CC BY
72
© Коллектив авторов, 2020
Булушева И.А.1, Козлов И.Б.2, Митин А.Н.2, Коростин Д.О.1, Кофиади И.А.2
Алгоритм анализа данных N08 при оценке репертуаров Т-клеточных рецепторов, вовлеченных в противоопухолевый иммунный ответ
1 Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Репертуар Т- и В-клеточных рецепторов представлен большим числом последовательностей. В связи с этим характеристика иммунного рецепторного репертуара является сложной в техническом плане задачей. Наиболее современным методом изучения иммунных рецепторных репертуаров является Мв8-секвенирование. Для снижения риска ошибки при работе с последовательностями используются методы вычислительной биологии, упрощающие обработку больших объемов данных.
Цель исследования - разработка и апробация алгоритма анализа данных N08 для сравнительной оценки репертуаров Т-клеточных рецепторов при сингенном и аллоген-ном ответе на опухоль.
Материал и методы. В рамках настоящей работы нами создана цепочка программных сценариев, позволяющих повысить эффективность анализа репертуара Т-клеточных рецепторов. Разработанные сценарии позволяют автоматически запускать обработку «сырых» данных в программном обеспечении М10ЕС, объединять последовательности в пределах групп, проводить анализ клонального состава популяций Т-клеток с учетом специфичности иммунного ответа.
Для оценки сингенного ответа опухолевые клетки тимомы ЕЬ-4 прививали мышам линии С57БЬ/6, а для оценки аллогенного ответа - мышам линии Б10.Б2 (Я101). Для исключения аллоспецифической составляющей при аллогенном ответе на опухоль дополнительная группа животных линии Б10.Б2 (Я101) была иммунизирована нормальными тимоцитами мышей линии С57БЬ/6.
Результаты. При сравнении репертуаров Т-клеточных рецепторов в обследованных группах установлено, что противоопухолевый Т-клеточный ответ характеризуется снижением разнообразия и повышением клональности иммунного ответа на опухоль, наиболее выраженными в аллогенной группе мышей линии Б10.Б2 (Я101). Анализ противоопухолевых клонов в сингенной и аллогенной модели продемонстрировал достоверные отличия качественного состава Т-клеточного репертуара. С помощью разработанных программных сценариев проведен анализ клонального состава Т-клеточных популяций с учетом аллоспецифической составляющей иммунного ответа и установлены конкретные клоны, обеспечивающие противоопухолевый ответ в сингенной и аллогенной модели.
Заключение. В результате исследования разработан алгоритм анализа данных N08-секвенирования, прошедших обработку в программном обеспечении М10ЕС. Условия и параметры анализа апробированы в биологическом эксперименте по сравнению противоопухолевого ответа в группах мышей, иммунизированных опухолевыми клетками линии ЕЬ-4. Проведено секвенирование а- и р-цепей Т-клеточных рецепторов у иммунизированных мышей и у контрольных животных. Проведен сравнительный анализ репер-туаров Т-клеточных рецепторов у мышей в сингенной и аллогенной модели при развитии противоопухолевого иммунного ответа. Установлено, что сингенный и аллогенный противоопухолевый ответ, как и аллогенный ответ на интактную ткань, отличаются друг от друга. При этом в структуре иммунного ответа в аллогенной модели, по всей видимости, присутствуют опухоль-специфичные клоны, отсутствующие в сингенной модели.
Ключевые слова: Т-клеточный рецептор; N08; оценка репертуара Т-клеточных рецепторов, противоопухолевый иммунный ответ
Статья поступила 26.06.2020. Принята в печать 17.08.2020.
Для корреспонденции
Кофиади Илья Андреевич -доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной иммуногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] http:/orcid.com/0000-0001-9280-8282
Для цитирования: Булушева И. А., Козлов И.Б., Митин А.Н., Коростин Д.О., Кофиади И. А. Алгоритм анализа данных NGS при оценке репертуаров Т-клеточных рецепторов, вовлеченных в противоопухолевый иммунный ответ. Иммунология. 2020; 41 (5): 400-410. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-5-400-410
Финансирование. Исследование сингенного и аллогенного ответа на опухоль выполнено при финансовой поддержке Фонда перспективных исследований. Исследование по разработке алгоритма анализа данных выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-33-90076.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Bulusheva LA.1, Kozlov I.B.2, Mitin A.N.2, Korostin D.O.1, Kofiadi I.A.2
NGS data analysis algorithm for evaluating repertoire of T-cell receptors involved in the antitumor immune response
1 Center for High Precision Editing and Genetic Technologies for Biomedicine of N.I. Pirogov Russian National Research Medical University of Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
2 National Research Center Institute of Immunology of the Federal Medical and Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. The repertoire of T- and B cellular receptors is represented by a large number
of sequences. Therefore, the characterization of the immune receptor repertoire is a technically
difficult task. The most advanced method of analyzing the immune receptor repertoires is NGS
sequencing. To reduce the risk of error when working with sequences, computational biology
methods are used, which simplify the processing of large amounts of data.
Aim of study - development and testing of NGS data analysis algorithm for comparative
evaluation of the T-cell receptor repertoire in syngeneic and allogeneic responses to the tumor. , , .,
,-,• ?, • http:/orcidxom/0000-0001-9280-8282
Material and methods. As a part of this work we have created a chain of program scenarios
that allow to increase the efficiency of analyzing the repertoire of T-cell receptors. The developed scenarios allow us to automatically start processing of «raw» data in MIGEC software, merge sequences within groups, and analyze clonal composition of T-cell populations taking into account the specificity of the immune response. The conditions and parameters of the analysis have been tested in a biological experiment in comparison with the antitumor response in groups of mice immunized by EL-4 line tumor cells.
Tumor cells of EL-4 line were grafted into C57BL/6 mice to evaluate the syngeneic response, and tumor cells of B10.D2 (R101) line were grafted into B10.D2 (R101) mice to evaluate the allogeneic response. To exclude allospecific component in allogeneic response to the tumor, an additional group of animals of B10.D2 (R101) line was immunized with normal thymocytes of C57BL/6 mice.
Results. When comparing the repertoire of T-cell receptors in the examined groups, it was found that the antitumor T-cell response is characterized by a decrease in diversity and an increase in the clonality of the immune response to the tumor, most pronounced in the allogeneic group of B10.D2 (R101) mice. The analysis of antitumor clones in the syngeneic and allogeneic models showed reliable differences in qualitative composition of T-cell repertoire. Using the developed program scenarios, the clonal composition of T-cell populations was analyzed, taking into account the allospecific component of the immune response, and specific clones providing antitumor response in the syngeneic and allogeneic models were identified.
Conclusion. As a result of the research, an algorithm for analyzing the data of NGS-sequencing processed in MIGEC software was created. The conditions and parameters of the analysis were tested in a biological experiment in comparison with the antitumor response in groups of mice immunized by EL-4 line tumor cells. T-cell receptor sequencing of a- and P-chains in immunized mice and control animals were performed. A comparative analysis of repertoire of T-cell receptors in mice in a syngeneic and allogeneic model in the development of antitumor immune response was carried out. It was found that the syngeneic and alloge-neic antitumor response, as well as allogeneic response to intact tissue, differ from each other. The structure of the immune response in the allogeneic model seems to contain tumor-specific clones that are absent in the syngeneic model.
For correspondence
Ilya A. Kofiadi - Dr. Sci., Head of the Laboratory of Molecular Immunogenetics of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected]
Keywords: T-cell receptor; NGS; evaluation of TCR repertoire; antitumor immune response
Received 26.06.2020. Accepted 17.08.2020.
For citation: Bulusheva I.A., Kozlov I.B., Mitin A.N., Korostin D.O., Kofiadi I.A. NGS data analysis algorithm for evaluating repertoire of T-cell receptors involved in the antitumor immune response. Immunologiya. 2020; 41 (5): 400-10. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-5-400-410 (in Russian)
Funding. The investigation of the syngeneic and allogeneic response to the tumor was carried out with financial support from the Perspective Research Foundation. Research to develop an algorithm for data analysis was carried out with financial support from RFBR under scientific project No. 19-33-90076.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Введение
Эффективность иммунного ответа зависит от предшествующего «антигенного опыта», физических и клинических параметров (пол, возраст, наличие иммунной патологии), а также генетических факторов. Вместе они формируют уникальный репертуар Т- и В-клеточных рецепторов у позвоночных, использующих RAG-зависимую рекомбинацию при формировании клеток адаптивного иммунитета [1].
В настоящее время данные о структуре и динамике иммунных репертуаров находят практическое применение в области иммунотерапии онкологических заболеваний [2, 3]. В частности, исследование иммунных репертуаров представляет интерес при разработке и оптимизации методик адоптивной иммунотерапии опухолей [4, 5]. В ряде исследований была показана применимость этого метода, однако вопрос повышения эффективности адоптивной иммунотерапии остается открытым [6]. Некоторые исследования указывают на усиление противоопухолевого иммунного ответа, связанное с развитием аллогенной иммунной реакции [7, 8]. Однако подробная структура Т-клеточного иммунного ответа в условиях развития такой реакции до сих пор не охарактеризована. Является ли аллогенный иммунный ответ одновременно и противоопухолевым? Если аллоспецифическая и противоопухолевая реакция опосредованы различными клонами, можно ли провести четкую границу между ними? Можно ли использовать опухоль-специфичные клоны для повышения эффективности иммунотерапии? На сегодняшний день на эти вопросы нет ответов.
Во многом недостаточная изученность иммунного рецепторного репертуара при иммунотерапии связана с методическими сложностями при анализе. С развитием технологии высокоэффективного параллельного секве-нирования (Next Generation Sequencing, NGS) методические ограничения во многом оказались сняты. Однако базовые технологии обработки данных NGS не позволяют полностью избавиться от ошибок, накопленных в ходе пробоподготовки и секвенирования, без потерь реального разнообразия. Для решения этой проблемы было разработано несколько алгоритмов, позволяющих повысить качество «сырых» данных [9-11]. Однако дальнейшие цели и задачи конкретных исследований могут сильно отличаться, поэтому универсального алгоритма работы с последовательностями на сегодняшний день нет. Не-
обходимость работы с большими объемами данных, объединение и исключение последовательностей в пределах сравниваемых групп, визуализация результатов анализа требуют привлечения значительного информационного ресурса и наличия базовых навыков программирования и тем самым ограничивают возможности практического применения метода NGS для характеристики иммунного рецепторного репертуара.
Наличие программного сценария, позволяющего оперировать «сырыми» и обработанными данными, значительно упрощает анализ. В связи с этим целью нашей работы стала разработка и апробация собственного алгоритма анализа данных NGS для оценки репер-туаров Т-клеточных рецепторов (ТКР), работающего в комплексе с программой MIGEC. В результате исследования созданы системы уникальных названий образцов для работы с данными из разных запусков секвена-тора и упорядочивания данных секвенирования. Также создан автоматизированный программный сценарий, позволяющий скачать, упорядочить и проанализировать данные по каждому образцу с помощью программы MIGEC и самостоятельно написанных программных сценариев. С помощью разработанных программных сценариев проведен сравнительный анализ репертуаров ТКР при развитии противоопухолевого ответа у мышей в сингенной и аллогенной модели.
Материал и методы
Экспериментальные животные. Исследование проводили на самках конвенциональных мышей линии C57BL/6, полученных из питомника «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России, а также на конвенциональных мышах линии В10.Б2 (R.101), любезно предоставленных экспериментально-биологической лабораторией ФГБУ «НМИЦ онкологии им Н.Н. Блохина» Минздрава России.
Культура опухолевых клеток. Клетки опухолевого штамма EL-4, использованные в настоящей работе, были получены из коллекции опухолевых штаммов, созданной в экспериментально-биологической лаборатории ФГБУ «НМИЦ онкологии им Н.Н. Блохина» Минздрава России.
Иммунизация экспериментальных животных. Для оценки сингенного иммунного ответа мышей линии C57BL/6 иммунизировали живыми клетками опухолевого штамма EL-4 внутрикожно в дозе 0,1 млн
клеток на мышь. При достижении опухолью размера 1,0 см по одному из диаметров ее плотно перевязывали для предупреждения дальнейшего распространения. Мышей линий Б10.Б2 (Я101) иммунизировали живыми клетками опухолевого штамма БЬ-4 или нормальными тимоцитами мыши линии С57БЬ/6 внутрибрюшинно в дозе 10,0 млн клеток на мышь. Через 2 мес сингенных и аллогенных животных реиммунизировали путем подкожного введения клеток опухолевого штамма БЬ-4 или нормальных тимоцитов мыши линии С57БЬ/6 в дозе 1,0 млн клеток на мышь. На 9-е сутки после реиммуни-зации животных забивали и извлекали селезенку.
Секвенирование. При подготовке образцов к сек-венированию селезенку мышей освобождали от соединительной ткани, суспензировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с добавлением 0,1 % БСА и 2 мМ ЭДТА, удаляли эритроциты с помощью лизирующего буфера (еВюБаеисе, США), дважды отмывали ФСБ. Численность клеток определяли путем подсчета в камере Горя-ева. Полученные на пике иммунного ответа спленоциты лизировали с выделением РНК методом фенол-хлороформной экстракции (реагент Тп7о1, АшЫоп, США). Библиотеки кДНК вариабельных фрагментов а- и р-цепей ТКР готовили в соответствии с протоколом, описанным ранее [12]. В итоге для анализа было собрано 40 образцов от 5 групп мышей:
1) «В6» - интактные мыши линии С57БЬ/6 (10 образцов);
2) «В6 + БЬ-4» - мыши линии С57БЬ/6, иммунизированные БЬ-4 (10 образцов);
3) «Я101» - интактные мыши линии Б10.Б2 (Я101) (10 образцов);
4) «Я101 + БЬ-4» - мыши линии Б10.Б2 (Я101), иммунизированные БЬ-4 (5 образцов);
Таблица 1. Образцы, включенные в исследование
Линия Иммуниза- Имму- Количе-
мышеи ция EL4 низация ство
тимоцитами
C57BL/6 - - 10
C57BL/6 + - 10
R101 - - 10
R101 + - 5
R101 - + 5
5) «R101 + Тц-В6» - мыши линии B10.D2 (R101), иммунизированные тимоцитами мышей линии C57BL/6 (5 образцов).
Всего было собрано 40 образцов (табл.1).
Для проведения секвенирования фрагментов CDR3 генов а- и р-цепей ТКР было подготовлено 80 библиотек кДНК (по 2 для каждого образца) в соответствии с протоколом, описанным ранее [11, 12]. Олигонуклео-тиды для подготовки библиотек были любезно предоставлены лабораторией геномики адаптивного иммунного ответа Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.
Качество приготовления библиотек кДНК определяли с помощью капиллярного гель-электрофореза на приборе Bioanalyzer 2100 (Agilent, США). Распределение фрагментов в подготовленных библиотеках соответствовало ожидаемому (рис. 1).
Секвенирование проводили на платформах Illumina MiSeq и Illumina HiSeq (США) в соответствии с инструкцией производителя. Оборудование для проведения секвенирования было предоставлено Центром высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пи-рогова Минздрава России.
[FU]
35 100 200 300 400 500 700 2000 10 380 [п.н.]
Рис. 1. Распределение длин фрагментов одной библиотеки репертуаров T-клеточных рецепторов, полученное с помощью капиллярного гель-электрофореза на Agilent Bioanalyzer 2100
Основной пик имеет длину 640 п.н., что соответствует ожидаемому размеру.
Программное обеспечение и статистическая обработка. Для обработки «сырых» данных использовали программу MIGEC [10]. Программа позволяет кластеризовать последовательности в соответствии с уникальным молекулярным бар-кодом и удалить ошибки, накопленные в ходе секвенирования. Для оценки разнообразия ТКР использовали индекс разнообразия Шеннона. Расчет проводили по следующей формуле:
H = - Yfi = 1 (Pi*In Pi),
где H - индекс разнообразия Шеннона; X = сумма от клона 1 до клона S; S - количество клонов; Pi - доля конкретной последовательности в популяции. Для оценки достоверности отличий и вычисления p был использован ^/-критерий Манна-Уитни.
Результаты
Секвенирование образцов
Для оценки качества подготовки библиотек было проведено секвенирование на приборе Illumina MiSeq в режиме парноконцевого чтения с двумя бар-кодами. Результаты анализа представленности «сырых» данных по образцам приведены в табл. 2.
Данные секвенирования на платформе MiSeq были подвергнуты анализу в программе MIGEC. В результате доля клонотипов, прошедших встроенные в программу фильтры, составила от 81 до 94 %, что говорит о высоком качестве полученных библиотек.
Для получения полных данных по иммунным реперту-арам было проведено 3 последовательных секвенирования полученных библиотек кДНК на приборе Illumina HiSeq в режиме парноконцевого прочтения. В среднем количество прочтений на каждую библиотеку составило 12 194 300 шт.
(минимум 2 095 225, максимум 31 637 095 шт.). Таким образом, были получены данные, достаточные для полной характеристики иммунных рецепторных репертуаров.
Разработка алгоритма анализа данных высокоэффективного параллельного секвенирования иммунных рецепторных репертуаров
В качестве хранилища данных, полученных в результате секвенирования, использовали облачное хранилище basespace. Для скачивания данных из хранилища было необходимо решить проблемы совпадения названий файлов из разных запусков секвенирования и неупорядоченности названия файлов. Также большое количество данных (960 конечных fastq.gz-файлов, рис. 2) потребовало создания программного сценария для автоматизации скачивания и «сшивания» данных для а-и р-цепей каждого из 40 образцов.
Для решения этих проблем были введены универсальные названия образцов формата «дата_номер_цепь» (например, «05092019_1_а»), был написан программный сценарий (язык Python), соотносящий между собой названия файлов, ссылки на данные хранилища basespace и названия образцов и создающий универсальную структуру данных, где в каждой строке указана информация по образцу, а по столбцам - дата, номер и уникальное название образца с 12 ссылками для скачивания последовательностей а- и р-цепей ТКР (по 6 для каждой цепи).
Для упорядочивания данных по образцам была создана единая архитектура хранения: корневая папка, совпадающая по названию с универсальным названием образца, содержащая папки для а- и р-цепей, включающие 3 папки (по одной для каждого из проведенных запусков секвенирования) (рис. 3).
ID библио- Количество необработан- Количество необработанных прочте- Доля прочтений, прошед-
теки ных прочтении ний, прошедших фильтрацию ших фильтрацию, %
05092019 1 а 2847 2788 97,9
05092019 2 а 1545 1504 97,3
05092019 3 а 1465 1440 98,3
05092019 4 а 1694 1657 97,8
05092019 5 а 1468 1433 97,6
05092019 6 а 2481 2410 97,1
05092019 7 а 1098 1066 97,1
05092019 8 а 646 630 97,5
05092019 9 а 1457 1420 97,5
05092019 10 а 634 617 97,3
05092019 1 в 2628 2562 97,5
05092019 2 в 1590 1561 98,2
05092019 3 в 2225 2177 97,8
05092019 4 в 1480 1447 97,8
05092019 5 в 2052 2016 98,2
05092019 6 в 3204 3132 97,8
05092019 7 в 1275 1241 97,3
05092019 8 в 1239 1220 98,5
05092019 9 в 858 832 97,0
05092019 10 в 826 804 97,3
16012020 1 а 5136 5035 98,0
Таблица 2. Количество прочтений и качество данных, полученных при секвенировании на платформе Illumina MiSeq
Окончание табл. 2
ID библио- Количество необработан- Количество необработанных прочте- Доля прочтений, прошед-
теки ных прочтении ний, прошедших фильтрацию ших фильтрацию, %
16012020 2 а 5617 5510 98,1
16012020 3 а 3942 3857 97,8
16012020 4 а 5401 5280 97,8
16012020 5 а 6776 6586 97,2
16012020 6 а 6839 6728 98,4
16012020 7 а 5387 5268 97,8
16012020 8 а 5057 4961 98,1
16012020 9 а 6083 5953 97,9
16012020 10 а 5763 5657 98,2
16012020 1 ß 3724 3660 98,3
16012020 2 ß 4643 4556 98,1
16012020 3 ß 4173 4104 98,3
16012020 4 ß 4574 4469 97,7
16012020 5 ß 5957 5854 98,3
16012020 6 ß 7124 6960 97,7
16012020 7 ß 4769 4660 97,7
16012020 8 ß 5032 4925 97,9
16012020 9 ß 6562 6374 97,1
16012020 10 ß 5190 5088 98,0
18112019 1 а 1229 1205 98,0
18112019 2 а 2252 2206 98,0
18112019 3 а 1963 1921 97,9
18112019 4 а 1722 1691 98,2
18112019 5 а 1943 1897 97,6
18112019 6 а 2576 2525 98,0
18112019 7 а 2582 2531 98,0
18112019 8 а 2381 2333 98,0
18112019 9 а 656 647 98,6
18112019 10 а 1155 1132 98,0
18112019 1 ß 1249 1225 98,1
18112019 2 ß 1794 1746 97,3
18112019 3 ß 1939 1901 98,0
18112019 4 ß 2157 2113 98,0
18112019 5 ß 1785 1754 98,3
18112019 6 ß 2865 2789 97,3
18112019 7 ß 1356 1324 97,6
18112019 8 ß 2280 2227 97,7
18112019 9 ß 484 474 97,9
18112019 10 ß 910 879 96,6
27112019 1 а 2017 1960 97,2
27112019 2 а 1809 1760 97,3
27112019 3 а 2067 2024 97,9
27112019 4 а 1585 1473 92,9
27112019 5 а 1340 1308 97,6
27112019 6 а 2215 2158 97,4
27112019 7 а 1849 1800 97,3
27112019 8 а 2474 2421 97,9
27112019 9 а 2386 2331 97,7
27112019 10 а 2357 2317 98,3
27112019 1 ß 2254 2186 97,0
27112019 2 ß 1851 1809 97,7
27112019 3 ß 1532 1489 97,2
27112019 4 ß 1982 1946 98,2
27112019 5 ß 1090 1062 97,4
27112019 6 ß 2039 1985 97,4
27112019 7 ß 2441 2379 97,5
27112019 8 ß 1932 1889 97,8
27112019 9 ß 3240 3178 98,1
27112019 10 ß 2038 2013 98,8
data structure
run 1 run 2 run 3
alpha beta
L001 L002 R1 R2
480 basespace id = 960 fastq.gz
Рис. 2. Структура данных, полученных в результате трех независимых запусков секвенирования (run 1, run 2, run 3) для пар-ноконцевых прочтений а- и ß-цепей Т-клеточных рецепторов
Данная архитектура создается автоматически с помощью разработанного нами программного сценария в начале работы с образцом (язык Bash). Еще один сценарий (язык Bash) находит ссылки на хранилище basespace для соответствующего образца и скачивает последовательности в папки созданной архитектуры. Затем файлы сшиваются сначала в рамках одного запуска секвенирования, а затем для всех 3 запусков. В итоге в корневой папке образца формируются 2 файла (правое и левое прочтения) для а-цепи и ß-цепи (всего 4 файла). Таким образом, разработанная совокупность программных сценариев позволяет объединить файлы без потери данных и сократить количество файлов с 24 для каждого образца до 4 файлов, необходимых для корректного иммунологического анализа.
На следующем этапе был написан программный сценарий, позволяющий автоматизировать процесс обработки «сырых» данных с помощью программы MIGEC. Его суть заключается в создании 2 txt-файлов в корневой папке образца, загружаемых в программу MIGEC, за- 18112019_10_
18112019_10_alpha
run 1
run 2
run 3
- 18112019_10_beta
run 1
run 2
run 3
assembly cdrblastbatch —>- cdrblastbatch.txt
cdrfinal checkout histogram ->- micetable.txt
Рис. 4. Архитектура хранения «сырых» и обработанных с помощью программы MiGEC данных
2 txt-файла, подаваемые на вход MIGEC отмечены стрелками. Запуск команд MIGEC, сопровождающихся созданием 5 папок (отмечены зеленым цветом). Необходимые «сырые» данные находятся в той же корневой папке (отмечены оранжевой рамкой).
- 18112019_10
-18112019_10_alpha
run 1 run 2 run 3 18112019_10_beta run 1 run 2 run 3
Рис. 3. Пример архитектуры хранения данных для одного образца
пуске команд М10ЕС, сопровождающемся созданием 5 папок. Необходимые «сырые» данные находятся в той же корневой папке. Итоговые обработанные данные загружаются в папку cdrfinal (рис. 4). Разработанные сценарии, объединенные в единый код, доступны для скачивания (Шр8:/^1ШиЪ.сот^епотесеп1ег/ТСК_а1Ис1е_2020).
Сравнительный анализ репертуаров Т-клеточных рецепторов у мышей в сингенной и аллогенной моделях при развитии противоопухолевого иммунного ответа
Разнообразие Т-клеточного ответа на опухоль EL-4
С помощью разработанного алгоритма была проведена оценка разнообразия репертуаров ТКР - количества уникальных клонотипов внутри образца. Для оценки ответа группы мышей использовали пулированные данные по группам. Объединение в данном случае подразумевает исключение повторяющихся клонов с формированием общей выборки, по сути, единого образца, характеризующегося нормированным по числу клонов разнообразием. Проводили сравнение для следующих групп:
1) 1+2 (сингенная модель)
2) 3+4+5 (иммунизация ЕЬ-4 и тимоцитами в алло-генной модели)
Результаты сравнения представлены на рис. 5.
Для оценки достоверности отличий использовали индекс разнообразия Шеннона (Н). Этот индекс обычно используется для характеристики видового разнообразия в сообществе. Индекс Шеннона учитывает как численность, так и равномерность присутствующих видов. В случае с оценкой разнообразия за «вид» берется конкретный клонотип, 8 - общая совокупность клонотипов с учетом их долей в данном пулированном образце. По результатам анализа при одинаковом разнообразии для сравниваемых групп значение равномерности колебалось в диапазоне от 0,79 до 0,82, что говорит о наличии клонотипов, сильно выдающихся по количеству в общей массе, и о наличии большого числа клоноти-пов, присутствующих в незначительном количестве.
Для вычисления р был использован ^/-критерий Манна-Уитни. ^/-критерий Манна-Уитни позволяет сравнивать 2 группы данных, которые распределены не-
э
200 000
я 150 000
& ю
§ 100 000 и
50 000
Э
— 1 а1рИа
- ■ - тах 1 — 2 а1рИа 11рИа
- ■ - тт 2 ■ - тах 2 1рИа 11рИа
300 000
250 000
(и X
3 200 000
а
ю
§ 150 000 В
$ 100 000
50 000
- 3 а1рИа
- - тах 3 а1рИа
- - -тт 4 а1рИа
-5 а1рИа
- - - тах 5 а1р^а
Количество прочтений
Количество прочтений
Рис. 5. Результаты оценки разнообразия а-цепей Т-клеточного рецептора в сингенной (А) и аллогенной модели (Б)
0
0
нормально. При оценке 20 000 наиболее представленных клонотипов при попарном сравнении групп 1+2, 2+4, 3+4, 4+5, 3+5 результаты, представленные в табл. 3.
Таким образом, все пулированные образцы достоверно отличаются между собой и процесс формирования набора клонотипов не является случайным.
Клональность Т-клеточного ответа на опухоль ЕЬ-4
Второй важный показатель, который был получен при оценке репертуара ТКР исследуемых групп - клональ-ность - мера распространенности определенного клона. Разнообразие и клональность являются связанными характеристиками репертуаров. Высокое разнообразие всегда связано с низкой клональностью и наоборот.
По результатам оценки клональности Т-клеточного ответа было установлено, что модификация противоопухолевого ответа происходила за счет наиболее представленных клонов. Это наблюдение справедливо для всех сравниваемых групп интактных и иммунизированных мышей, однако наибольшее усиление клональ-ности иммунного ответа происходило в аллогенной группе мышей линии Б10.Б2 (Я101), иммунизированных БЬ-4, даже при сравнении с собственно аллогенной реакцией - ответом на интактные тимоциты мышей линии С57БЬ/6 (рис. 6).
Анализ 20 наиболее представленных клонов показал, что по качественным характеристикам репертуары в сингенной и аллогенной моделях практически не пересекаются (рис. 7).
Включение в исследование группы мышей, иммунизированных только аллогенными интактными тимо-цитами, позволило нам провести анализ репертуаров на наличие опухоль-специфичных клонов. Для этого нами был разработан программный сценарий, позволяющий обнаружить и «вычесть» аллоспецифичные клоны из репертуара группы с аллогенным иммунным ответом на опухоль. В результате такого «вычитания» оставшиеся клоны потенциально являются опухоль-специфичными. В табл. 4 указаны последовательности наиболее представленных клонов, полученных после коррекции на аллоспецифический иммунный ответ.
Нами был проведен анализ этих последовательностей с помощью базы данных УОШЬ и установлено, что 2 клона из выделенной нами группы - СА88РОрМТБУЕР и СА88ЬООрМТЬУБ - были описаны ранее как противоопухолевые [13].
Обсуждение
В ходе проведенного исследования нами разработан программный алгоритм, позволяющий упростить и повысить эффективность анализа иммунного рецеп-торного репертуара. Создана единая архитектура и номенклатура образцов, разработан программный сценарий, создающий единую таблицу ссылок, разработаны 2 сценария для скачивания и комбинирования данных для каждого образца и создан сценарий, объединяющий все необходимые команды программы МЮБС. Данные программные сценарии объединены в единый код, запускаемый однократно и позволяющий сделать последовательный анализ от стадии «сырые данные» до стадии «полный обсчет образца» по введенным на входе 2 параметрам - дате и номеру образца. С помощью разработанного алгоритма был получен полный анализ для всех 40 образцов, включенных в исследование.
При анализе разнообразия в группах интактных и иммунизированных клетками опухолевой линии БЬ-4 мышей линии С57БЬ/6 установлена тенденция к уменьшению числа уникальных клонов у иммунизированных мышей (снижение разнообразия). Это может
Таблица 3. Результаты оценки 20 000 наиболее представленных клонотипов при попарном сравнении групп 1+2, 2+4, 3+4, 4+5, 3+5
Сравниваемые группы Р
1+2 0,00011128360323910641
2+4 2,6996821619839285е-23
3+4 2,8051445012743816е-39
4+5 2,8520770439120307е-17
3+5 1,0767775785964648е-07
1,00-
0,75-
о
с -
о
! 0,50-
Я
« 0,25-
II
Ч
0,00
■ Редкий (0<Х<=1е-05)
□ Малый (1е-05<Х<=1е-04)
□ Средний (1е-04<Х<=0,001)
□ Большой (0,001<Х<=0,01) | Сверхпредставленный
(0,01<Х<=1)
СЗ сЗ сЗ сЗ СЗ СЗ сЗ сЗ
0 _1 1_1 01 2 1 01 т 1 01 1_4 01 5 1 01 ЧО 1 01 7 1 01 оо 1 01 1 01 1_1 2 1 т 1 1_4 5 1 ЧО 1 7 1 оо 1 сл 1
© ч© ч© ч© ч© ЧО ЧО ЧО ЧО ЧО 71 2 азец 71 2 71 2 71 2 71 2 71 2 71 2 71 2 71 2
— Обр 27
Группа Я101 Я101 + БЬ-4 Я101 + Тц-В6
Рис. 6. Сравнение клональности противоопухолевого иммунного ответа в группах интактных аллогенных мышей линии Б10.Б2 (Ю01), иммунизированных БЬ-4 (+БЬ-4) и нормальными тимоцитами мышей линии С57БЬ/6 (+Тц В6)
быть обусловлено относительным увеличением размеров клонов, вовлеченных в опухоль-специфический иммунный ответ.
При анализе разнообразия ТКР аллогенных по отношению к опухолевой линии БЬ-4 мышей линии Б10.Б2 (Я101) [интактные Б10.Б2 (Я101), иммунизированные БЬ-4, иммунизированные тимоцитами С57БЬ/6] обнаружены более значительные отличия по сравнению с сингенной группой. Разнообразие также снижено у иммунизированных мышей по сравнению с интактной группой, при этом у мышей, иммунизированных опухолевыми клетками (БЬ-4), в большей степени, чем у мышей, иммунизированных нормальными тимоцитами мышей линии С57БЬ/6.
Анализ 20 наиболее представленных клонов при сравнении аллогенного ответа на опухоль с синген-ным противоопухолевым и аллоспецифическим от-
ветом на нормальные тимоциты продемонстрировал значительные отличия в качественном составе репер-туаров ТКР у иммунизированных животных - последовательности практически не перекрывались. Таким образом, можно предполагать, что в репертуаре мышей Б10.Б2 (Я101), иммунизированных БЬ-4, присутствовали уникальные клоны Т-клеток, которые обладали противоопухолевой специфичностью, не являлись ал-лореактивными и, таким образом, потенциально могут быть использованы при аллогенной адоптивной иммунотерапии.
Выполненная оценка репертуаров ТКР доказала целесообразность использования аллогенных опухоль-специфических Т-клеток для адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований при условии индукции толерантности к клеткам донора и удаления аллореак-тивных популяций из пула трансплантируемых клеток.
ЧО И +EL-4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ■ ■ 2. " ■1 Уникальные последовательности а-цепей ТКР для аллогенной адаптивной иммунотерапии - 2,0 |- 2,5 1- 3,0 Г 4,0 4,5
о 2 +EL-4 1 2 3 4 5 э 1 _ ■ ■
+Тц/B6 6 7 8 9 10 р| г ■ ^
Линия Иммун. г САЗОБАОШУЕдУР -САЗЗЬШаМЪУР -САЕдрр -САЗзратааУЕдур-САЗзрадуЕдур -САЗззатааУЕдур-САЗзьатааУЕдур-САЗЗЬОАЫГЕУРР -САЗЗдАваУАЕдрр -САВвдатаУАЕдрБ-САЗзьадуЕдур-САЗЗРЗЗУЕдУР -САЗЗРОдЫГЕУРР -САЗзатааУЕдур-САЗзьаадытьур -САЗЗРБЗЗаытЬУР -САЗзьадытЕУРР -САЗзьдаыУАЕдрр -САЗзьааыУАЕдрр -САЗЗЬБШаМЪУР -САЗЗЬУОЗАЕтЬУР -САЗОБЫУЕдУР -СТгаАБКРУЕдУР -САЗЗБАООБтЕУРР -САЗЮЫУЕдУР -СтСЗАаааУАЕдрр -САЗЗЬАктадмъУР -САЗОЕтАУЕдУР -САВвааууАЕдрр -САВВРВУЕдУР -CTCSADWIDAEдрР -САВвртадАРЬР -СтСЗАБКУаытЬУР -CASSWTNYAEQFF -CASsрDwаарEдур -СОАкдадытьУР -СтСЗАОЬаЗЗАЕтЬУР -САЗЗРаьУАЕдрр-СтСЗАяаАдБтьур -САЗОРаааытьур -СтСЗАБУЕдУР -САЗЗБУАЕдрр -САЗОБАдЫУАЕдрр -САЕдрр -САЗЗдБОтОРУР -САЗЗОтЕЫЗОЫтЬУР -CAWSLTааAYEдУF -СОАядаУАЕдрр -CAWSQGSSYEQYF -САЗЗЮЗУАЕдрр -САЗЗдБааьЕдур -СОАВ.даАЕШУР -САЗЗьаакЗУЕдур -СЗЗЗдтатакаЕдУР -САЗЗРБЫУЕдУР -CASSWааAETLУF -CASGDWGRNTLУF -САЗЗдБЗатЕУРР -
Рис. 7. 20 наиболее представленных клонов по экспрессии вариабельных участков а-цепи Т-клеточного рецептора (ТКР) при сингенном (Б6) и аллогенном (Д101) иммунном ответе на БЬ-4 (+БЬ-4) и аллогенном ответе на нормальные тимоциты мышей С57БЬ/6 (+Тц/Б6)
Таблица 4. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности СБЯЗ-участков Р-цепи Т-клеточного рецептора наиболее представленных клонов для выборки из группы аллогенных мышей B10.D2 (R101), иммунизированных EL-4
Количество Частота Нуклеотидная последовательность Аминокислотная последовательность
105222 0,00551 TGTGCCAGCGGTGATGCAGGCAACTCCTATGAACAGTACTTC CASGDAGNSYEQYF
86199 0,004514 TGTGCCAGCTCTCTCCATTCTGGAAATACGCTCTATTTT CASSLHSGNTLYF
81852 0,004287 TGTGCTAGCAGTCCCGGGACTGGGGGGTATGAACAGTACTTC CASSPGTGGYEQYF
60405 0,003163 TGTGCCAGCAGCCCGGGACAGTATGAACAGTACTTC CASSPGQYEQYF
53803 0,002818 TGTGCCAGCAGTTCCGGGACTGGGGGGTATGAACAGTACTTC CASSSGTGGYEQYF
49456 0,00259 TGTGCCAGCAGTTTAGGGACTGGGGGATATGAACAGTACTTC CASSLGTGGYEQYF
49238 0,002579 TGTGCTAGCAGTTTAGGAGCAAACACAGAAGTCTTCTTT CASSLGANTEVFF
46942 0,002458 TGTGCCAGCAGCCAAGCCAGGGGCTATGCTGAGCAGTTCTTC CASSQARGYAEQFF
42195 0,00221 TGTGCCAGCAGCCAGGGGACTGGGTATGCTGAGCAGTTCTTC CASSQGTGYAEQFF
42006 0,0022 TGTGCCAGCAGTCTGGGACAGTATGAACAGTACTTC CASSLGQYEQYF
38061 0,001993 TGTGCCAGCAGCCCGAGCTCCTATGAACAGTACTTC CASSPSSYEQYF
37975 0,001989 TGTGCCAGCAGTCCGGGACAGAACACAGAAGTCTTCTTT CASSPGQNTEVFF
36880 0,001931 TGTGCCAGCAGTGGGACTGGAGGCTATGAACAGTACTTC CASSGTGGYEQYF
35086 0,001837 TGTGCCAGCTCTCTCGGCGGGCAAAACACCTTGTACTTT CASSLGGQNTLYF
35014 0,001834 TGTGCCAGCAGCCCGGACAGTTCTGGAAATACGCTCTATTTT CASSPDSSGNTLYF
32910 0,001723 TGTGCCAGCTCTCTCGGACAAAACACAGAAGTCTTCTTT CASSLGQNTEVFF
31052 0,001626 TGTGCCAGCTCCCTCCAGGGGAACTATGCTGAGCAGTTCTTC CASSLQGNYAEQFF
30707 0,001608 TGTGCCAGCTCTCTCGGGGGTAACTATGCTGAGCAGTTCTTC CASSLGGNYAEQFF
30302 0,001587 TGTGCCAGCTCTCTCGACAATTCTGGAAATACGCTCTATTTT CASSLDNSGNTLYF
Заключение
Созданный нами алгоритм анализа данных высокоэффективного параллельного секвенирования позволяет запускать обработку «сырых» данных в программном обеспечении MIGEC, объединять последовательности в пределах групп, производить анализ клонального состава популяций Т-клеток и оценивать отличия между сравниваемыми группами. Алгоритм апробирован в эксперименте по сравнению противоопухолевого ответа в группах мышей, иммунизированных опухолевыми клетками линии EL-4. Проведено секвенирование а- и р-цепей Т-клеточных рецепторов у иммунизированных мышей и у контрольных животных. Проведен сравнительный анализ репертуаров Т-клеточных рецепторов у мышей в сингенной и аллогенной моделях при развитии противоопухолевого иммунного ответа. Уста-
■ Литература
1. Алексеев Л.П., Хаитов Р.М., Долбин А.Г., Болдырева М.Н., Алесеева П. Л., Трофимов Д.Ю. и др. Иммуногенетика человека и клиническая трансплантация органов в России. Иммунология. 2015; 36 (2): 76-89.
2. Han Y., Li H., Guan Y., Huang J. Immune repertoire: A potential biomarker and therapeutic for hepatocellular carcinoma. Cancer Lett. 2016; 379 36 (2): 206-12.
3. Ye B., Smerin D., Gao Q., Kang C., Xiong X. High-throughput sequencing of the immune repertoire in oncology: applications for clinical diagnosis, monitoring, and immunotherapies. Cancer Lett. 2018; 416: 42-56.
4. Bethune M.T., Joglekar A.V. Personalized T cell-mediated cancer immunotherapy: progress and challenges. Curr. Opin. Biotech. 2017; 48: 142-52.
5. Ho W.Y., Blattman J.N., Dossett M.L., Yee C., Greenberg P.D. Adoptive immunotherapy: engineering T cell responses as biologic weapons for tumor mass destruction. Cancer Cell. 2003; 3 (5): 431-7.
6. Rosenberg S.A., RestifoN.P.,Yang J.C., Morgan R.A., Dudley M.E. Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunother-apy. Nat. Rev. Cancer. 2008; 8 (4): 299-308.
7. Kobayashi A., Hara H., Ohashi M., Nishimoto T., Yoshida K., Ohkohchi N. et al. Allogeneic MHC gene transfer enhances an ef-
новлено, что сингенный и аллогенный противоопухолевый ответ, как и аллогенный ответ на интактную ткань, отличаются друг от друга. Удаление аллоспецифичных клонов из репертуара группы с аллогенным иммунным ответом на опухоль позволило определить клоны, отсутствующие в сингенной модели. Таким образом, иммунная реакция на опухоль развивается параллельно аллоспецифичной и может рассматриваться отдельно от нее. Соответствующие опухоль-специфичные клоны обладают потенциалом к использованию при иммунотерапии злокачественных новообразований.
Вклад авторов
Отработка методик, написание статьи - Булушева И.А., Козлов И.Б.; дизайн экспериментов - Митин А.Н.; секвенирование образцов - Коростин Д.О.; анализ данных, редактирование текста - Кофиади И. А.
fective antitumor immunity in the early period of autologous hematopoietic stem cell transplantation. Clin. Cancer Res. 2007; 13 (24): 7469-79.
8. Marcus A., Eshhar Z. Allogeneic adoptive cell transfer therapy as a potent universal treatment for cancer. Oncotarget. 2011; 2 (7): 525-6.
9. Bolotin D.A., Poslavsky S., Mitrophanov I., Shugay M., Mam-edov I.Z., Putintseva E.V. et al. MiXCR: software for comprehensive adaptive immunity profiling. Nat. Methods. 2015; 12 (5): 380-1.
10. Nazarov V.I., Pogorelyy M.V., Komech E.A., Zvyagin I.V., Bolotin D.A., Shugay M. et al. tcR: an R package for T cell receptor repertoire advanced data analysis. BMC Bioinformatics. 2015; 16 (1): 175.
11. Shugay M., Britanova O.V., Merzlyak E.M., Turchaninova M.A., Mamedov I.Z., Tuganbaev T.R. et al. Towards error-free profiling of immune repertoires. Nat. Methods. 2014; 11 (6): 653-5.
12. Mamedov I.Z., Britanova O.V., Zvyagin I. V., Turchaninova M.A., Bolotin D.A., Putintseva E.V. et al. Preparing unbiased T-cell receptor and antibody cDNA libraries for the deep next generation sequencing profiling. Front. Immunol. 2013; 4: 456.
13. Dash P., Fiore-Gartland A.J., Hertz T., Wang G.C., Sharma S., Souquette A. et al. Quantifiable predictive features define epitope-specific T cell receptor repertoires. Nature. 2017; 547 (7661): 89-93.
■ References
1. Alekseev L.P., Khaitov R.M., Dolbin A.G., Boldyreva M.N., Alekseeva P.L., Trofimov D.Yu., et al. Human immunogenetics and organ transplant clinics in Russia. Immunologiya. 2015; 36 (2): 76-89. (in Russian)
2. Han Y., Li H., Guan Y., Huang J. Immune repertoire: A potential biomarker and therapeutic for hepatocellular carcinoma. Cancer Lett. 2016; 379 (2): 206-12.
3. Ye B., Smerin D., Gao Q., Kang C., Xiong X. High-throughput sequencing of the immune repertoire in oncology: applications for clinical diagnosis, monitoring, and immunotherapies. Cancer Lett. 2018; 416: 42-56.
4. Bethune M.T., Joglekar A.V. Personalized T cell-mediated cancer immunotherapy: progress and challenges. Curr. Opin. Biotech. 2017; 48: 142-52.
5. Ho W.Y., Blattman J.N., Dossett M.L., Yee C., Greenberg P.D. Adoptive immunotherapy: engineering T cell responses as biologic weapons for tumor mass destruction. Cancer Cell. 2003; 3 (5): 431-7.
6. Rosenberg S.A., RestifoN.P.,Yang J.C., Morgan R.A., Dudley M.E. Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunother-apy. Nat. Rev. Cancer. 2008; 8 (4): 299-308.
7. Kobayashi A., Hara H., Ohashi M., Nishimoto T., Yoshida K., Ohkohchi N., et al. Allogeneic MHC gene transfer enhances an ef-
fective antitumor immunity in the early period of autologous hematopoietic stem cell transplantation. Clin. Cancer Res. 2007; 13 (24): 7469-79.
8. Marcus A., Eshhar Z. Allogeneic adoptive cell transfer therapy as a potent universal treatment for cancer. Oncotarget. 2011; 2 (7): 525-6.
9. Bolotin D.A., Poslavsky S., Mitrophanov I., Shugay M., Mamedov I.Z., Putintseva E.V., et al. MiXCR: software for comprehensive adaptive immunity profiling. Nat. Methods. 2015; 12 (5): 380-1.
10. Nazarov V.I., Pogorelyy M.V., Komech E.A., Zvyagin I.V., Bolotin D.A., Shugay M., et al. tcR: an R package for T cell receptor repertoire advanced data analysis. BMC Bioinformatics. 2015; 16 (1): 175.
11. Shugay M., Britanova O.V., Merzlyak E.M., Turchaninova M.A., Mamedov I.Z., Tuganbaev T.R., et al. Towards error-free profiling of immune repertoires. Nat. Methods. 2014; 11 (6): 653-5.
12. Mamedov I.Z., Britanova O.V., Zvyagin I.V., Turchaninova M.A., Bolotin D.A., Putintseva E.V., et al. Preparing unbiased T-cell receptor and antibody cDNA libraries for the deep next generation sequencing profiling. Front. Immunol. 2013; 4: 456.
13. Dash P., Fiore-Gartland A.J., Hertz T., Wang G.C., Sharma S., Souquette A., et al. Quantifiable predictive features define epitope-specific T cell receptor repertoires. Nature. 2017; 547 (7661): 89-93.
Сведения об авторах
Булушева Ирина Алексеевна - аспирант Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация; e-mail: [email protected], http://orcid.org/0000-0001-8980-8425
Козлов Иван Борисович - аспирант ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация; e-mail: [email protected], http://orcid.org/0000-0002-1695-8737
Митин Александр Николаевич - к.м.н., зав. лабораторией дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация; e-mail: [email protected], http://orcid.org/0000-0003-1333-0757
Коростин Дмитрий Олегович - руководитель группы секве-нирования Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пи-рогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация; e-mail: [email protected], http://orcid.org/0000-0003-1343-2550
Кофиади Илья Андреевич - д.б.н., зав. лабораторией молекулярной иммуногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация; e-mail: [email protected]. http://orcid.org/0000-0001-9280-8282
Authors' information
Irina A. Bulusheva - Postgraduate Student of the Center for High Precision Editing and Genetic Technologies for Biomedicine of the N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation; Moscow, Russian Federation; e-mail: [email protected], http://orcid.org/0000-0001-8980-8425
Ivan B. Kozlov - Postgraduate Student of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation; e-mail: [email protected], http://orcid.org/0000-0002-1695-8737
Alexander N. Mitin - PhD, Head of the Laboratory for Lymphocyte Differentiation of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation; e-mail: [email protected], http:// orcid.org/0000-0003-1333-0757
Dmitriy O. Korostin - Head of Sequencing Group of the Center for High Precision Editing and Genetic Technologies for Biomedicine of N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation; e-mail: [email protected], http://orcid.org/0000-0003-1343-2550
Ilya A. Kofiadi - Dr.Sci., Head of Laboratory of Molecular Im-munogenetics of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation; e-mail: [email protected], http://orcid. org/0000-0001-9280-8282
