Получение чистой культуры сапротрофных бактерий Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

4. Определитель бактерий Берджи / под ред. Д. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уильямса. М. : Мир, 1997. Т. 1, С. 430.

5. Практикум по микробиологии / Е. 3. Теппер, В. К. Шильникова, Г. И. Переверзева ; изд. 2-е, перераб. и доп. М. : Колос, 1979. С. 216.

6. Хабибуллина Ф. М., Оценка углеводородокисляющей активности микроорганизмов / Ф. М. Хабибуллина, А. А. Шубаков, И. Б. Арчегова, Г. Г. Романов // Биотехнология. 2002. № 6. С. 57—62.

,7. Rester A. S. Activity of soil microflora in conditions oi oil pollution / A. S. Kester, J. W. Foster /?_ J. Bacteriol. 1963. P. 85.

8. Leahy J. G. Decomposition of mineral oil a various degree of condensation by microorganisms at the lowered temperatures / J. G. Leahy, R. R. Colwell // Microbiol. Rev. 1990, V. 54, P. 305—315.

9. Morgan P. The grounds recultivatsija and clearning of a surface of reservoirs of petropollution / P. Morgan, R. J. Watkinson // Crit. Rev. Biotechnol. 1989, V. 8, P. 305—333.

Поступила 04.02.08.

ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ САПРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ

И. А. Тарасова, М. В. Ковальская

Природные экосистемы, не подвергшиеся вмешательству человека, способны к самоочищению. Таким образом природа сама справляется с переработкой более не нужного ей органического материала. В утилизации органики участвует почва, содержащая естественную биоту (микроорганизмы, эдафон).

С •

Разнообразие почвенных микроорганизмов составляет микрофлору почвы, которая участвует в переработке мертвой органики в плодородный гумус.

Антропогенное воздействие на окружающую среду приводит к загрязнению почвы отходами производств и жизнедеятельности, где значительное место отведено органическим загрязнителям. Из-за этого изменяется соотношение между отдельными группами микроорганизмов, происходит подавление естественной биоты, в целом нарушаются естественные процессы самоочищения, почвообразования, накапливаются неразлагаемые отходы. Скопления трудноразлагаемых отходов приводят к экологическому дисбалансу и ухудшению санитарных условий жизни людей [2].

I *

Данную экологическую проблему позволяет решить использование биопрепарата со специально подобранными микроорганизмами, ранее выделенными из почвы. Подобранные виды микроорганизмов-сапротрофов способны

использовать различные виды мертвой органики в качестве основного источника энергии жизнедеятельности и редуцировать их на безвредные для окружающей среды продукты микробного метаболизма [8]. Данный метод позволит восстановить и ускорить процесс естественного самоочищения почвы.

Цель работы — получение чистой культуры сапротрофных бактерий из отобранных проб компостной ямы.

Для выполнения данной цели были сформулированы следующие задачи:

— получить отдельные колонии с помощью метода Коха;

— провести идентификацию полученных колоний, отобрать колонии с различными видами микроорганизмов.

Стерилизацию чашек Петри, пробирок и колб производили сухим жаром при температуре 180 °С 60 мин; питательные среды — насыщенным паром под давлением 1 атм при 121 °С в течение 20—30 мин [5].

Перед каждым посевом лабораторное помещение проветривали, проводили влажную уборку, обеззараживали воздух в помещении при помощи ультрафиолетового бактерицидного облучателя. Рабочее место (лабораторный стол, ламинарный бокс) и все рабочие поверхности протирали спиртом [3; 4].

© И. А. Тарасова, М. В. Ковальская, 2008

Для получения накопительной культуры сапротрофных бактерий были отобраны несколько проб из компостной ямы. Полученную суспензию инокулировали в полусинтетическую питательную среду (табл. 1). Как правило, для получения накопительных куль-

20—40 клеток в 0,1 мл; затем полученные растворы высевались на плотную питательную среду (МПА) и каждая клетка давала отдельную колонию. Таким образом, были получены колонии разнообразных видов микроорганизмов, которые отличались по морфологическим

тур используют элективные среды, но в на- признакам и формами клеток бактерий. Затем случае это не представляется возможным, поскольку сапротрофный образ питания могут вести разнообразные физиологические группы микроорганизмов (сахаролитические,

молочнокислые, использующие целлюлозу и др.). Поэтому для культивирования всего разнообразия микроорганизмов был использован мясо-пептонный бульон, подходящий почти для всех хемоорганотрофных бактерий [1].

Для получения чистой культуры из отдель-

тем каждую выделенную колонию микроско-пировали светлопольным микроскопом.

Для микроскопирования готовились следующие препараты:

1) «раздавленная капля» (нативный);

2) фиксированный в агаре;

3) фиксированный над пламенем горелки / окрашенный (метод окрашивания по Граму)

[6, 7].

В ходе выполнения выделения чистой

ной колонии использовали принцип Коха, со- культуры необходимо было решить две методические трудности: во-первых, получить от-

гласно которому каждая колония является потомством одной клетки. При выделении чистой культуры аэробных микроорганизмов накопительную культуру высевали на поверхность плотной среды. Методом последовательных разведений были приготовлены препараты с различной концентрацией исходной суспензии. Всего было сделано 15 разведений с коэффициентом разведения 10. Затем расплавленную на кипящей водяной бане стерильную питательную среду, содержащую агар, разливали в стерильные чашки Петри. После того как среда застывала, на ее поверхность наносили 0,1 мл накопительной культуры из каждого разведения и равномерно растирали стерильным шпателем Дригальского. После посева чашки выдерживали в термостате в течение двух дней при температуре 28 °С.

По истечении двух дней произвели подсчет колоний микроорганизмов на чашках Петри. В чашках с 1-го по 4-е разведения наблюдалось «газонное» зарастание. Подсчет колониеобра-зующих единиц вели для 5-го (652 КОЕ), 6-го (131 КОЕ) и 7-го разведения (44 КОЕ).

Для того чтобы получить изолированные колонии, вновь делали разведения и производили посев: исходная суспензия последовательно разводилась в несколько раз с целью снизить концентрацию клеток в жидкости до

дельные колонии; во-вторых, провести идентификацию полученных колоний, т. е. отобрать колонии с различными видами микроорганизмов (не повторяющиеся).

Отбор производили на основании морфологических признаков колонии: изрезанность края, форма поверхности, прозрачность, цвет и т. д. (Таблицы 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8).В процессе микроскопирования определяли форму клеток (кокки, палочки), наличие спор и дрожжей, подвижность и т. д.

Результаты микроскопирования: штамм № 1 представлен укороченными палочками (Рис. 1), штаммы № 2 и № 3 — палочки и спороносные палочки, штаммы № 4, № 5 и № 6 — кокки, штамм № 7 — длинные палочки (рис. 2). Таким образом, нами выделено 7 чистых культур сапротрофных микроорганизмов. Каждая из них является исключительной по морфологии и форме клеток, из которых она состоит.

В будущем планируется провести дополнительные исследования по определению систематической принадлежности каждого штамма, а также изучение их свойств в целях создания коллекции штаммов, способных утилизировать органику различного состава, и применения их для биологической утилизации и переработки отходов.

130

ВЕСТНИК Мордовского университета | 2008 | № 2

Таблица 1 Состав питательной среды

Компоненты Количество, г / л

Азофоска 1,29

Агар 9—12

Мясо-пептонный бульон 9

Таблица 3

Описание колонии штамма № 2

Признаки Результаты

Форма поверхности Круглая

Размер, мм 3

Цвет Бежевый

Изрезанность края Волнистый

Поверхность Глянцевая

Таблица 5

Описание колонии штамма № 4

Признаки Результаты

Форма поверхности * Круглая с фестончатым краем

Размер, мм 2

Цвет Белый

Изрезанность края Волнистый

Поверхность Матовая

Таблица 7

Описание колонии штамма № 6

Признаки Результаты

Форма поверхности Круглая с фестончатым краем

Размер, мм 3

Цвет Бежевый

Изрезанность края Волнистый

Поверхность Матовая

Таблица 9

Морфология клеток и цитология

штамма № 1

Признаки Результаты

Форма и расположение клеток Укороченные палочки, одиночные, сцепленные по несколько

Подвижность Малоподвижные с вращательным движением вокруг центра

Наличие эндоспор Есть, много

Окраска по Граму Грамотрицател ьные

Таблица 2

Описание колонии штамма № 1

Признаки Результаты

Форма поверхности Круглая, образует кратер в центре

Размер, мм 3

Цвет Белый

Изрезанность края Волнистый

Поверхность Матовая

Таблица 4

Описание колонии штамма № 3

Признаки Результаты

Форма поверхности Круглая

Размер, мм 5

Цвет Белый

Изрезанность края Волнистый

Поверхность Матовая

Таблица 6

Описание колонии штамма № 5

Признаки Результаты

Форма поверхности Круглая

Размер, мм 0,9

Цвет Белый

Изрезанность края Гладкий

Поверхность Матовая

Таблица 8

Описание колонии штамма № 7

Признаки Результаты

Форма Круглая

Размер, мм 1

Цвет Белый

Изрезанность края Гладкий

Поверхность Матовая

Таблица 10

Морфология клеток и цитология

штамма № 7

Признаки Результаты

Форма и расположение клеток Длинные палочки, одиночные, сцепленные по несколько

Подвижность Нет

Наличие эндоспор Нет

Окраска по Граму Грамотрицательные

С

I

}

*

>

(

л >

Ш^ЖтЖ Щ ■ ЛИ

|

I

*

Рисунок 1 Микроскопирование препарата

штамма М 1

Рисунок 2 Микроскопирование препарата

штамма № 7

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Асонов Н. Р. Микробиология ; 3-е изд., перераб. и доп. / Н. Р. Леонов. М. : Колос, 1997. 352 с.

2. Мудрецова-Висс К. А. Микробиология: санитария и гигиена учеб. для вузов / К. А. Мудрецо-

ва-Висс, А. А. Кудряшова, В. П. Дедюгина / / Владивосток : ДВГАЭУ, 1997. 312 с.

%

3. Общая микробиология ; пер. с нем. М. : Мир, 1987. 567 с.

4. Определитель бактерий Берджи / под ред. Д. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уиль-ямса. М. : Мир, 1997. Т. 1. 430 с.

5. Практикум по микробиологии / Е. 3. Теппер, В. К. Шильникова, Г. И. Переверзева ; изд. 2-е, перераб. и доп. М. : Колос, 1979. 216 с.

6. Чеботарев Л. Н. Техническая микробиология: учеб. пособие / Л. Н. Чеботарев, Л. В. Богданов, Н. И. Лузина. Кемерово : КузПИ, 1986.

7. Чеботарев Л. Н. Микробиология в иллюстрациях и схемах : учеб. пособие / Л. Н. Чеботарев, Л. В. Богданов, Н. И. Лузина// Кемерово : КузПИ, 1986. 96 с.

8. Шлегель Г. Общая микробиология / Г. Шлегель. М. : Мир, 1987. 500 с.

Поступила 04.02.08.

X

/