-stim-ulated CD8+ T cells specific for HER2/neu epitopes. Front. Immunol. 2019; 10: 1017. DOI: 10.3389/fimmu.2019.01017.
2. Kulikova E., Kurilin V., Shevchenko J., Obleukhova I., Khrapov E., Boyar-skikh U. et al. Dendritic cells transfected with a DNA construct encoding tumour-associated anti8en epitopes induce a cytotoxic immune response a8ainst autolo8ous tumour cells in a culture of mononuclear cells from colorectal cancer patients. Scand. J. Immunol. 2015; 82 (2): 110-7. DOI: 10.1111/sji.12311.
3. Mansilla M., Selles-Moreno C., Fabregas-Puig S., Amoedo J., Navarro-Bar-riuso J., Teniente-Serra A. et al. Beneficial effect of tolerogenic dendritic cells pulsed
Заключение
Таким образом, с помощью Flt3-L из клеток костного мозга мышей возможно получение относительно больших количеств B220+CD11c+-пДK и Sirpa+CD11c+-мДК. При этом получаемые B220+CD11c+-пДK и Sirpa+CD11c+-мДK обладают функциональными свойствами незрелых ДК и высоким внутриклеточным содержанием CCR9, что делает целесообразным дальнейшее изучение их способности к индукции иммунологической толерантности и подавлению нежелательного иммунного ответа. Также при стимуляции ДК, полученных с помощью Flt3-L in vitro, CpG ДНК, возможно изменение их функций с толерогенной на иммуногенную для использования данных клеток с целью индукции желаемого адаптивного иммунного ответа.
Вклад авторов
Концепция и дизайн исследования: Сенников С.В., Терещенко В.П. Сбор и обработка материала: Терещенко В.П., Булыгин А.С., Заводский Р.Ю., Куликова Е.В. Статистическая обработка: Терещенко В.П. Написание текста: Терещенко В.П. Редактирование: Сенников С.В.
with MOG autoantigen in experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neuro-sci. Ther. 2015; 21 (3): 222-30. DOI: 10.1111/cns.12342.
4. Ning B., Wei J., Zhang A., Gong W., Fu J., Jia T. et al. Antigen-specific tolerogenic dendritic cells ameliorate the severity of murine collagen-induced arthritis. PLoS One. 2015; 10 (6): e0131152. DOI: 10.1371/journal.pone.0131152.
5. Сенников С., Облеухова И. Методы индукции толерогенных дендритных клеток у животных и человека. Иммунология. 2016; 37 (5): 291-6. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-5-291-296
6. Lutz M., Suri R., Niimi M., Ogilvie A., Kukutsch N., RoBner S. et al. Immature dendritic cells generated with low doses of GM-CSF in the absence of IL-4 are maturation resistant and prolong allograft survivalin vivo. Eur. J. Immunol.
2000; 30 (7): 1813-22. DOI: 10.1002/1521 -4141 (200007)30:7<1813: :aid-immu1813 >3.0.co;2-8.
7. Fujita S., Sato Y., Sato K., Eizumi K., Fukaya T., Kubo M. et al. Regulatory dendritic cells protect against cutaneous chronic graft-versus-host disease mediated through CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells. Blood. 2007; 110 (10): 3793803. DOI: 10.1182/blood-2007-04-086470.
8. Hadeiba H., Lahl K., Edalati A., Oderup C., Habtezion A., Pachynski R. et al. Plasmacytoid dendritic cells transport peripheral antigens to the thymus to promote central tolerance. Immunity. 2012; 36 (3): 438-50. DOI: 10.1016/j.immu-ni.2012.01.017.
9. Hadeiba H., Sato T., Habtezion A., Oderup C., Pan J., Butcher E. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat. Immunol. 2008; 9 (11): 1253-60. DOI: 10.1038/ni.1658.
10. Mach N., Gillessen S., Wilson S., Sheehan C., Mihm M., Dranoff G. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 2000; 60: 3239^6.
11. Wendland M., Czeloth N., Mach N., Malissen B., Kremmer E., Pabst O. et al. CCR9 is a homing receptor for plasmacytoid dendritic cells to the small intestine. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2007; 104 (15): 6347-52. DOI: 10.1073/ pnas.0609180104.
12. Zeng R., Oderup C., Yuan R., Lee M., Habtezion A., Hadeiba H. et al. Reti-noic acid regulates the development of a gut-homing precursor for intestinal dendritic cells. Mucosal Immunol. 2013; 6 (4): 847-56. DOI: 10.1038/mi.2012.123.
13. Chen Y., Chang S., Chen T., Lee C. Efficient generation of plasmacytoid dendritic cell from common lymphoid progenitors by Flt3 ligand. PLoS One. 2015; 10 (8): e0135217. DOI: 10.1371/journal.pone.0135217.
14. Liu H., Ramachandran I., Gabrilovich D.I. Regulation of plasmacytoid dendritic cell development in mice by aryl hydrocarbon receptor. Immunol. Cell Biol. 2014; 92 (2): 200-3. DOI: 10.1038/icb.2013.65.
■ References
1. Kuznetsova M., Lopatnikova J., Shevchenko J., Silkov A., Maksyutov A., Sennikov S. cytotoxic activity and memory t cell subset distribution of in vitro-stim-ulated CD8+ T cells specific for HER2/neu epitopes. Front. Immunol. 2019; 10: 1017. DOI: 10.3389/fimmu.2019.01017.
2. Kulikova E., Kurilin V., Shevchenko J., Obleukhova I., Khrapov E., Boyar-skikh U., et al. Dendritic cells transfected with a DNA construct encoding tumour-associated antigen epitopes induce a cytotoxic immune response against autologous tumour cells in a culture of mononuclear cells from colorectal cancer patients. Scand. J. Immunol. 2015; 82 (2): 110-7. DOI: 10.1111/sji.12311.
3. Mansilla M., Selles-Moreno C., Fabregas-Puig S., Amoedo J., Navarro-Barriuso J., Teniente-Serra A., et al. Beneficial effect of tolerogenic dendritic cells pulsed with MOG autoantigen in experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurosci. Ther. 2015; 21 (3): 222-30. DOI: 10.1111/cns.12342.
4. Ning B., Wei J., Zhang A., Gong W., Fu J., Jia T., et al. Antigen-specific tolerogenic dendritic cells ameliorate the severity of murine collagen-induced arthritis. PLoS One. 2015; 10 (6): e0131152. DOI: 10.1371/journal.pone.0131152.
5. Sennikov S., Obleukhova I. Methods of induction of tolerant dendritic cells in animals and humans. Immunologiya. 2016; 37 (5): 291-6. DOI: 10.18821/02064952-2016-37-5-291-296. (in Russian)
6. Lutz M., Suri R., Niimi M., Ogilvie A., Kukutsch N., Rofiner S., et al. Immature dendritic cells generated with low doses of GM-CSF in the absence of IL-4 are maturation resistant and prolong allograft survivalin vivo. Eur. J. Immunol. 2000; 30 (7): 1813-22. DOI: 10.1002/1521-4141(200007)30:7<1813::aid-immu1813>3.0.co;2-8.
7. Fujita S., Sato Y., Sato K., Eizumi K., Fukaya T., Kubo M., et al. Regulatory dendritic cells protect against cutaneous chronic graft-versus-host disease mediated through CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells. Blood. 2007; 110 (10): 3793803. DOI: 10.1182/blood-2007-04-086470.
8. Hadeiba H., Lahl K., Edalati A., Oderup C., Habtezion A., Pachynski R., et al. Plasmacytoid dendritic cells transport peripheral antigens to the thymus to promote central tolerance. Immunity. 2012; 36 (3): 438-50. DOI: 10.1016/j.immuni.2012.01.017.
9. Hadeiba H., Sato T., Habtezion A., Oderup C., Pan J., Butcher E. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat. Immunol. 2008; 9 (11): 1253-60. DOI: 10.1038/ni.1658.
10. Mach N., Gillessen S., Wilson S., Sheehan C., Mihm M., Dranoff G. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 2000; 60: 3239^6.
11. Wendland M., Czeloth N., Mach N., Malissen B., Kremmer E., Pabst O., et al. CCR9 is a homing receptor for plasmacytoid dendritic cells to the small intestine. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2007; 104 (15): 6347-52. DOI: 10.1073/ pnas.0609180104.
15. Brawand P., Fitzpatrick D. R., Greenfield B., Brasel K., Maliszewski C., De Smedt T. Murine plasmacytoid pre-dendritic cells generated from Flt3 ligand-supple-mented bone marrow cultures are immature APCs. J. Immunol. 2002; 169 (12): 6711-9.
16. Angelov G. S., Tomkowiak M., Marcais A., Leverrier Y., Marvel J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J. Immunol. 2005; 175 (1): 189-95.
17. Feng T., Cong Y., Qin H., Benveniste E., Elson C. Generation of mucosal dendritic cells from bone marrow reveals a critical roleof retinoic acid. J. Immunol. 2010; 185 (10): 5915-25. DOI: 10.4049/jimmunol.1001233.
18. Karrich J., Jachimowski L., Uittenbogaart C., Blom B. The plasmacytoid dendritic cell as the Swiss army knife of the immune system: molecular regulation of its multifaceted functions. J. Immunol. 2014; 193 (12): 5772-8. DOI: 10.4049/ jimmunol.1401541.
19. Funderburg N., Lederman M., Feng Z., Drage M., Jadlowsky J., Harding C. et al. Human-defensin-3 activates professional antigen-presenting cells via Toll-like receptors 1 and 2. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2007; 104 (47): 18 631-5.
20. Bhattacharya P., Gopisetty A., Ganesh B., Sheng J., Prabhakar B. GM-CSF-induced, bone-marrow-derived dendritic cells can expand natural Tregs and induce adaptive Tregs by different mechanisms. J. Leukoc. Biol. 2011; 89: 235^-9.
21. Muller G., Hopken U., Stein H., Lipp M. Systemic immunoregulatory and pathogenic functions of homeostatic chemokine receptors. J. Leukoc. Biol. 2002; 72 (1): 1-8.
22. Syrovatkina V., Alegre K., Dey R., Huang X. Regulation, signaling, and physiological functions of G-proteins. J. Mol. Biol. 2016; 428 (19): 3850-68. DOI: 10.1016/j.jmb.2016.08.002
23. Lee H., Kim H., Lee E., Jang M., Kim S., Park J. et al. Characterization of CCR9 expression and thymus-expressed chemokine responsiveness of the murine thymus, spleen and mesenteric lymph node. Immunobiology. 2012; 217 (4): 402-11. DOI: 10.1016/j.imbio.2011.10.014.
12. Zeng R., Oderup C., Yuan R., Lee M., Habtezion A., Hadeiba H., et al. Reti-noic acid regulates the development of a gut-homing precursor for intestinal dendritic cells. Mucosal Immunol. 2013; 6 (4): 847-56. DOI: 10.1038/mi.2012.123.
13. Chen Y., Chang S., Chen T., Lee C. Efficient generation of plasmacytoid dendritic cell from common lymphoid progenitors by Flt3 ligand. PLoS One. 2015; 10 (8): e0135217. DOI: 10.1371/journal.pone.0135217.
14. Liu H., Ramachandran I., Gabrilovich D.I. Regulation of plasmacytoid dendritic cell development in mice by aryl hydrocarbon receptor. Immunol. Cell Biol. 2014; 92 (2): 200-3. DOI: 10.1038/icb.2013.65.
15. Brawand P., Fitzpatrick D. R., Greenfield B., Brasel K., Maliszewski C., De Smedt T. Murine plasmacytoid pre-dendritic cells generated from Flt3 ligand-sup-plemented bone marrow cultures are immature APCs. J. Immunol. 2002; 169 (12): 6711-9.
16. Angelov G. S., Tomkowiak M., Marcais A., Leverrier Y., Marvel J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J. Immunol. 2005; 175 (1): 189-95.
17. Feng T., Cong Y., Qin H., Benveniste E., Elson C. Generation of mucosal dendritic cells from bone marrow reveals a critical role of retinoic acid. J. Immunol. 2010; 185 (10): 5915-25. DOI: 10.4049/jimmunol.1001233.
18. Karrich J., Jachimowski L., Uittenbogaart C., Blom B. The plasmacytoid dendritic cell as the Swiss army knife of the immune system: molecular regulation of its multifaceted functions. J. Immunol. 2014; 193 (12): 5772-8. DOI: 10.4049/ jimmunol.1401541.
19. Funderburg N., Lederman M., Feng Z., Drage M., Jadlowsky J., Harding C., et al. Human-defensin-3 activates professional antigen-presenting cells via Toll-like receptors 1 and 2. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2007; 104 (47): 18 631-5.
20. Bhattacharya P., Gopisetty A., Ganesh B., Sheng J., Prabhakar B. GM-CSF-induced, bone-marrow-derived dendritic cells can expand natural Tregs and induce adaptive Tregs by different mechanisms. J. Leukoc. Biol. 2011; 89: 235^9.
21. Muller G., Hopken U., Stein H., Lipp M. Systemic immunoregulatory and pathogenic functions of homeostatic chemokine receptors. J. Leukoc. Biol. 2002; 72 (1): 1-8.
22. Syrovatkina V., Alegre K., Dey R., Huang X. Regulation, signaling, and physiological functions of G-proteins. J. Mol. Biol. 2016; 428 (19): 3850-68. DOI: 10.1016/j.jmb.2016.08.002
23. Lee H., Kim H., Lee E., Jang M., Kim S., Park J., et al. Characterization of CCR9 expression and thymus-expressed chemokine responsiveness of the murine thymus, spleen and mesenteric lymph node. Immunobiology. 2012; 217 (4): 402-11. DOI: 10.1016/j.imbio.2011.10.014.
