CC BY
12
УДК 571.27; 57.016.4
Роль рекомбинантного циклофилина А человека в развитии противоопухолевого иммунного ответа
А. А. Калинина1, Ю. Ю. Силаева2, Д. Б. Казанский1, Л. М. Хромых1*
'«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина»
Министерства здравоохранения России, 115478, Москва, Каширское ш., 24
2Институт биологии гена РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 34/5
*E-mail: lkhromykh@list.ru
Поступила в редакцию 13.02.2019
Принята к печати 13.05.2019
DOI: 10.32607/20758251-2019-11-2-63-67
РЕФЕРАТ Циклофилин А (ЦфА) - многофункциональный белок, обладающий изомеразной активностью и существующий во внутриклеточной и секретируемой формах. Секретируемый ЦфА способствует регенерации кроветворной и иммунной систем организма, усиливая миграцию стволовых клеток из костного мозга. В настоящее время разрабатываются стратегии применения ЦфА при ишемии конечностей, для устранения побочных эффектов циклоспорина А (ЦсА) и др. Однако роль ЦфА в развитии противоопухолевого иммунного ответа не изучена. Используя модельную систему отторжения лимфомы EL-4 мышами B10.D2(R101), нами показано, что рекомбинантный ЦфА человека стимулирует противоопухолевый иммунный ответ за счет раннего привлечения гранулоцитов в сайт локализации клеток-мишеней и ускоренного системного накопления эффекторных Т-киллерных клеток.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА провоспалительный фактор, противоопухолевый иммунный ответ, трансгенные мыши, Т-клеточный рецептор, циклофилин А.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЦфА - циклофилин А; ЦсА - циклоспорин А; рчЦфА - рекомбинантный циклофилин А человека; ТКР - Т-клеточный рецептор; МНС - главный комплекс гистосовместимости; PBS - фос-фатно-солевой буфер; i.p. - внутрибрюшинное введение; АПК - антигенпредставляющие клетки; CD - кластер дифференцировки.
ВВЕДЕНИЕ
Циклофилин А (ЦфА) - белок семейства пептидил-пролилизомераз, существующий во внутриклеточной и секретируемой формах. Цитозольный ЦфА присутствует во всех тканях и выполняет множество функций [1]. ЦфА участвует в проведении сигнала через Т-клеточный рецептор [1] и служит лигандом для циклоспорина А, за счет чего и реализуется иммуносупрессорное действие последнего [1].
Секретируемый ЦфА является провоспалитель-ным фактором, он привлекает клетки врожденного иммунитета (гранулоциты, макрофаги, дендритные клетки) в очаг воспаления и участвует в патогенезе различных заболеваний [1]. Будучи хемоаттрак-тантом стволовых клеток, а также незрелых гра-нулоцитов, предшественников дендритных клеток, Т- и В-лимфоцитов, и индуцируя их миграцию из костного мозга на периферию, секретируемый
ЦфА осуществляет регенеративные функции [2]. ЦфА способен регулировать действие других хемо-кинов и продукцию провоспалительных цитокинов [3]. ЦфА индуцирует дифференцировку и созревание дендритных клеток, а также захват и представление антигена этими клетками [4]. Таким образом, ЦфА может быть фактором модуляции как врожденного, так и адаптивного иммунитета. Накапливающиеся экспериментальные данные указывают на потенциальную возможность применения данного белка при таких заболеваниях, как ишемия конечностей, устранение побочных эффектов, вызванных действием циклоспорина А, вирусных заболеваний и др.
Однако роль ЦфА в индукции и развитии противоопухолевого иммунного ответа остается малоизученной. Цель нашей работы состояла в оценке вклада ЦфА как фактора иммунитета, участвующего в начальных этапах развития противоопухолевого
ТОМ 11 № 2 (41) 2019 | ACTA NATURAE | 63
иммунного ответа. Определено влияние рекомби-нантного ЦфА человека (рчЦфА) на отторжение лимфомы EL-4 мышами B10.D2(R101). Выявлено им-муномодулирующее действие рчЦфА, направленное на стимуляцию врожденного и адаптивного звеньев иммунитета и, как следствие, на ускоренную элиминацию опухолевых клеток. Кроме того, в модели формирования противоопухолевого иммунного ответа у мышей трансгенной линии 1D1b [5] на клетки лимфомы EL-4 показана роль рчЦфА в стимуляции накопления опухольспецифичных цитотоксических Т-лимфоцитов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Мыши
Мышей линий C57BL/6 (KbI-AbDb) и B10.D2(R101) (KdI-AdI-EdDb) получали из экспериментально-биологической лаборатории НИИ ЭДИТО НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России. Трансгенные мыши линии 1D1b, в Т-лимфоцитах которых экспрессируются ß-цепи Т-клеточного рецептора (ТКР) клеток памяти, специфичного к молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I H-2Kb, выведены на генетической основе линии B10.D2(R101) в лаборатории механизмов регуляции иммунитета НИИ канцерогенеза НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина [5]. В исследованиях использовали самцов и самок массой 16-18 г. Экспериментальные группы включали 6-8 животных. Работу с животными проводили в соответствии с протоколом этической комиссии НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России.
Получение рчЦфА
Белок выделяли из биомассы клеток Escherichia coli BL21(DE3)Gold, трансформированных рекомбинант-ной плазмидой pETCYPopti, содержащей полноразмерный ген ЦфА человека [6]. рчЦфА использовали в виде раствора в натрий-калий фосфатно-солевом буфере (PBS, рН 7.3) с чистотой более 95% по данным электрофореза. По результатам LAL-теста содержание эндотоксина в образцах рчЦфА не превышало 0.038 нг/мг белка.
Иммунизация животных
Мышей линии B10.D2(R101) и 1D1b иммунизировали внутрибрюшинно (i.p.) клетками лимфомы EL-4 (KbDb) в количестве 3.0 х 105 и 1.0 х 106 клеток/мышь соответственно в 500 мкл PBS.
Схемы введения рчЦфА
Мышам линии B10.D2(R101) вводили белок i.p. в дозе 5 мг/кг (100 мкг/мышь) в течение 3 дней после им-
мунизации лимфомой EL-4. Первую инъекцию белка проводили через 3 ч после имплантации клеток EL-4. Мышам линии 1D1b вводили 10 мг/кг рчЦфА подкожно в течение 10 дней после иммунизации. Контрольным животным вводили PBS в качестве плацебо.
Подготовка суспензий клеток
Через 6, 9 и 12 дней после иммунизации мышей линии B10.D2(R101) умерщвляли путем цервикальной дислокации. Для получения лаважа проводили смыв брюшной полости 2 мл PBS при помощи шприца. Для получения суспензии спленоцитов извлекали селезенку и гомогенизировали в 3 мл PBS в гомогенизаторе Поттера. Трансгенных мышей 1D1b умерщвляли на 12 день после иммунизации и подготавливали суспензию спленоцитов аналогичным образом. Лизис эритроцитов проводили в лизирующем буфере (BD, США), затем отмывали клетки в PBS и осаждали центрифугированием (200 g, 5 мин). Жизнеспособные клетки подсчитывали в камере Горяева в присутствии трипанового синего и эозина.
Антитела
В работе использовали моноклональные антитела: анти-CD3e - eFluor450 (клон 17А2) (eBioscience, США); анти-ОТ8 - Pacific blue (клон 53-6.7) (BD Pharmingen, США); анти-ОТ44 - АРС (клон IM7) (eBioscience, США); анти-CD62L-АРС - Cy7 (клон MEL-14) (eBioscience, США); анти^Ьб - PE (клон RR4-7) (eBioscience, США); анти-Grl - АРС (клон RB6-8C5) (BD Pharmingen, США); анти-CDllb-PE -Cy7 (клон М1/70) (BD Pharmingen, США).
Цитофлуориметрический анализ
Пробы клеток лаважа и селезенки (1.0-5.0 х 106) обрабатывали антителами Fc block (клон 2.4G2, BD Pharmingen, США) в течение 5 мин при 4°С и инкубировали с моноклональными антителами нужной специфичности в течение 40 мин при 4°С. Клетки отмывали PBS путем центрифугирования (200 g, 5 мин) и анализировали на проточном цитофлуориме-тре FACS CantolI (BD, США) с использованием программы FACSDiva 6.0. Мертвые клетки исключали из анализа по окрашиванию йодидом пропидия (BD, США). Для характеристики популяций анализировали 0.5 - 1.0 х 106 событий. Обработку результатов проводили в программе FlowJo 7.6. (BD, США).
Статистическая обработка данных
Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента в программе Exel (Microsoft, США). Различия признавали значимыми при p < 0.05.
64 | ACTA NATURAE | ТОМ 11 № 2 (41) 2019
100 А
90 0
80 о о
70 о
60
50
40 о
30
20
10
0 -^-
R101 R101+ интактные EL-4
R101 + EL-4+ рчЦфА
90 Б 50
80 о 45
70 о 40
60 о 35
о
30
50
25
40
20
30 15
20 10
о
10 5
0 О 0 0
R101 R101+ интактные EL-4
R101 + EL-4+ рчЦфА
R101 интактные
R101 + EL-4
R101 + EL-4+ рчЦфА
В
Рис. 1. Относительное количество клеток лимфомы EL-4 (Кь+, %) в брюшной полости мышей линии В10^2^101) на 6 (А), 9 (Б) и 12 (В) день после иммунизации. Представлены результаты 3 репрезентативных экспериментов (М ± SD, п = 6 - 8). Относительное количество Кь+ клеток в лаваже интактных мышей отображает уровень неспецифического связывания моноклональных анти-Кь-антител
РЕЗУЛЬТАТЫ
В исследовании использовали аллогенную систему, в которой отторжение клеток лимфомы EL-4 (К^ь) в организме мышей линии В10^2^101) (Кй1-Ай1-Е^ь) происходило в силу различий по одной молекуле МНС класса I - Н-2КЬ. Показано, что введение рчЦфА приводит к полной элиминации EL-4 на 9 день после трансплантации опухолевых клеток, тогда как в норме отторжение лимфомы наблюдается к 12 дню (рис. 1).
Развитие иммунного ответа на лимфому EL-4 сопровождалось привлечением гранулоцитов в сайт локализации клеток-мишеней. К 6 дню после иммунизации рчЦфА индуцировал интенсивное накопление зрелых нейтрофилов в брюшной полости иммунизированных мышей, увеличивая относительное количество данных клеток в 3 раза по сравнению с контрольными иммунизированными животными (рис. 2А). К 9 дню после иммунизации под действием рчЦфА происходило увеличение незрелых грану-лоцитов, а также промиелоцитов и миелоцитов в 2.5 и 4.5 раза соответственно по сравнению с контрольными иммунизированными животными (рис. 2Б).
На следующем этапе проведена оценка влияния рчЦфА на количественные и субпопуляционные изменения CD8+ Т-лимфоцитов у мышей-опухоленоси-телей. Нам не удалось обнаружить влияния рчЦфА
на динамику накопления CD8+ Т-лимфоцитов в локальном очаге опухоли (при оценке лаважа) или на системном уровне (при оценке спленоцитов, данные не приведены). Однако анализ субпопуляций наивных клеток (CD62L+CD44-), центральных клеток памяти (CD62L+CD44+) и эффекторных клеток (CD62L-CD44+) в пуле CD8+ Т-лимфоцитов селезенки показал, что под влиянием рчЦфА значительно увеличивается (на 65% относительно контрольных животных) количество эффекторных цитотоксических Т-клеток на 9 день поле введения опухоли (данные не представлены, рис. 3), что коррелирует с динамикой элиминации клеток лимфомы (рис. 1).
Таким образом, показано, что рчЦфА при вну-трибрюшинном введении стимулирует противоопухолевый иммунный ответ за счет раннего привлечения гранулоцитов в сайт локализации клеток-мишеней и ускоренного накопления эффектор-ных Т-киллерных клеток на системном уровне.
Ранее в нашей лаборатории было показано, что у трансгенных мышей линии Ш1Ь в ходе иммунного ответа на клетки EL-4 формируется значительно меньший пул эффекторных CD8+ Т-лимфоцитов по сравнению с мышами дикого типа, вследствие чего они не способны отторгать данную опухоль [5, 7].
В настоящей работе у мышей Ш1Ь оценено влияние рчЦфА на относительное количество эффектор-
ТОМ 11 № 2 (41) 2019 | АСТА ^ТОИАЕ | 65
Л
хО
Ч R1 л R1 ■ R1
01 интактные 01+ EL-4 (плацебо) 01+ EL-4+рчЦфА
1"
п
п
п
■ъ
с±а
30
о25 т е л
<5 20
О
R101 интактные R101+ EL-4 (плацебо) R101+ EL-4+рчЦфА
п
п
Gr1hiCD11blo Gr1intCD11bint Gr1hiCD11bhi
Gr1hiCD11blo
Г
г4
Gr1intCD11bint
гЬ
35
^ 30
е
I 25
о 20
О
1±1
Gr1hiCD11bhi
R101 интактные R101+ EL-4 (плацебо) R101+ EL-4+рчЦфА
НН
г^п—ИЁ
Gr1hiCD11blo Gr1intCD11bint Gr1hiCD11bhi
Б
В
5
4
5
5
0
0
Рис. 2. Динамика изменения относительного количества незрелых нейтрофилов (Ог1Ы Сй11Ыо), промиело-цитов и миелоцитов (Ог1П Сй11Ып+), зрелых гранулоцитов (Ог1Ы Сй11ЬЫ) в брюшной полости мышей линии на 6 (Л), 9 (Б) и 12 (В) день после иммунизации клетками лимфомы БЬ-4. Представлены данные 3 репрезентативных экспериментов (М ± SD, п = 6 - 8).*р < 0.05; **р < 0.01
ных Т-лимфоцитов, несущих на своей поверхности эндогенные или трансгенную Р-цепь ТКР, которую идентифицировали с помощью коммерческих антител к Vb6.
Показали, что рчЦфА не влиял на относительное количество эффекторных Т-лимфоцитов, экспрес-сирующих эндогенные Р-цепи ТКР, у мышей Ш1Ь, иммунизированных лимфомой EL-4 (рис. 4), но способствовал значительному (в 2 раза относительно контрольных животных) увеличению пула эффек-торных Т-лимфоцитов, несущих трансгенную Р-цепь ТКР (рис. 4).
Полученные данные позволяют предполагать, что рчЦфА способен модулировать противоопухолевый иммунный ответ как у мышей с нормальным репертуаром Т-лимфоцитов (В10^2^101)), так и в условиях ограниченного репертуара ТКР Т-лимфоцитов у трансгенных мышей линии Ш1Ь путем увеличения пула эффекторных CD8+ Т-лимфоцитов.
ОБСУЖДЕНИЕ
В данной работе мы изучали роль рчЦфА в развитии противоопухолевого иммунного ответа на лим-фому EL-4 у мышей линии В10^2^101) и показали, что этот белок стимулирует накопление гранулоци-тов в сайте локализации опухолевых клеток и системное увеличение пула эффекторных цитоток-сических Т-лимфоцитов, приводящее к ускоренной элиминации клеток опухоли. Известно, что инфиль-
к,
о т е л к о в т с е ч и л о к е о н ь л е т и с о н
70
60
50
40
30
20
10
□ Р101 интактные
□ 1*101 + ЕЬ-4 "1*101 + ЕЬ-4+рчЦфА
П
6 день
9 день
12 день
Рис. 3. Динамика накопления эффекторных CD8+ Т-лимфоцитов (CD62L-CD44+) в селезенке мышей линии В10^2(к101) после иммунизации клетками EL-4. Представлены результаты 3 репрезентативных экспериментов (М ± SD, п = 6 - 8).**р < 0.01
трация тканей нейтрофилами является первой фазой иммунного ответа при инфицировании или воспалении. Эти клетки способны захватывать антиген и мигрировать в дренирующие лимфоузлы и селезенку, где они взаимодействуют с антигенпредставляющи-
0
66 | АСТА ^ТиИАЕ | ТОМ 11 № 2 (41) 2019
as
* 70
о
н
Ш
5 60
50
и <и т s с о
X
<и
0
1 .0
<Ç 20
s и
0
1
40
30
10
и1D1b интактная ■ 1D1b+ EL-4 □ 1D1b+ EL-4+рчЦфА
Vb6+
Vb6-
Рис. 4. Относительное количество (%) эффекторных CD8+ Т-лимфоцитов (CD62L-CD44+) с эндогенными Р-цепями ТКР (УЬ6-) или трансгенной Р-цепью (УЬ6+) ТКР в селезенке мышей трансгенной линии Ю1Ь на 12 день после иммунизации. Представлены результаты 3 репрезентативных экспериментов (М ± SD, п = 7).*р < 0.05
ми клетками (АПК) и лимфоцитами [8] или сами выступают в роли АПК [9], участвуя в формировании адаптивного иммунного ответа. Ранее мы показали, что нейтрофилы участвуют в развитии иммунного ответа на клетки аллогенной опухоли [10]. Роль дан-
ных клеток может заключаться в обеспечении кости-муляторных сигналов (CD80 и CD86) и цитокинового окружения (интерлейкин 12), необходимых для диф-ференцировки цитотоксических Т-лимфоцитов [10, 11]. Показано, что процессы, происходящие в брюшной полости при внутрибрюшинном введении рчЦфА, коррелируют с иммунным ответом на уровне организма.
У мышей 1D1b экспрессия трансгенной ß-цепи ТКР приводит не только к сокращению репертуара ТКР, но и снижает количество активированных Т-лимфоцитов [5]. Иммунный ответ мышей 1D1b на лимфому EL-4 недостаточен для полного отторжения опухоли, он приводит к иммуноредактиро-ванию лимфомы посредством селекции наименее иммуногенных клонов, которые через 60 дней убивают животных [7]. В данной экспериментальной системе установлено, что под действием рчЦфА происходит статистически значимое увеличение пула специфических цитотоксических Т-лимфоцитов на начальных этапах иммунного ответа на лимфому EL-4. Полученные данные позволяют предполагать, что рчЦфА способен модулировать противоопухолевый иммунный ответ как у мышей с нормальным репертуаром Т-лимфоцитов, так и в условиях ограниченного репертуара Т-клеток путем увеличения пула эффекторных Т-киллеров.
Таким образом, нами показано, что рчЦфА обладает иммуностимулирующим действием, способствуя ускоренному развитию противоопухолевого иммунного ответа за счет стимуляции врожденного и адаптивного звеньев иммунитета.
0
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Nigro P., Pompilio G., Capogrossi M.C. // Cell Death Disease. 2013. V. 4. Р. e888. doi: 10.1038/cddis.2013.410.
2. Khromykh L.M., Kulikova N.L., Anfalova T.V., Muranova T.A., Abramov V.M., Vasiliev A.M., Khlebnikov V.S., Kazan-sky D.B. // Cell Immunol. 2007. V. 249. № 1. Р. 46-53.
3. Dawar F.U., Xiong Y., Khattak M.N.K., Li J., Lin L., Mei J. // J. Leukoc. Biol. 2017. V. 102. № 4. Р. 989-992.
4. Bharadwaj U., Zhang R., Yang H., Doan D., Li M., Chen C., Yao Q. // J. Surgical Res. 2004. V. 121. № 2. Р. 294.
5. Силаева Ю.Ю., Калинина А.А., Вагида М.С., Хромых Л.М., Дейкин А.В., Ермолкевич Т.Г., Садчикова Е.Р., Гольдман И.Л., Казанский Д.Б. // Биохимия. 2013. Т. 78. № 5. Р. 614-626.
6. Хромых Л.М., Калинина А.А., Козырь А.В., Колесников А.В., Силаева Ю.Ю., Казанский Д.Б. Патент № 2603283.
Российская Федерация. 2015.
7. Silaeva Yu.Yu., Grinenko T.S., Vagida M.S., Kalinina A.A., Khromykh L.M., Kazansky D.B. // J. Immunotoxicol. 2014. V. 1. № 4. Р. 393-399.
8. Mantovani A., Cassatella M.A., Costantini C., Jaillon S. // Nat. Rev. Immunol. 2011. V. 11. № 8. Р. 519-523.
9. Takashima A., Yao Y. // J. Leukoc. Biol. 2015. V. 98. № 4. Р. 489-496.
10. Марюхнич Е.В., Звездова Е.С., Анфалова Т.В., Хромых Л.М., Казанский Д.Б. // Докл. Акад. наук. 2007. Т. 414. № 1. Р. 126-129.
11. Побезинский Л.А., Побезинская Е.Л., Звездова Е.С., Петрищев В.Н., Гриненко Т.С., Батурина И.А., Анфалова Т.В., Хромых Л.М., Васильева Т.В., Казанский Д.Б. // Докл. Акад. наук. 2005. Т. 402. № 3. Р. 421-426.
ТОМ 11 № 2 (41) 2019 | ACTA NATURAE | 67
