4. Определитель бактерий Берджи / под ред. Д. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уильямса. М. : Мир, 1997. Т. 1, С. 430.
5. Практикум по микробиологии / Е. 3. Теппер, В. К. Шильникова, Г. И. Переверзева ; изд. 2-е, перераб. и доп. М. : Колос, 1979. С. 216.
6. Хабибуллина Ф. М., Оценка углеводородокисляющей активности микроорганизмов / Ф. М. Хабибуллина, А. А. Шубаков, И. Б. Арчегова, Г. Г. Романов // Биотехнология. 2002. № 6. С. 57—62.
,7. Rester A. S. Activity of soil microflora in conditions oi oil pollution / A. S. Kester, J. W. Foster /?_ J. Bacteriol. 1963. P. 85.
8. Leahy J. G. Decomposition of mineral oil a various degree of condensation by microorganisms at the lowered temperatures / J. G. Leahy, R. R. Colwell // Microbiol. Rev. 1990, V. 54, P. 305—315.
9. Morgan P. The grounds recultivatsija and clearning of a surface of reservoirs of petropollution / P. Morgan, R. J. Watkinson // Crit. Rev. Biotechnol. 1989, V. 8, P. 305—333.
Поступила 04.02.08.
ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ САПРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ
И. А. Тарасова, М. В. Ковальская
Природные экосистемы, не подвергшиеся вмешательству человека, способны к самоочищению. Таким образом природа сама справляется с переработкой более не нужного ей органического материала. В утилизации органики участвует почва, содержащая естественную биоту (микроорганизмы, эдафон).
С •
Разнообразие почвенных микроорганизмов составляет микрофлору почвы, которая участвует в переработке мертвой органики в плодородный гумус.
Антропогенное воздействие на окружающую среду приводит к загрязнению почвы отходами производств и жизнедеятельности, где значительное место отведено органическим загрязнителям. Из-за этого изменяется соотношение между отдельными группами микроорганизмов, происходит подавление естественной биоты, в целом нарушаются естественные процессы самоочищения, почвообразования, накапливаются неразлагаемые отходы. Скопления трудноразлагаемых отходов приводят к экологическому дисбалансу и ухудшению санитарных условий жизни людей [2].
I *
Данную экологическую проблему позволяет решить использование биопрепарата со специально подобранными микроорганизмами, ранее выделенными из почвы. Подобранные виды микроорганизмов-сапротрофов способны
использовать различные виды мертвой органики в качестве основного источника энергии жизнедеятельности и редуцировать их на безвредные для окружающей среды продукты микробного метаболизма [8]. Данный метод позволит восстановить и ускорить процесс естественного самоочищения почвы.
Цель работы — получение чистой культуры сапротрофных бактерий из отобранных проб компостной ямы.
Для выполнения данной цели были сформулированы следующие задачи:
— получить отдельные колонии с помощью метода Коха;
— провести идентификацию полученных колоний, отобрать колонии с различными видами микроорганизмов.
Стерилизацию чашек Петри, пробирок и колб производили сухим жаром при температуре 180 °С 60 мин; питательные среды — насыщенным паром под давлением 1 атм при 121 °С в течение 20—30 мин [5].
Перед каждым посевом лабораторное помещение проветривали, проводили влажную уборку, обеззараживали воздух в помещении при помощи ультрафиолетового бактерицидного облучателя. Рабочее место (лабораторный стол, ламинарный бокс) и все рабочие поверхности протирали спиртом [3; 4].
© И. А. Тарасова, М. В. Ковальская, 2008
Для получения накопительной культуры сапротрофных бактерий были отобраны несколько проб из компостной ямы. Полученную суспензию инокулировали в полусинтетическую питательную среду (табл. 1). Как правило, для получения накопительных куль-
20—40 клеток в 0,1 мл; затем полученные растворы высевались на плотную питательную среду (МПА) и каждая клетка давала отдельную колонию. Таким образом, были получены колонии разнообразных видов микроорганизмов, которые отличались по морфологическим
тур используют элективные среды, но в на- признакам и формами клеток бактерий. Затем случае это не представляется возможным, поскольку сапротрофный образ питания могут вести разнообразные физиологические группы микроорганизмов (сахаролитические,
молочнокислые, использующие целлюлозу и др.). Поэтому для культивирования всего разнообразия микроорганизмов был использован мясо-пептонный бульон, подходящий почти для всех хемоорганотрофных бактерий [1].
Для получения чистой культуры из отдель-
тем каждую выделенную колонию микроско-пировали светлопольным микроскопом.
Для микроскопирования готовились следующие препараты:
1) «раздавленная капля» (нативный);
2) фиксированный в агаре;
3) фиксированный над пламенем горелки / окрашенный (метод окрашивания по Граму)
[6, 7].
В ходе выполнения выделения чистой
ной колонии использовали принцип Коха, со- культуры необходимо было решить две методические трудности: во-первых, получить от-
гласно которому каждая колония является потомством одной клетки. При выделении чистой культуры аэробных микроорганизмов накопительную культуру высевали на поверхность плотной среды. Методом последовательных разведений были приготовлены препараты с различной концентрацией исходной суспензии. Всего было сделано 15 разведений с коэффициентом разведения 10. Затем расплавленную на кипящей водяной бане стерильную питательную среду, содержащую агар, разливали в стерильные чашки Петри. После того как среда застывала, на ее поверхность наносили 0,1 мл накопительной культуры из каждого разведения и равномерно растирали стерильным шпателем Дригальского. После посева чашки выдерживали в термостате в течение двух дней при температуре 28 °С.
По истечении двух дней произвели подсчет колоний микроорганизмов на чашках Петри. В чашках с 1-го по 4-е разведения наблюдалось «газонное» зарастание. Подсчет колониеобра-зующих единиц вели для 5-го (652 КОЕ), 6-го (131 КОЕ) и 7-го разведения (44 КОЕ).
Для того чтобы получить изолированные колонии, вновь делали разведения и производили посев: исходная суспензия последовательно разводилась в несколько раз с целью снизить концентрацию клеток в жидкости до
дельные колонии; во-вторых, провести идентификацию полученных колоний, т. е. отобрать колонии с различными видами микроорганизмов (не повторяющиеся).
Отбор производили на основании морфологических признаков колонии: изрезанность края, форма поверхности, прозрачность, цвет и т. д. (Таблицы 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8).В процессе микроскопирования определяли форму клеток (кокки, палочки), наличие спор и дрожжей, подвижность и т. д.
Результаты микроскопирования: штамм № 1 представлен укороченными палочками (Рис. 1), штаммы № 2 и № 3 — палочки и спороносные палочки, штаммы № 4, № 5 и № 6 — кокки, штамм № 7 — длинные палочки (рис. 2). Таким образом, нами выделено 7 чистых культур сапротрофных микроорганизмов. Каждая из них является исключительной по морфологии и форме клеток, из которых она состоит.
В будущем планируется провести дополнительные исследования по определению систематической принадлежности каждого штамма, а также изучение их свойств в целях создания коллекции штаммов, способных утилизировать органику различного состава, и применения их для биологической утилизации и переработки отходов.
130
ВЕСТНИК Мордовского университета | 2008 | № 2
Таблица 1 Состав питательной среды
Компоненты Количество, г / л
Азофоска 1,29
Агар 9—12
Мясо-пептонный бульон 9
Таблица 3
Описание колонии штамма № 2
Признаки Результаты
Форма поверхности Круглая
Размер, мм 3
Цвет Бежевый
Изрезанность края Волнистый
Поверхность Глянцевая
Таблица 5
Описание колонии штамма № 4
Признаки Результаты
Форма поверхности * Круглая с фестончатым краем
Размер, мм 2
Цвет Белый
Изрезанность края Волнистый
Поверхность Матовая
Таблица 7
Описание колонии штамма № 6
Признаки Результаты
Форма поверхности Круглая с фестончатым краем
Размер, мм 3
Цвет Бежевый
Изрезанность края Волнистый
Поверхность Матовая
Таблица 9
Морфология клеток и цитология
штамма № 1
Признаки Результаты
Форма и расположение клеток Укороченные палочки, одиночные, сцепленные по несколько
Подвижность Малоподвижные с вращательным движением вокруг центра
Наличие эндоспор Есть, много
Окраска по Граму Грамотрицател ьные
Таблица 2
Описание колонии штамма № 1
Признаки Результаты
Форма поверхности Круглая, образует кратер в центре
Размер, мм 3
Цвет Белый
Изрезанность края Волнистый
Поверхность Матовая
Таблица 4
Описание колонии штамма № 3
Признаки Результаты
Форма поверхности Круглая
Размер, мм 5
Цвет Белый
Изрезанность края Волнистый
Поверхность Матовая
Таблица 6
Описание колонии штамма № 5
Признаки Результаты
Форма поверхности Круглая
Размер, мм 0,9
Цвет Белый
Изрезанность края Гладкий
Поверхность Матовая
Таблица 8
Описание колонии штамма № 7
Признаки Результаты
Форма Круглая
Размер, мм 1
Цвет Белый
Изрезанность края Гладкий
Поверхность Матовая
Таблица 10
Морфология клеток и цитология
штамма № 7
Признаки Результаты
Форма и расположение клеток Длинные палочки, одиночные, сцепленные по несколько
Подвижность Нет
Наличие эндоспор Нет
Окраска по Граму Грамотрицательные
С
I
}
*
>
(
л >
Ш^ЖтЖ Щ ■ ЛИ
|
I
*
Рисунок 1 Микроскопирование препарата
штамма М 1
Рисунок 2 Микроскопирование препарата
штамма № 7
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Асонов Н. Р. Микробиология ; 3-е изд., перераб. и доп. / Н. Р. Леонов. М. : Колос, 1997. 352 с.
2. Мудрецова-Висс К. А. Микробиология: санитария и гигиена учеб. для вузов / К. А. Мудрецо-
ва-Висс, А. А. Кудряшова, В. П. Дедюгина / / Владивосток : ДВГАЭУ, 1997. 312 с.
%
3. Общая микробиология ; пер. с нем. М. : Мир, 1987. 567 с.
4. Определитель бактерий Берджи / под ред. Д. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уиль-ямса. М. : Мир, 1997. Т. 1. 430 с.
5. Практикум по микробиологии / Е. 3. Теппер, В. К. Шильникова, Г. И. Переверзева ; изд. 2-е, перераб. и доп. М. : Колос, 1979. 216 с.
6. Чеботарев Л. Н. Техническая микробиология: учеб. пособие / Л. Н. Чеботарев, Л. В. Богданов, Н. И. Лузина. Кемерово : КузПИ, 1986.
7. Чеботарев Л. Н. Микробиология в иллюстрациях и схемах : учеб. пособие / Л. Н. Чеботарев, Л. В. Богданов, Н. И. Лузина// Кемерово : КузПИ, 1986. 96 с.
8. Шлегель Г. Общая микробиология / Г. Шлегель. М. : Мир, 1987. 500 с.
Поступила 04.02.08.
X
/