CC BY
16
© Коллектив авторов, 2022
Донецкова А.Д.1-4, Никонова М.Ф.1, 2, Шарова Н.И.1, 2, Комогорова В.В.1, 2, Литвина М.М.1' 2, Гринько Е.К.2, Киреев Б.В.2, Донецков А. Д.2,
Митин А.Н.1, 2
Особенности иммунного ответа на опухолевые штаммы ЕЬ-4 у мышей линий С57БЬ/6, В10.Б2 (К101) и БЛЬБ/е
1 Фонд перспективных исследований, 121059, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
4 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 117198, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Иммунная система обеспечивает противоопухолевый иммунитет, или иммунный надзор за опухолью. Для терапии опухолей часто используется сингенная адоптивная иммунотерапия, которая бывает неэффективна ввиду слабой иммуногенности опухолевых антигенов для собственной иммунной системы. Теоретически аллогенная адоптивная иммунотерапия должна быть значительно более эффективной.
Цель работы - исследовать динамику субпопуляций Т-лимфоцитов и НК-клеток при введении опухолевых штаммов БЬ-4 у мышей линий С57БЬ/6, В10.Б2 (Я101) и БЛЬБ/с.
Материал и методы. Исследование проводили на линейных мышах С57БЬ/6, БЛЬБ/с и В10.Б2 (Я101). Аллогенных мышей линий БЛЬБ/с и Б10.Б2 (Я101) иммунизировали живыми клетками опухолевого штамма БЬ-4 внутрибрюшинно, сингенных мышей линии С57БЬ/6 - внутрикожно с последующей плотной перевязкой опухоли и реиммунизацией через 2 мес. Для оценки иммунного ответа на опухоль в селезенке на 3-и, 12-е и 15-е сутки определяли клеточность и субпопуляционный состав Т- и НК-клеток методом проточной цитофлуориметрии.
Результаты. Первичный иммунный ответ на опухолевые штаммы БЬ-4 у сингенных мышей линии С57БЬ/6 заключался в увеличении численности Т-клеточных субпопуляций - центральных Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) памяти -в селезенке на 7-е сутки. Также с 7-х суток почти в 2 раза увеличивался уровень НК-клеток. При вторичном иммунном ответе отмечалось снижение численности Т-лимфоцитов, Т-хелперов и эффекторных клеток памяти (СБ4+-ТЕМ и СБ8+-ТЕМ) в селезенке в ранние сроки после реиммунизации с дальнейшим увеличением численности общей субпопуляции ЦТЛ, а также субпопуляций центральных и эффекторных ЦТЛ памяти через 1 нед, причем численность эффекторных ЦТЛ памяти к 7-м суткам в селезенке превышало их число в контроле в 2,5 раза, а численность НК-клеток увеличивалась к концу 1-й недели, сохраняясь повышенной до 12-х суток. Ни у одной из реиммуни-зированных мышей в течение срока наблюдения (400 сут) не отмечено роста опухоли. У аллогенных мышей линии Б10.Б2 (Я101) после введения БЬ-4 в селезенке выявлено снижение численности практически всех исследованных субпопуляций клеток в ранние сроки. Увеличение численности ЦТЛ было выявлено на 12-е сутки, численность НК-клеток увеличивалась к 13-м суткам. У аллогенных мышей линии БЛЬБ/с также наблюдалось снижение численности практически всех исследованных субпопуляций клеток в ранние сроки после иммунизации, увеличение численности всех Т-лимфоцитов отмечалось с конца 1-й недели и сохранялось до 13-х суток, увеличение числа Т-хелперов и ЦТЛ - с 7-х до 11-х суток.
Заключение. Максимальная экспансия эффекторных ЦТЛ у сингенных мышей С57БЬ/6 мышей отмечалась на 7-е сутки, а у аллогенных мышей - позже: на 11-е сутки у мышей линии БЛЬБ/с и на 12-е сутки у мышей линии Б10.Б2 (Я101). Следовательно, именно в эти сроки можно ожидать наибольший терапевтический эффект от переноса эффекторных субпопуляций ЦТЛ при проведении адоптивной иммунотерапии.
Для корреспонденции
Донецкова Альмира Дмитриевна -доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник ЦПЛ иммунологии ФПИ, ведущий научный сотрудник лаборатории дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, профессор кафедры иммунологии МБФ ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, профессор кафедры иммунологии Мединститута ФГАОУ ВО РУДН Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0003-2465-2444
Ключевые слова: сингенные лимфоциты; аллогенные лимфоциты; ББ-4; иммунизация; реиммунизация; адоптивная иммунотерапия
Статья получена 11.08.2022. Принята в печать 23.09.2022.
Для цитирования: Донецкова А.Д., Никонова М.Ф., Шарова Н.И., Комогорова В.В., Литвина М.М., Гринько Е.К., Киреев Б.В., Донецков А. Д., Митин А.Н. Особенности иммунного ответа на опухолевые штаммы ББ-4 у мышей линий С57ББ/6, В10.Б2 (Я101) и БЛЬБ/с. Иммунология. 2022; 43 (5): 558-570. Б01: Шр8://<М. о^/10.33029/0206-4952-2022-43-5-558-570
Финансирование. Исследование проведено в рамках выполнения аванпроекта Фонда перспективных исследований (договор № 6/088/2016-2017ав от 15.08.2016). Работа Донецковой А.Д. выполнена при поддержке Программы стратегического академического лидерства РУДН.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Донецкова А. Д., Митин А. Н.; сбор и обработка материала - Донецкова А.Д., Никонова М.Ф., Шарова Н.И., Гринько Е.К.; анализ цитометрических данных - Комогорова В.В., Литвина М.М., Митин А.Н.; статистическая обработка - Киреев Б.В., Донецков А.Д.; написание и редактирование текста - Донецкова А.Д., Митин А.Н.
Donetskova A.D.1-4, Nikonova M.F.1' 2, Sharova N.I.1' 2, Komogorova V.V.1' 2, Litvina M.M.1 2, Grinko E.K.2, Kireev B.V.2, Donetskov A.D.2, Mitin A.N.1 2
Differences in immune response of C57BL/6, B10.D2 (R101) and BALB/c mice to EL-4
1 Advanced Research Foundation, 121059, Moscow, Russian Federation
2 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
3 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
4 Peoples' Friendship University of Russia of Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, 117198, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. The immune system provides antitumor immunity, or immune surveillance. Syngeneic adoptive immunotherapy is often used for cancer therapy, but it is ineffective due to the weak immunogenicity of tumor antigens for the own immune system. In theory, allogeneic adoptive immunotherapy should be significantly more effective.
Aim - to study the immune response to EL-4 in C57BL/6, B10.D2 (R101) and BALB/c mice and evaluate the possibility of syngeneic and allogeneic adoptive immunotherapy.
Material and methods. In the study, we used C57BL/6, BALB/c and B10.D2 (R101) mice. Allogeneic mice BALB/c and B10.D2 (R101) were immunized with EL-4 cells intraperitoneally, syngeneic C57BL/6 mice - intradermally with tight ligation of the tumor in the future and reimmunization in 2 months. To assess the immune response to a tumor in the spleen, the cellularity and subpopulations of T-lymphocytes and NK cells were determined on days 3, 12, 15 by flow cytometry.
Results. The primary immune response to EL-4 in syngeneic C57BL/6 mice consisted of an increase in the amount of T-cell subpopulations (central memory T helpers and central memory CTLs), and NK cells in the spleen on day 7. During the secondary immune response, there was a decrease in the amount of T-lymphocytes, T-helpers, and effector memory cells (CD4+-TEM and CD8+-Tem) in the spleen in the early periods after reimmunization, with a further increase in all CTLs, including subpopulations of central and effector memory CTLs after a week. Moreover, the amount of effector memory CTLs in the spleen by day 7 exceeded 2.5 times compared with the control. The amount of natural killers increased by the end of the 1st week and was raised up to 12 days. None of the reimmunized mice showed tumor growth during the observation period (400 days). After administration of EL-4 to allogeneic B10.D2 (R101) mice we detected a decrease in almost all the studied cell subpopulations in the early periods in the spleen. An increase in the amount of CTL was detected on the 12th day, and the level of NK cells was raised by the 13 th day. In allogeneic BALB/c mice, a decrease in the amount of all studied cell subpopulations was also observed in the early periods after immunization. We
For correspondence
Almira D. Donetskova -MD, PhD,
Leader Researcher of Lymphocyte Differentiation Lab. MBF, N.I. Pirogov RNRMU, MOH of Russia, Professor of Immunology Chair of MBF N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Professor of Immunology Chair of the Medical Institute, RUDN, MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0003-2465-2444
noted an increase in the number of T-lymphocytes from the end of the 1st week and persisting up to 13 days, and an increase in the amount of T-helpers and CTL from 7 to 11 days in BALB/ c mice.
Conclusion. We showed that the maximum expansion of effector cytotoxic T-lymphocytes in syngeneic C57BL/6 mice was on day 7 and it was later in allogeneic mice: on day 11 in BALB/c mice and on day 12 in B10.D2 (R101) mice. Therefore, the greatest therapeutic effect can be expected from the transfer of CTL effector subpopulations for adoptive immunotherapy during these periods.
Keywords: syngeneic lymphocytes; allogeneic lymphocytes; EL-4; immunization reimmunization; adoptive immunotherapy
Received 11.08.2022. Accepted 23.09.2022.
For citation: Donetskova A.D., Nikonova M.F., Sharova N.I., Komogorova V.V., Litvina M.M., Grinko E.K., Kireev B.V., Donetskov A.D., Mitin A.N. Differences in immune response of C57BL/6, B10.D2 (R101) and BALB/c mice to EL-4. Immunologiya. 2022; 43 (5): 558-70. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-558-570 (in Russian)
Funding. The study was carried out within the implementation of the preliminary project of the Advanced Research Foundation (contract No. 6/088/2016-2017 dated 15.08.2016). The work of Donetskova A.D. was supported by the Strategic Academic Leadership Program from RUDN.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Research conception and design - Donetskova A.D., Mitin A.N.; collection and processing of material - Donetskova A.D., Nikonova M.F., Sharova N.I., Grinko E.K.; analysis of cytometric data - Komogorova V.V., Litvina M.M., Mitin A.N.; statistical analysis - Kireev B.V., Donetskov A.D.; writing and editing of the text - Donetskova A.D., Mitin A.N.
Введение
Иммунная система обеспечивает противоопухолевый иммунитет, или иммунный надзор за опухолью. К механизмам иммунного надзора за опухолями относятся непосредственное распознавание и уничтожение опухолевых клеток, предотвращение и ликвидация он-когенных вирусных инфекций, ослабление хронической воспалительной реакции и хронических инфекций, а также подавление пролиферации аберрантных клеток через сигнальные пути, запускаемые цитокинами [1-3].
На современном этапе с целью достижения контроля над злокачественным процессом в терапии опухолей все более активно используется иммунотерапия (биотерапия), представляющая собой лечение опухолей посредством пассивной и активной иммунизации, мо-ноклональных антител, активированных лимфоцитов, цитокинов и их антагонистов [4].
Одним из наиболее перспективных, специфичных и эффективных методов лечения опухолей видится адоптивная иммунотерапия, включающая применение иммунокомпетентных клеток [5]. В ряде работ было показано, что адоптивная цитотерапия, включающая перенос лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (TIL), лимфокин-активированных киллеров (ЛАК) после экспансии in vitro или модификация Т-лимфоцитов путем трансфекции Т-клеточных рецепторов и химерных антигенных рецепторов (TCR-T- и CAR-T-клетки), эффективна при некоторых злокачественных новообразованиях [6-11]. Основные проблемы всех методов
адоптивной клеточной терапии - трудоемкость и высокая стоимость получения клеток, способных оказывать противоопухолевое действие.
Предпосылкой к проведению данного исследования стало то, что для терапии опухолей используется син-генная адоптивная иммунотерапия, которая часто оказывается неэффективной ввиду слабой иммуногенности опухолевых антигенов для собственной иммунной системы [12]. Теоретически аллогенная адоптивная иммунотерапия должна быть значительно более эффективной, однако при переносе аллогенных клеток возникает вопрос отторжения клеток донора. Большая активность аллогенных опухоль-специфичных Т-лимфоцитов в случае преодоления или преобладания над реакцией отторжения позволит более активно элиминировать развившуюся опухоль ввиду сильной иммуногенно-сти чужеродных опухолевых антигенов для иммунной системы донора. Вопрос отторжения аллогенных Т-клеток может быть решен путем создания костномозговых химер, толерантных к клеткам донора. В то же время известно, что любая опухоль экспрессирует разнообразные антигены, причем они могут отличаться у пациентов с одной и той же нозологической формой опухоли. В этом случае аллогенная адоптивная противоопухолевая терапия может оказаться неэффективной.
На первом (подготовительном) этапе работы нами проведена иммунизация опухолевыми клетками БЬ-4 мышей разных линий [С57БЬ/6, БЛЬБ/с и В10. Б2(Я101)], сингенных и аллогенных по отношению к данной опухолевой линии, с последующим исследова-
нием иммунного ответа на опухоль и оценкой возможности проведения сингенной и аллогенной адоптивной иммунотерапии.
Материал и методы
Экспериментальные животные и клеточные культуры. Исследование проводилось на линейных мышах C57BL/6 и BALB/c в возрасте 6-8 нед, самках массой 18-20 г, полученных из питомника «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России, а также на мышах линии В10.Б2 (R101), любезно предоставленных экспериментально-биологической лабораторией ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Все процедуры с экспериментальными животными проводили в соответствии с правилами лабораторной практики [«Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (ETS N123), приказ Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» и «Положение об этическом отношении к лабораторным животным ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России].
Живые опухолевые клетки лимфомы EL-4, полученные из коллекции опухолевых штаммов, созданной в экспериментально-биологической лаборатории ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, перевивали в асцитной форме в сингенных мышах линии C57BL/6 по стандартной методике. Для этого 5*106 опухолевых клеток вводили внутрибрюшинно сингенной мыши линии C57BL/6 в 500 мкл PBS. Через 8 дней собирали асцитную жидкость, делая перитоне-альный лаваж. Клетки трижды отмывали в PBS и подсчитывали количество опухолевых клеток в камере Го -ряева в присутствии эозина. Жизнеспособность клеток превышала 97%. В опытах использовали клетки после 1-го пассажа.
Экспериментальные процедуры. При отработке методики иммунизации мышей опухолевыми клетками было установлено, что для иммунизации аллогенных мышей приемлема внутрибрюшинная иммунизация, однако этот способ оказался непригоден для синген-ных мышей. Для иммунизации сингенных мышей пришлось ограничить проникновение опухоли в подлежащие ткани с помощью перевязки опухолевого узла.
Аллогенных мышей линий BALB/c и B10.D2 (R101) иммунизировали живыми клетками опухолевого штамма EL-4 внутрибрюшинно в дозе 10,0 млн клеток на мышь. Для оценки первичного иммунного ответа аллогенных мышей линий B10.D2 (R101) и BALB/c выводили из эксперимента методом церви-кальной дислокации на 3, 5, 7, 9, 11, 12, 13 и 15-е сутки после иммунизации живыми клетками опухолевого штамма EL-4.
Сингенных мышей линии C57BL/6 иммунизировали живыми клетками опухолевого штамма EL-4 внутри-кожно в дозе 0,1 млн клеток на мышь. При достижении опухолью размера 1,0 см по одному из диаметров
для предупреждения ее дальнейшего распространения и гибели животных опухоль плотно перевязывали. В дальнейшем (через 2-3 сут) наблюдали отпадение опухоли. Для оценки первичного иммунного ответа мышей линии C57BL/6 выводили из эксперимента на 3, 7, 9 и 12-е сутки после иммунизации живыми клетками опухолевого штамма EL-4.
Через 2 мес после иммунизации проведена подкожная реиммунизация мышей линии C57BL/6 живыми клетками опухолевой линии EL-4 в подлопаточную область в дозе 1,0 млн клеток на мышь. Для оценки вторичного иммунного ответа иммунизированных синген-ных мышей линии С57BL/6 выводили из эксперимента на 3, 5, 7, 9, 10 и 12-е сутки после повторной иммунизации.
Лабораторные исследования. У мышей извлекали селезенку, освобождали ее от соединительной ткани, гомогенизировали, выделяли клетки, лизировали эритроциты с помощью лизирующего буфера фирмы eBioscience (США), определяли численность и жизнеспособность клеток, предварительно окрашенных эозином, в камере Горяева, отмывали раствором PB S c 1,0 % BSA и 0,1 % ЭДТА и инкубировали с монокло-нальными антителами (МкАт) в растворе PBS с 1,0 % BSA и 0,1 % NaN3 в течение 30 мин при 4 °С. Использовали следующие сочетания МкАт: NK1.1-FITC, CD3-APC, CD4-PerCP, CD8-APCeFluor780, CD44-PECy7, СD62L-PE. Лазерную цитометрию осуществляли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II (Becton Dickinson, США) в стандартном режиме. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения FlowJo X (США).
Статистическую обработку проводили с использованием методов непараметрического анализа. Количественные показатели представляли в виде Ме (LQ-UQ), где Ме - медиана, LQ - нижний квартиль, UQ - верхний квартиль. Для сопоставления двух групп по количественным признакам использовали ^/-критерий Манна-Уитни. Различие групп полагали статистически значимым при р < 0,05. Обработку проводили в программном пакете StatSoft Statistica 12.0.
Результаты
Нами проведена оценка клеточности и количественного состава различных субпопуляций Т-лимфоцитов, НК и НКТ-клеток. Цитотоксические Т-лимфоцитов (ЦТЛ) определяли методом проточной цитометрии по экспрессии маркеров CD3 и ОТ8, Т-хелперы - по экспрессии маркеров CD3 и CD4, наивные клетки (1^.) -по фенотипу CD62LhighCD44low/-, центральные Т-клетки памяти ( ТСМ) - CD62LhighCD44high, эффекторные Т-клетки памяти (ТЕМ) - CD62Llow/-CD44high (рис. 1), НК-клетки -по экспрессии NK1.1, НКТ - по коэкспрессии CD3 и NK1.1.
В табл. 1 представлена динамика содержания Т-клеток, наивных и эффекторных Т-лимфоцитов, НК и НКТ- клеток в селезенке мышей линии C57BL/6 после первичного введения опухолевых клеток EL-4.
105
с
с
104
102
Naive 45,6 % шШшш CM 12,7 % gfe ШШг.
Td Ч.Ч4 % ¡lit ЕМ 31.8 %
0 102
103
104
105
Comp-PeiCP-Cy5-5-A:: CD44
Рис. 1. Цитограмма «возрастного» фенотипа СБ4+-Т-клеток на примере лимфоцитов селезенки мыши линии C57BL/6: содержание наивных Т-клеток (Naive) - 45,6%, центральных Т-клеток памяти (СМ) - 12,7 %; эффекторных Т-клеток памяти (ЕМ) - 31,8 %; терминально-дифференцированных Т-клеток (Td) - 9,9 %
4
CD4+-TE
8
-CD8+-Te
10
12
НК
Рис. 2. Динамика численности основных эффекторных субпопуляций лимфоцитов мышей С57БЬ/6, иммунизированных БЬ-4 (по оси абсцисс - сутки после введения опухолевых клеток; по оси ординат - нормализованные к интактному контролю данные; * - р < 0,05 в сравнении с контролем -0 сут)
0
2
6
Судя по табл. 1, наибольшее количество Т-лимфоцитов в селезенке отмечалось на 7-е сутки -39,4 млн (35,73-45,63 млн), однако их численность статистически не отличалась от численности Т-клеток в контроле - 34,4 млн (25,4-43,37 млн), р = 0,40. Численность центральных Т-хелперов и ЦТЛ памяти также увеличивалось на 7-е сутки (для Т-хелперов увеличение сохранялось и на 9-е сутки), а эффекторных Т-киллеров -на 7-12-е сутки (р < 0,05 в сравнении с контролем). Численность наивных Т-хелперов и ЦТЛ статистически значимо снижалось к 12-м суткам до 2,53 млн (2,33,36 млн) и 4,42 млн (4,17-4,82 млн) соответственно, р < 0,05 в сравнении с контролем. К концу 1-й недели почти в 2 раза увеличивалось число НК-клеток, которое составляло 7,46 млн (6,96-7,49 млн) при 4,06 млн (3,1-4,95 млн) в контроле, р = 0,005 (рис. 2). Однако, несмотря на увеличение численности некоторых субпопуляций лимфоцитов, первичный иммунный ответ на
опухолевые клетки БЬ-4 у мышей линии С57БЬ/6 был неэффективен: у мышей, которым опухоль не перевязывали, отмечались ее рост и гибель животных через 3 нед после введения опухолевых клеток.
Для проверки наличия противоопухолевого иммунитета у иммунизированных мышей им через 2 мес после первой иммунизации повторно ввели опухолевые штаммы лимфомы БЬ-4 подкожно. Ни у одной из реиммунизированных мышей в течение срока наблюдения (400 сут) не отмечено роста опухоли [неимму-низированные мыши из группы контроля того же возраста, что и мыши экспериментальной группы, погибли на 24,0 (21,0-27,0) сут, р<0,001].
У части первично реиммунизированных мышей проведена оценка вторичного иммунного ответа (табл. 2).
При цитофлуориметрическом анализе селезенок мышей линии С57БЬ/6 после реиммунизации клетками БЬ-4 максимальная клеточность этого органа отмеча-
Таблица 1. Численность основных возрастных субпопуляций Т-лимфоцитов, НК- и НКТ-клеток в селезенке мышей С57БЬ/6 при первичном иммунном ответе на БЬ-4 (млн)
Клеточная популяция Сутки после внутрикожного введения EL-4
0 (8 мышей) 3 (4 мыши) 7 (4 мыши) 9 (5 мышей) 12 (5 мышей)
Клеточность 124,5 (90-127,35) 125 (119,7-128,3) 147 (129,7-157,3) 121,4 (121-132) 116 (107-117)
CD3+ 34,4 (25,4-43,37) 31,56 (29,18-35,38) 39,4 (35,73-45,63) 28,41 (26,98-29,44) 28,68 (27,02-34,87)
CD3+CD4+ 20,13 (12,71-25,45) 18,02 (15,99-19,97) 23,83 (21,57-25,38) 13,63 (12,57-14,13) 16,57 (7,76-17,61)
CD4+-T w-L-'^ J- naive 9,02 (5,42-12,96) 10,41 (9,51-11,72) 11,84 (10,33-13,37) 5,7 (4,21-6,13) 2,53* (2,3-3,36)
CD4+-Tcm 0,93 (0,72-1,05) 0,74 (0,61-0,93) 2,09* (1,93-2,3) 1,64* (1,51-1,68) 0,89 (0,86-0,89)
CD4+-Tem 7,59 (3,71-9,18) 3,05* (2,28-3,23) 7,22 (6,38-7,98) 4,43 (4-4,49) 8,45 (3,21-9,15)
CD3+CD8+ 12,52 (8,8-14,31) 10,68 (10,43-11,92) 12,69 (11,52-16,04) 10,25 (9,63-11,19) 11,08 (10,93-11,31)
CD8 -Tnaive 7,06 (5,17-10,31) 7,2 (6,8-8,42) 6,79 (5,87-8,21) 5,71 (3,66-6,26) 4,42* (4,17-4,82)
CD8+-Tcm 2,13 (1,88-2,46) 1,97 (1,81-2,15) 2,92* (2,7-3,3) 1,99 (1,85-2,3) 2,56 (2,21-2,76)
CD8+-Tem 1,28 (1,13-1,57) 1,08 (0,99-1,21) 2,19* (1,55-2,57) 1,86* (1,86-2,02) 1,98* (1,88-2,38)
NK1.1+ 4,06 (3,1-4,95) 4,28 (3,98-4,35) 8,03* (6,18-9,54) 8,16* (7,47-8,32) 7,46* (6,96-7,49)
CD3+NK1.1+ 0,63 (0,58-1,18) 0,9 (0,86-0,94) 1,52 (1,29-1,94) 1,16 (0,95-1,22) 1,06 (0,85-1,18)
* -р < 0,05 в сравнении с контролем (0 сут). Иммунология ■ Том 43 ■ № 5 ■ 2022
Таблица 2. Численность основных возрастных субпопуляций Т-лимфоцитов, НК- и НКТ-клеток в селезенке мышей С57БЬ/6 при вторичном иммунном ответе на ЕЬ-4 (млн)
Клеточная популяция Сутки после реиммунизации БЬ-4
0 (24 мыши) 3 (9 мышей) 5 (5 мышей) 7 (14 мышей) 9 (12 мышей) 10 (6 мышей) 12 (6 мышей)
Клеточность 142 (124,5-154,8) 126,6 (123,4-138) 136 (106-162) 146 (115,4-166,6) 156,4* (146-172) 157 (138,6-175,2) 141 (118-146,6)
CD3+ 44,06 (34,22-47,36) 35,28* (29,86-36,29) 43,11 (34,03-50,54) 44,1 (38,08-57,48) 44,85 (40,62-54,85) 45,28 (41,86-47,3) 42,87 (37,05-46,33)
CD3+CD4+ 25,82 (20,13-28,51) 20,14* (16,72-21,23) 26,04 (20,55-30,93) 24,07 (22,24-27,13) 28,16 (25,13-33,49) 28,42 (24,44-29,97) 22,61 (20,57-27,33)
CD4+-T . naive 13,53 (8,91-15,32) 9,2 (8,59-11,22) 15,18 (11,82-17,04) 11,5 (8,81-13,37) 15,5* (14,96-19,37) 13,76 (13,05-14,54) 11 (10,39-14,98)
cd4+-tcm 0,85 (0,63-1,08) 0,57 (0,5-1,52) 1,28* (1,18-1,5) 2,41* (1,57-2,5) 1,41* (1,18-1,98) 1,48* (1,37-1,52) 1 (0,87-1,14)
cd4+-tem 7,5 (4,71-9,18) 2,63* (2,21-4,21) 7,68 (5,94-9,43) 8,19 (7,74-9,92) 8,21 (6,5-9,96) 10,01 (7,9-10,69) 7,29 (6,87-8,31)
CD3+CD8+ 13,82 (9,39-15,5) 9,91 (9,07-11,65) 14,05 (11,36-15,25) 16,92* (14,13-20,89) 13,96 (12,96-17,26) 13,04 (12,71-14,02) 13,06 (12,47-15,24)
CD8+-T . naive 9,65 (6,5-11,12) 6,34 (5,69-8,01) 9,59 (8,06-10,83) 9,69 (7,96-12,12) 10,83 (9,57-12,44) 9,6 (9,28-10,25) 8,14 (7,03-11,25)
cd8+-tcm 2,00 (1,19-2,39) 1,19 (0,95-1,63) 2,01 (1,89-2,47) 3,15* (2,61-3,63) 1,97 (1,74-2,54) 1,98 (1,88-2,16) 2,21 (2,05-2,76)
CD8+-TEM 1,13 (0,68-1,42) 0,76* (0,52-0,96) 1,43 (1,06-1,5) 2,93* (2,03-3,28) 1,23 (0,79-1,91) 1,08 (0,98-1,19) 1,62 (1,00-1,79)
NK1.1+ 3,91 (3,15-4,95) 2,62 (2,53-2,77) 2,86 (1,84-3,34) 5,57* (4,34-7,87) 5,6* (4,71-6,45) 5,86* (5,2-6,12) 6,46* (5,02-7,59)
CD3+NK1.1+ 0,72 (0,54-1,09) 0,34* (0,31-0,67) 0,64 (0,63-1,04) 1,1* (1,04-1,46) 0,79 (0,57-1,18) 0,84 (0,62-0,92) 1,78* (1,66-1,93)
* - р < 0,05 в сравнении с контролем (0 сут).
лась на 9-е сутки: 156,4 млн (146-172 млн), что статистически значимо отличалось от соответствующего показателя в контрольной группе - 142 млн (124,5-154,8 млн), р = 0,038 (см. табл. 2).
Количество Т-лимфоцитов, Т-хелперов и эффектор-ных Т-хелперов памяти в селезенке не увеличивалось, наоборот, отмечалось их значимое снижение на 3-и сутки после реиммунизации, р < 0,05 в сравнении с контролем. В то же время отмечалось статистически значимое увеличение Т-хелперов, несущих маркер СБ62Ь. Численность наивных Т-хелперов увеличивалась к 9-м суткам, а центральных Т-хелперов памяти - к 5-м суткам с максимальным значением на 7-е сутки, сохраняясь повышенным до 10-х суток. Что касается субпопуляции ЦТЛ, а также центральных ЦТЛ памяти, их максимальная численность отмечалась через 1 нед после реиммунизации (р < 0,05 в сравнении с контролем). Считается, что при вторичном противоопухолевом иммунном ответе наибольшее протективное значение имеет субпопуляция эффектор-ных ЦТЛ памяти: отмечалось статистически значимое увеличение численности этой субпопуляции клеток в селезенке к 7-м суткам до 2,93 млн (2,03-3,28 млн), что в 2,5 раза превышало их численность в контроле -1,13 млн (0,68-1,42 млн), р = 0,000007. В то же время на 3-и сутки после реиммунизации выявлено снижение числа СБ8+-ТЕМ до 0,76 млн (0,52-0,96 млн), связанное, по-видимому, с их миграцией к месту введения опухоле-
вых клеток ЕЬ-4. Численность НК-клеток увеличивалось к концу 1-й недели, сохраняясь повышенным до 12 сут (р < 0,05) в сравнении с контролем. Численность НКТ-клеток также статистически значимо была увеличена на 7-е и 12-е сутки. Таким образом, отмечалось увеличение численности клеток в основных субпопуляциях лимфоцитов, способных осуществлять противоопухолевую защиту, на 7-е сутки после реиммунизации ЕЬ-4 (рис. 3).
■ CD4-TE
-CD8-Te
10 НК
Рис. 3. Динамика численности основных эффекторных субпопуляций лимфоцитов мышей С57БЬ/6, реиммунизированных ЕЬ-4 (по оси абсцисс - сутки после введения опухолевых клеток; по оси ординат - нормализованные к интактному контролю данные; * -р < 0,05 в сравнении с контролем - 0 сут)
Рис. 4. Цитометрическое исследование «возрастного» фенотипа СБ8+-Т-клеток мышей C57 BL/6 после иммунизации и реммунизации EL-4 (красным отмечен повышеный уровень CD8+-TEM): А - интактные мыши; Б - через 60 сут после иммунизации; В - через 7 сут после реиммунизации
На рис. 4 представлены результаты цитометрического исследования фенотипа ЦТЛ селезенки на 7-е сутки после реиммунизации мышей С57БЬ/6, показывающие повышение содержания эффекторных ЦТЛ памяти (СВ3+СВ8+СВ62Ь1отт/-СВ44Ы!!11-клеток), в сравнении с интактными мышами и мышами, однократно иммунизированными за 60 дней до анализа.
Для оценки первичного иммунного ответа у аллоген-ных животных: мышей линии Б10.Б2 (Я101) и БЛЬБ/с -на клетки опухолевого штамма БЬ-4 проводилась их внутрибрюшинная иммунизация с оценкой общей кле-точности и численности субпопуляций лимфоцитов в селезенке. Результаты исследования представлены в табл. 3.
В отсутствие статистически значимого изменения общей клеточности в селезенке мышей линии Б10.Б2 (Я101) было выявлено снижение численности практически всех исследованных субпопуляций клеток (кроме наивных Т- и НК-клеток) в ранние сроки (3-и сутки) после введения БЬ-4, статистически значимое для эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов (СБ4+-ТЕМ и СБ8+-ТЕМ). С 5-е по 9-е сутки отмечалось
значительное (4-5-кратное) увеличение числа центральных Т-хелперов памяти, достигающих 14,67 млн (11,99-19,77 млн) при 2,77 млн (1,44-3,01 млн) в контрольной группе (¿>=0,04).
Что касается субпопуляции ЦТЛ, статистически значимое увеличение числа CD3+CD8+-клеток было выявлено на 12-е сутки после иммунизации (табл. 3). Численность наивных ЦТЛ (CD8+-T ) в течение
1 v naive'
времени наблюдения не только не увеличивалась, но и статистически значимо снижалось на 5-е и 12-13-е сутки после введения опухолевых клеток. Это может быть связано с их переходом в эффекторные субпопуляции. Численность эффекторных ЦТЛ памяти (CD8+-Tem) статистически значимо снижалась на 3-и сутки, начинала увеличиваться и достигала максимального значения на 12-е сутки - 28,46 млн (22,3346,43 млн) [увеличение почти в 4 раза в сравнении с интактным контролем - 7,37 млн (3,07-10,06 млн), р = 0,04] с его дальнейшим снижением (рис. 5).
Численность НК-клеток в ранние сроки в селезенке мышей R101, привитых EL-4, существенно не изменялась, ее увеличение отмечалось только на 13-е сутки.
L4
'0 2 4 6 8 10 12 14
CD4+-TEM -■-CD8+-TEM НK
Рис. 5. Динамика численности основных эффекторных субпопуляций лимфоцитов мышей Ю01, иммунизированных БЬ-4 (по оси абсцисс - сутки после введения опухолевых клеток; по оси ординат - нормализованные к интактному контролю данные; * - р<0,05 в сравнении с контролем - 0 сут)
Comp-PeгCP-Cy5-5-A:: CD44
Рис. 6. Цитометрическое исследование «возрастного» фенотипа фенотипа СБ8+-Т-клеток мышей Б10.Б2 (Ю01) после иммунизации БЬ-4: А - интактные мыши; Б - через 12 сут после иммунизации
60,8% 23,4%
; - : .....' Л* Td 4,27% . ЯР v'-V-. ' ЕM Ш'-: 11,6%
э
Naive 15,5% ijMli CM 12,0%
Td 7,45% Ш.- ЕM 65,1%
Comp-PerCP-Cy5-5-A:: CD44
Таблица 3. Численность основных субпопуляций Т-лимфоцитов, НК-и НКТ-клеток в селезенке мышей Б10.Б2 (Ю01) при первичном иммунном ответе на БЬ-4 (млн)
Клеточная популяция Сутки после реиммунизации ЕЬ-4
0 (3 мыши) 3 (3 мыши) 5 (3 мыши) 7 (3 мыши) 9 (6 мышей) 11 (7 мышей) 12 (3 мыши) 13 (3 мыши) 15 (3 мыши)
Клеточность 206,7 (138246) 165 (110,3217) 174 (160,4196,4) 300 (196,6302) 198,7 (180225,3) 190 (180237) 204 (200300) 225 (180244) 262 (183276)
CD3+ 65,73 (42,0970,85) 49,83 (34,1964,88) 66,19 (46,273,95) 71,27 (57,2184,6) 48,54 (45,465,56) 53,31 (47,1674,1) 72,83 (66,8104,4) 60,76 (58,570,88) 75,19 (49,9680,59)
CD3+CD4+ 37,05 (25,9339,83) 34,03 (23,0837,96) 45,54 (31,8749,62) 48,89 (38,5660,66) 32 (30,4745,43) 28,47 (22,6731,12) 27,6 (25,9932,05) 28,13 (25,5132,96) 43,99 (27,6348,52)
CD4+-T . naive 17,85 (13,6620,49) 22,97 (15,5126,42) 13,84 (11,1616,89) 16,82 (15,6223,66) 12,06* (11,2812,49) 16,49 (13,5419,72) 16,29 (15,8318,02) 13,15 (9,2514,97) 19,75 (11,3522,32)
CD4+-TCM 2,77 (1,443,01) 1,34 (1,081,45) 11,66* (9,8214,59) 14,67* (11,9919,77) 13,43* (12,4814,72) 1,74 (1,152,28) 2,7 (2,292,82) 1,48 (1,012,53) 2,79 (1,813,29)
CD4+-TEM 11,38 (8,6314,66) 6,3* (4,716,74) 16,53 (10,6820,39) 16,62 (10,616,97) 7,01 (3,3413,63) 4,43 (2,867,31) 5,98 (5,5811,92) 9,19 (5,19,48) 14,07 (8,5414,43)
CD3+CD8+ 22,48 (13,7228,84) 12,91 (8,8622,19) 18,14 (12,2921,67) 19,74 (16,7121,07) 14,7 (11,9817,23) 24,3 (20,2638,53) 41,37* (36,5465,67) 29,19 (24,9729,7) 24,36 (13,7425,39)
CD8+-T . naive 6,65 (5,89,98) 7,67 (4,8312,25) 4,82* (2,495,6) 6,26 (5,969,06) 4,39 (4,166,78) 6,08 (4,118,00) 5,19 (4,515,81) 4,99* (4,625,69) 6,65 (4,238,05)
CD8+-TCM 4,02 (3,725,36) 3,07 (2,553,95) 4,63 (3,425,13) 7,44* (6,537,54) 5,37 (4,176,46) 4,23 (2,536,57) 6,14 (4,967,09) 2,14* (1,963,24) 3,48* (1,883,58)
CD8+-TEM 7,37 (3,0710,06) 1,27* (0,891,9) 7,27 (2,7915,49) 4,34 (3,846,2) 3,61 (2,35,94) 14,64 (9,7621,96) 28,46* (22,3346,43) 13,6* (11,6113,96) 8,48 (5,4410,18)
NK1.1+ 3,72 (2,774,94) 4,72 (2,796,47) 4,18 (2,874,84) 3,44 (2,734,17) 3,68 (3,184,19) 4,19 (3,144,71) 3,08 (3,065,34) 5,6* (5,547,81) 8,31 (4,798,69)
CD3+NK1.1+ 2,46 (1,493,3) 1,51 (0,752,6) 0,96* (0,551,45) 0,96* (0,841,01) 0,9* (0,49-1) 0,64* (0,471,08) 0,72 (0,581,73) 1,44 (0,992,16) 2,24 (1,492,41)
*-р<0,05 в сравнении с контролем (0 сут).
Содержание НКТ-клеток в течение всего периода наблюдения было снижено с минимальными значениями на протяжении 5-11-х суток.
Изменение численности основных эффекторных субпопуляций лимфоцитов мышей Я101, привитых БЬ-4, нормализованное к интактному контролю, принятому за 1, представлено на рис. 3.
Пример цитометрического исследования «возрастного» фенотипа спленоцитов на 12-е сутки после иммунизации мышей Б10.Б2 (Я101) приведен на рис. 6: уровень СБ8+-ТБМ ЦТЛ (СВ3+СБ8+СВ62Ь1от'/-СБ44Ы811-клеток) повышен в сравнении с интактными мышами.
Цитофлуориметрический анализ клеток селезенок аллогенных мышей БАЬБ/с после первичной иммунизации клетками БЬ-4 показал больше статистически значимых изменений (табл. 4). Общее число лимфоид-ных клеток селезенки у мышей линии БАЬБ/с статистически значимо повышалось на 9-е и 11-е сутки после иммунизации, сопровождаясь статистически значимым увеличением численности Т-клеток и их цитотоксиче-ских субпопуляций. Увеличение числа всех Т-клеток отмечалось с 7-х суток, т. е. раньше, чем общей кле-точности органа, и сохранялось до 13-х суток. Так же, как и у мышей линии Я101, у мышей БАЬБ/с наблюдалось снижение числа практически всех исследован-
Таблица 4. Численность основных субпопуляций Т-лимфоцитов, НК-и НКТ-клеток в селезенке мышей БЛЬБ/е при первичном иммунном ответе на БЬ-4 (млн)
Клеточная популяция Сутки после реиммунизации ЕЬ-4
0 (3 мыши) 3 (3 мыши) 5 (3 мыши) 7 (3 мыши) 9 (6 мышей) 11 (7 мышей) 12 (3 мыши) 13 (3 мыши) 15 (3 мыши)
Клеточность 215 (187,3310) 252 (247,3286,7) 255,4 (206293,4) 320 (287,4323,4) 343,3* (335460) 374* (320470) 304 (304310) 351 (222363) 276 (216321)
CD3+ 69,02 (66,1282,46) 57,62 (47,8868,04) 80,45 (64,6885,97) 96,7* (95,99110,08) 90,29* (87,44123,28) 123,05* (101,12148,05) 58,98* (41,5461,41) 45,63* (26,6446,83) 41,04 (39,7472,87)
CD3+CD4+ 47,47 (45,8959,12) 38,43* (27,5843,75) 57,2 (44,9660,61) 63,16* (62,3780,58) 57,24 (55,4377,79) 67,55 (58,7576,99) 19,58* (15,4521,12) 18,39* (9,8318,78) 20,19* (17,2932,86)
CD4+-T . naive 6,38 (4,1110,94) 7,69 (6,6718,9) 11,78 (8,6317,88) 19,5* (15,7222,74) 8,04 (4,138,56) 3,2 (2,125,49) 1,03* (0,41,5) 2,21* (1,252,67) 4,26 (3,356,74)
cd4+-tcm 21,07 (18,7426,35) 8,4* (1,3814,49) 22,85 (20,526,37) 27,75 (23,1232,39) 27,3 (19,7335,47) 25,2 (20,0331,64) 0,95* (0,78-1) 0,32* (0,270,51) 0,57* (0,461,03)
cd4+-tem 18,08 (16,7128,73) 12,34* (10,8115,26) 18,76 (15,4619,15) 18,21 (16,6127,56) 26,94 (25,4733,29) 38,64* (36,1939,34) 11,2* (10,6614,74) 3,64* (2,975,02) 4,58* (4,369,43)
CD3+CD8+ 17,15 (14,6119,39) 15,66 (15,3319,8) 21,16 (17,6622,27) 29,85* (25,4330,85) 27,63* (27,1939,57) 50,45* (38,0264,85) 35,33* (21,9335,74) 22,08 (12,7922,99) 18,92 (17,8135,7)
CD8+-T . naive 4,32 (2,45,2) 4,77 (3,3310,26) 6,35* (5,587,95) 10,89* (7,5814,51) 5,14 (3,737,28) 2,26 (1,523,27) 1,11* (0,421,51) 1,52 (1,172,76) 3,44 (2,445,32)
cd8+-tcm 8,17 (6,3610,14) 4,83 (1,56,9) 10,71 (9,4711,43) 12,93* (12,5116,41) 15,91 (11,820,78) 10,95 (8,7116,02) 2,42* (1,323,38) 0,64* (0,50,79) 0,67* (0,651,7)
CD8+-TEM 4,52 (3,85,16) 2,97* (2,793,49) 3,19* (2,423,25) 3,21 (2,084,76) 9,98* (7,68-11) 35,82* (26,544,42) 22,86* (15,423,48) 4,25 (3,815,83) 4,31 (3,249,6)
NK1.1+ 2,84 (1,043,72) 2,36 (2,072,56) 2,88 (2,284,61) 5,54* (5,377,07) 3,78 (3,384,78) 3,66 (2,953,93) 3,19 (2,133,28) 4,84 (3,426,61) 2,98 (2,023,11)
CD3+NK1.1+ 0,66 (0,250,96) 0,42 (0,320,5) 1,09 (0,631,73) 2,66* (2,123,85) 1,1 (0,881,17) 1,15* (1,001,21) 0,39 (0,280,41) 0,86 (0,811,1) 0,47 (0,450,59)
* - р < 0,05 в сравнении с контролем (0 сут).
ных субпопуляций клеток (кроме наивных Т-клеток) в ранние сроки (3-и сутки) после введения опухолевых штаммов БЬ-4. Статистически значимое увеличение численности Т-хелперов отмечалось с 7-х суток, сохраняясь до 11-х суток и достигая пика с последующим резким снижением с 12-х суток. В этот же период отмечалось статистически значимое повышение числа ЦТЛ. При этом пик численности эффекторных ЦТЛ (СБ8+-ТЕМ) на 11-е сутки 35,82 млн (26,5-44,42 млн) почти в 8 раз превосходил их численность в контроле -4,52 млн (3,8-5,16 млн) (р = 0,04).
Динамика численности НК-клеток имела волнообразный характер со снижением на 3-и сутки, возможно,
обусловленным миграцией этих клеток на периферию -к месту введения опухолевых клеток, и статистически значимым повышением на 7-е сутки. Увеличение численности НКТ-клеток в селезенке наблюдалось на 7-е и 11-е сутки после иммунизации.
На рис. 7 представлена динамика численности основных эффекторных субпопуляций лимфоцитов в селезенке мышей линии БЛЬБ/е после иммунизации опухолевым штаммом БЬ-4.
Таким образом, максимальная экспансия эффек-торных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) у мышей линии Б10.Б2 (Я101) отмечалась на 12-е сутки, а у мышей линии БЛЬБ/е - на 11-е сутки. Следова-
тельно, именно в эти сроки можно ожидать наибольший терапевтический эффект от переноса эффекторных субпопуляций ЦТЛ при проведении аллогенной адоптивной иммунотерапии.
Обсуждение
С развитием представлений о механизмах противоопухолевого иммунитета и прогрессом биотехнологий расширяются возможности терапевтического влияния на иммунную систему с целью достижением контроля над злокачественным процессом [13-17]. Современные иммунотерапевтические методы в сочетании со стандартным лечением (хирургическое удаление опухоли, химиотерапия) позволяют продлить продолжительность безрецидивного периода и улучшить качество жизни пациентов со злокачественными новообразованиями [18-20].
В настоящей работе на модели перевиваемой опухоли ЕЬ-4 нами проведено исследованиеопухоль-специфичес-кого иммунного ответа у мышей линий С57БЬ/6, В10. Б2 (Я101) и БАЬБ/с с оценкой возможности проведения сингенной и аллогенной адоптивной иммунотерапии в дальнейшем. Установлено, что первичный иммунный ответ на опухолевые штаммы ЕЬ-4 у сингенных мышей линии С57БЬ/6 заключается в увеличении численности Т-клеточных субпопуляций (центральных Т-хелперов и ЦТЛ памяти) в селезенке на 7-е сутки. Численность основной противоопухолевой субпопуляции - эффек-торных ЦТЛ также увеличивается на 7-е сутки, сохраняясь повышенной до 12-х суток. Также с 7-х суток почти в 2 раза увеличивается число НК-клеток - лимфоцитов врожденного иммунитета, осуществляющих быстрый киллинг опухоли без «двойного распознавания». Однако в случае сингенных опухолей НК-клетки, одной из функций которых является устранение опухолевых клеток, лишенных молекул МНС класса I, не работают: лимфомы устойчивы к их цитотоксическому эффекту [21, 22]. Таким образом, несмотря на увеличение численности некоторых субпопуляций лимфоцитов, первичный иммунный ответ на опухолевые клетки ЕЬ-4 у мышей линии С57БЬ/6 является неэффективным: отмечался рост опухоли и гибель мышей через 3 нед после введения опухолевых клеток. Это было показано еще в 1960-1980-е гг. Также у мышей линии С57БЬ/6, которым вводили клетки лимфомы ЕЬ-4, отмечалось снижение функциональной активности лимфоцитов селезенки в ответ на митогены -КонА и ФГА [23, 24].
Вторичный иммунный ответ на опухолевые штаммы ЕЬ-4 мы оценивали после реиммунизации мышей линии С57БЬ/6 (с предварительной перевязкой развивающейся опухоли для предупреждения ее дальнейшего распространения на 7-8-е сутки - при достижении опухолью размера 1,0 см по одному из диаметров). В данном случае отмечалось статистически зачимое снижение количества Т-лимфоцитов, Т-хелперов и эф-фекторных клеток памяти (СБ4+-ТЕМ и СБ8+-ТЕМ) в селезенке в ранние сроки после реиммунизации с даль-
Рис. 7. Динамика численности основных эффекторных субпопуляций лимфоцитов мышей БАЬБ/с, привитых ЕЬ-4 (по оси абсцисс - сутки после введения опухолевых клеток; по оси ординат - нормализованные к интактному контролю данные; * -р < 0,05 в сравнении с контролем - 0 сут)
нейшим увеличением численности всей субпопуляции цитотоксических лимфоцитов, а также числа центральных и эффекторных ЦТЛ памяти через 1 нед, причем численность эффекторных ЦТЛ памяти к 7-м суткам в селезенке превышала их количество в контроле в 2,5 раза. Как и при первичном ответе на опухоль, численность естественных киллеров увеличивалось к концу 1-й недели, сохраняясь повышенным до 12-х суток. Таким образом, отмечалось увеличение численности практически всех значимых субпопуляций ци-тотоксических клеток на 7-е сутки после реиммуни-зации ЕЬ-4. Ни у одной реиммунизированной мыши в течение срока наблюдения (400 сут) не отмечено роста опухоли.
После введения опухолевых клеток ЕЬ-4 в селезенке аллогенных мышей линии Б10.Б2 (Я101), как и у реим-мунизированных сингенных мышей, выявлено снижение численности практически всех исследованных субпопуляций клеток в ранние сроки, что, вероятно, связано с задержкой клеток в регионарных лимфатических узлах, дренирующих область введения опухолевых клеток. Обращает на себя внимание значительное увеличение численности субпопуляции центральных Т-хелперов памяти на 5-9-е сутки. Однако статистически значимое увеличение числа ЦТЛ было выявлено только на 12-е сутки после иммунизации. К этому же времени численность субпопуляции эффекторных ЦТЛ достигала своего максимального значения. Численность НК-клеток также увеличивалась только на 13-е сутки.
Введение опухолевых клеток ЕЬ-4 аллогенным мышам Б10.Б2 (Я101) и БАЬБ/с в норме приводит к развитию у них эффективного иммунного ответа, полному отторжению клеток опухоли и выживанию реципиентов с формированием у них иммунной памяти в течение первых 2 нед, причем у мышей линии Б10.Б2 (Я101) отторжение происходит несмотря на то, что трансплан-
тационные различия клеток опухоли и клеток хозяина представлены единственной молекулой гистосовмести-мости Н-2КЬ [25].
В нашем исследовании иммунный ответ на БЬ-4 у аллогенных мышей линии БЛЬБ/с заключался в статистически значимом повышении клеточности селезенки на 9-е и 11-е сутки после иммунизации. Увеличение численности Т-лимфоцитов отмечалось с конца 1-й недели и сохранялось до 13-х суток. Как и у реимму-низированных сингенных мышей и мышей линии Я101, у мышей БЛЬБ/с наблюдалось снижение численности практически всех исследованных субпопуляций клеток в ранние сроки после иммунизации. Статистически значимое увеличение численности Т-хелперов и ЦТЛ отмечалось с 7-х до 11-х суток с последующим снижением.
Заключение
Таким образом, нами исследованы условия формирования специфической цитотоксической активности противоопухолевого иммунного ответа. Было показано, что максимальная экспансия эффекторных цитотоксических Т-лимфоцитов у сингенных мышей С57БЬ/6 мышей отмечалась на 7-е сутки, а у аллогенных мышей - позже: на 11-е сутки у мышей линии БЛЬБ/с и на 12-е сутки у мышей линии Б10.Б2 (Я101), причем аллогенные Т-лимфоциты способны вызывать более интенсивный иммунный ответ. Следовательно, именно в эти сроки можно ожидать наибольший терапевтический эффект от переноса эффекторных субпопуляций ЦТЛ при проведении аллогенной адоптивной иммунотерапии.
■ Литература
1. Old L.J. Tumor immunology: the first century. Curr. Opin. Immunol. 1992; 4 (5): 603-37. DOI: https://www.doi.org/10.1016/0952-7915(92)90034-c
2. Schreiber R.D., Old L.J., Smyth M.J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 2011; 331 (6024): 1565-70. DOI: https://www.doi.org/10.1126/science. 1203486
3. Borroni E.M., Grizzi F. Cancer Immunoediting and beyond in 2021. Int. J. Mol. Sci. 2021; 22 (24): 13275. DOI: https://www.doi.org/10.3390/ ijms222413275
4. Sheu B.C., Hsu S.M., Ho H.N., Lin R.H., Huang SC. Tumor immunology - when a cancer cell meets the immune cells. J. Formos Med. Assoc. 1999; 98 (11): 730-5. PMID: 10705688.
5. June C.H. Principles of adoptive T-cell cancer therapy. J. Clin. Invest. 2007; 117 (5): 1204-12. DOI: https://www.doi.org/10.1172/J CI31446
6. Lindemann A., Herrmann F., Oster W., Mertelsmann R. Lympho-kine activated killer cells. Blut. 1989; 59 (4): 375-84. DOI: https://www. doi.org/10.1007/BF00321208
7. Paijens S.T., Vledder A., de Bruyn M., Nijman H.W. Tumor-infiltrating lymphocytes in the immunotherapy era. Cell Mol. Immunol. 2021; 18 (4): 842-59. DOI: https://www.doi.org/10.1038/s41423-020-00565-9
8. Mortezaee K., Majidpoor J. NK and cells with NK-like activities in cancer immunotherapy-clinical perspectives. Med. Oncol. 2022; 39 (9): 131. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s12032-022-01735-7
9. Johnson L.A., Morgan R.A., Dudley M.E., Cassard L., Yang J.C., Hughes M.S., Kammula U.S., Royal R.E., Sherry R.M., Wunderlich J.R., Lee C.C., Restifo N.P., Schwarz S.L., Cogdill A.P., Bishop R.J., Kim H., Brewer C.C., Rudy S.F., VanWaes C., Davis J.L., Mathur A., Ripley R.T., Nathan D.A., Laurencot C.M., Rosenberg S.A. Gene therapy with human and mouse T-cell receptors mediates cancer regression and targets normal tissues expressing cognate antigen. Blood. 2009; 114 (3): 535-46. DOI: https://www.doi.org/10.1182/blood-2009-03-211714
10. Jogalekar M.P., Rajendran R.L., Khan F., Dmello C., Ganga-daran P., Ahn B.C. CAR T-Cell-Based gene therapy for cancers: new perspectives, challenges, and clinical developments. Front Immunol. 2022; 13: 925985. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fimmu.2022.925985
11. Ottaviano G., Qasim W. Genome-Edited T Cell Therapies. Hema-tol. Oncol. Clin. North Am. 2022; 36 (4): 729-44. DOI: https://www.doi. org/10.1016/j.hoc.2022.03.006
12. Melief C.J.M., Kast W.M. T-cell immunotherapy of tumors by adoptive transfer of cytotoxic T-lymphocytes and by vaccination with minimal essential epitopes. Immunol. Rev. 1995; 146: 167-77. DOI: https:// www.doi.org/10.1111/j.1600-065x.1995.tb00081.x
13. Ahmed A., Tait S.W.G. Targeting immunogenic cell death in cancer. Mol. Oncol. 2020; 14 (12): 2994-3006. DOI: https://www.doi. org/10.1002/1878-0261.12851
14. Grivennikov S.I., Greten F.R., Karin M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 2010; 140 (6): 883-99. DOI: https://www.doi. org/10.1016/j.cell.2010.01.025
15. Aggarwal B.B., Vijayalekshmi R.V., Sung B. Targeting inflammatory pathways for prevention and therapy of cancer: short-term friend, long-term foe. Clin. Cancer Res. 2009; 15: 425-30. DOI: https://www.doi. org/10.1158/1078-0432.CCR-08-0149
16. Атауллаханов Р.И., Ушакова Е.И., Аль Худур С.А., Пичу-гин А.В., Лебедева Е.С. Перепрограммирование миелоидных клеток опухолевого микроокружения - новый подход в иммунотерапии злокачественных новообразований. Иммунология. 2022; 43 (4): 375-88. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-375-388
17. Муругина Н.Е., Муругин В.В., Пащенков М.В. Противоопухолевая активность макрофагов человека, активированных агониста-ми рецепторов NOD1 и TLR4 in vitro. Иммунология. 2022; 43 (5): 548-57. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022- 43-50-548-557.
18. Couzin-Frankel J. Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy. Science. 2013; 342 (6165): 1432-3. DOI: https://doi. org/10.1126/science.342.6165.1432
19. Dougan M., Dranoff G. Immune therapy for cancer. Annu. Rev. Immunol. 2009; 27: 83-117. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.immu-nol.021908.132544
20. St Paul M., Ohashi P.S. The roles of CD8+ T cell subsets in antitumor immunity. Trends Cell Biol. 2020; 30 (9): 695-704. DOI: https://doi. org/10.1016/j.tcb.2020.06.003
21. Oberoi P., Jabulowsky R.A., Bahr-Mahmud H., Wels W. EGFR-targeted granzyme B expressed in NK cells enhances natural cytotoxicity and mediates specific killing of tumor cells. PloS One. 2013; 8 (4): e61267. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061267
22. Smithson G., Bittick T.H., Chervenak R., Lee S.J., Wolcott R.M. The role of NK cells in the regulation of experimental metastasis in a mu-rine lymphoma system. Journal of leukocyte biology. 1991; 49 (6): 621-9. DOI: https://doi.org/10.1002/jlb.49.6.621
23. Brondz B.D. Interaction of immune lymphocytes with normal and neoplastic tissue cells. Folia. Biol. 1964; 10: 164-76. PMID: 14164363.
24. Фукс Б.Б., Малайцев В.В., Богданова И.М. Отсутствие генерализованной иммуносупрессии у мышей С57В1/6 при прогрессивном росте сингенной Т-лимфомы EL-4 и легочной карциномы Льюиса 3LL. Бюлл. экспер. биол. и мед. 1986; 101 (6): 725-8. PMID: 3089345.
25. Казанский Д.Б., Силаева Ю.Ю., Калинина А. А., Замкова М.А., Хромых Л.М., Персиянцева Н.А., Джолохава Л.Х. Трансплантационный и специфический противоопухолевый иммунитет в ретроспективе: новые модели, основанные на трансгенезе индивидуальных цепей Т-клеточного рецептора. Успехи молекулярной онкологии. 2016; 3 (1): 14-27. DOI: https://doi.org/10.17650/2313-805X-2016-3-1-14-27
■ References
1. Old L.J. Tumor immunology: the first century. Curr Opin Immunol. 1992; 4 (5): 603-37. DOI: https://doi.org/10.1016/0952-7915(92)90034-c
2. Schreiber R.D., Old L.J., Smyth M.J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 2011; 331 (6024): 1565-70. DOI: https://doi.org/10.1126/science. 1203486
3. Borroni E.M., Grizzi F. Cancer Immunoediting and beyond in 2021. Int J Mol Sci. 2021; 22 (24): 13275. DOI: https://doi.org/10.3390/ ijms222413275
4. Sheu B.C., Hsu S.M., Ho H.N., Lin R.H., Huang SC. Tumor immunology - when a cancer cell meets the immune cells. J Formos Med Assoc. 1999; 98 (11): 730-5. PMID: 10705688.
5. June C.H. Principles of adoptive T-cell cancer therapy. J Clin Invest. 2007; 117 (5): 1204-12. DOI: https://doi.org/10.1172/JCI31446
6. Lindemann A., Herrmann F., Oster W., Mertelsmann R. Lympho-kine activated killer cells. Blut. 1989; 59 (4): 375-84. DOI: https://doi. org/10.1007/BF00321208
7. Paijens S.T., Vledder A., de Bruyn M., Nijman H.W. Tumor-infiltrating lymphocytes in the immunotherapy era. Cell Mol Immunol. 2021; 18 (4): 842-59. DOI: https://doi.org/10.1038/s41423-020-00565-9
8. Mortezaee K., Majidpoor J. NK and cells with NK-like activities in cancer immunotherapy-clinical perspectives. Med Oncol. 2022; 39 (9): 131. DOI: https://doi.org/10.1007/s12032-022-01735-7
9. Johnson L.A., Morgan R.A., Dudley M.E., Cassard L., Yang J.C., Hughes M.S., Kammula U.S., Royal R.E., Sherry R.M., Wunderlich J.R., Lee C.C., Restifo N.P., Schwarz S.L., Cogdill A.P., Bishop R.J., Kim H., Brewer C.C., Rudy S.F., VanWaes C., Davis J.L., Mathur A., Ripley R.T., Nathan D.A., Laurencot C.M., Rosenberg S.A. Gene therapy with human and mouse T-cell receptors mediates cancer regression and targets normal tissues expressing cognate antigen. Blood. 2009; 114 (3): 535-46. DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2009-03-211714
10. Jogalekar M.P., Rajendran R.L., Khan F., Dmello C., Gangadaran P., Ahn B.C. CAR T-Cell-Based gene therapy for cancers: new perspectives, challenges, and clinical developments. Front Immunol. 2022; 13: 925985. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.925985
11. Ottaviano G., Qasim W. Genome-Edited T Cell Therapies. He-matol Oncol Clin North Am. 2022; 36 (4): 729-44. DOI: https://doi. org/10.1016/j.hoc.2022.03.006
12. Melief C.J.M., Kast W.M. T-cell immunotherapy of tumors by adoptive transfer of cytotoxic T-lymphocytes and by vaccination with minimal essential epitopes. Immunol Rev. 1995; 146: 167-77. DOI: https://doi. org/10.1111/j.1600-065x.1995.tb00081.x
13. Ahmed A., Tait S.W.G. Targeting immunogenic cell death in cancer. Mol Oncol. 2020; 14 (12): 2994-3006. DOI: https://doi. org/10.1002/1878-0261.12851
Сведения об авторах
Донецкова Альмира Дмитриевна - д-р мед. наук, вед. науч. сотр. ЦПЛ иммунологии ФПИ, вед. науч. сотр. лаб. дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, проф. каф. иммунологии МБФ ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, проф. каф. иммунологии Мединститута ФГАОУ ВО РУДН Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2465-2444
Никонова Маргарита Федоровна - канд. биол. наук., вед. науч. сотр. ЦПЛ иммунологии ФПИ, вед. науч. сотр. лаб. дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6780-923X
14. Grivennikov S.I., Greten F.R., Karin M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 2010; 140 (6): 883-99. DOI: https://doi.org/10.1016/j. cell.2010.01.025
15. Aggarwal B.B., Vijayalekshmi R.V., Sung B. Targeting inflammatory pathways for prevention and therapy of cancer: short-term friend, long-term foe. Clin Cancer Res. 2009; 15: 425-30. DOI: https://doi. org/10.1158/1078-0432.CCR-08-0149
16. Ataullakhanov R.I., Ushakova E.I., Al Khudhur S.A., Pichu-gin A.V., Lebedeva E.S. Reprogramming of myeloid cells of the tumor microenvironment - a new approach in the immunotherapy of malignant neoplasms. Immunologiya. 2022; 43 (4): 375-88. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-375-388 (in Russian)
17. Murugina N.E., Murugin V.V., Pashenkov M.V. Antitumor activity of human macrophages activated by NOD1 and TLR4 receptor agonists in vitro. Immunologiya. 2022; 43 (5): 548-57. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-548-557. (in Russian)
18. Couzin-Frankel J. Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy. Science. 2013; 342 (6165): 1432-3. DOI: https://doi. org/10.1126/science.342.6165.1432
19. Dougan M., Dranoff G. Immune therapy for cancer. Annu Rev Immunol. 2009; 27: 83-117. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.immu-nol.021908.132544
20. St Paul M., Ohashi P.S. The roles of CD8+ T cell subsets in antitumor immunity. Trends Cell Biol. 2020; 30 (9): 695-704. DOI: https://doi. org/10.1016/j.tcb.2020.06.003
21. Oberoi P., Jabulowsky R.A., Bahr-Mahmud H., Wels W. EGFR-targeted granzyme B expressed in NK cells enhances natural cytotoxicity and mediates specific killing of tumor cells. PloS one. 2013; 8 (4): e61267. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061267
22. Smithson G., Bittick T.H., Chervenak R., Lee S.J., Wolcott R.M. The role of NK cells in the regulation of experimental metastasis in a mu-rine lymphoma system. Journal of leukocyte biology. 1991; 49 (6): 621-9. DOI: https://doi.org/10.1002/jlb.49.6.621
23. Brondz B. D. Interaction of immune lymphocytes with normal and neoplastic tissue cells. Folia Biol. 1964; 10: 164-76. PMID: 14164363.
24. Fuks B.B., Malaitsev V.V., Bogdanova I.M. The lack of generalized immunosuppression in C57BL/6 mice during progressive growth of syngenic T lymphoma EL-4 and Lewis lung carcinoma 3LL. Biull Eksp Biol Med. 1986; 101 (6): 725-8. PMID: 3089345. (in Russian)
25. Kazanskiy D.B., Silaeva Yu.Yu., Kalinina A.A., Zamkova M.A., Khromykh L.M., Persiyantseva N.A., Dzholokhava L.H. Transplantational and specific antitumor immunity in retrospective view: new models based on transgenesis of individual chains of T-cell receptor. Uspehi Molekularnoj Onkologii. 2016; 3 (1): 14-27. DOI: https://doi.org/10.17650/2313-805X-2016-3-1-14-27 (in Russian)
Authors' information
Almira D. Donetskova - MD, PhD, Leader Researcher of Immunology Lab. of ARF, Leader Researcher of Lymphocyte Differentiation Lab. of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Prof. of Immunology Chair of MBF in N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Prof. of Immunology Chair of the Medical Institute of RUDN of the MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2465-2444
Margarita F. Nikonova - PhD, Leader Researcher of Immunology Lab. of ARF, Leader Researcher of Lymphocyte Differentiation Lab. of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6780-923X
Шарова Нина Ивановна - канд. биол. наук., вед. науч. сотр. ЦПЛ иммунологии ФПИ, вед. науч. сотр. лаб. дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6774-961X
Комогорова Виктория Вячеславовна - канд. биол. наук., вед. науч. сотр. ЦПЛ иммунологии ФПИ, ст. науч. сотр. лаб. дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3460-7981
Литвина Марина Михайловна - канд. биол. наук., вед. науч. сотр. ЦПЛ иммунологии ФПИ, ст. науч. сотр. лаб. дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-3766-9843
Гринько Екатерина Константиновна - мл. науч. сотр. лаб. дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-2771-4535
Киреев Борис Владимирович - студент-практикант лаб. дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8718-3086
Донецков Андрей Дмитриевич - учащийся-практикант лаб. дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0587-1756
Митин Александр Николаевич - канд. мед. наук, зав. ЦПЛ иммунологии ФПИ, зав. лаб. дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1333-0757
Nina I. Sharova - PhD, Leader Researcher of Immunology Lab. of ARF, Leader Researcher of Lymphocyte Differentiation Lab. of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6774-961X
Viktoriya V. Komogorova - PhD, Leader Researcher of Immunology Lab. of ARF, Senior Researcher of Lymphocyte Differentiation Lab. of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3460-7981
Marina M. Litvina - PhD, Leader Researcher of Immunology Lab. of ARF, Senior Researcher of Lymphocyte Differentiation Lab. of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-3766-9843
Ekaterina K. Grinko - Junior Researcher of Lymphocyte Differentiation Lab. of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-2771-4535
Boris V. Kireev - Student-Trainee of Lymphocyte Differentiation Lab. of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8718-3086
Andrey D. Donetskov - Learner-Trainee of Lymphocyte Differentiation Lab. of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0587-1756
Alexander N. Mitin - PhD, Head of Immunology Lab. of ARF, Head of Lymphocyte Differentiation Lab. of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1333-0757
