CC BY
68
| УДК 631 81
- ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС ПРИГОТОВЛЕНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО 1 БИОУДОБРЕНИЯ Ш ЕГО РОЛЬ В 1 СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЕ ПРОИЗВОДСТВЕ
¡1 А.П. Бондаренко, A.A. Калиева
Павлодарский государственный университет им.С.Торайгырова || Н.Н.Бондаренко, Р.А.Гараев, Р.А.Гараев, И.С. Панасенко
ТОО «Фотон-ПВ» A.A. Ведерникова
НИИ Биологии и Биофизики, г. Томск
Аталган мацалада eciMdiKmi цажетт1 фосфор турлер1мен цамтамасыз ememin биологияльщ тьщашщыштыц биомассасын арттыру технологиясы щарастырылады.
В дайной статье рассмотрена технология наращивания биомассы биологического удобрения, способного обеспечить растения доступными формами фосфора.
The given article touches upon the increase of the biological fertilizers biomass technology, capable to supply the plant with the available forms of phosphorus.
Почвенные микроорганизмы играют важнейшую роль в поддержания естественного плодородия. Одни из них разлагают внесенную в почву органику; способствуют образованию гумуса, делают доступными для растений питательные вещества, другие связывают атмосферный азот, синтезируют органические соединения, следующие переводят эти соединения в формы доступные растениям. Также они переводят фосфор в растворимое состояние, участвуют в разложении минералов, и б первую очередь практически неисчерпаемые глини стые минералы, обеспечивая растениям все необходимые химические элемен
ты. Более того, некоторые растения неспособны нормально развиваться без определенной микрофлоры. Жизнедеятельность микроорганизмов в почве способствует улучшению ее физических, и химических характеристик [1-3].
Срок жизни почвенных микроорганизмов может быть очень короток - от дней до нескольких часов. Если есть питание, тепло и влажность, они быстро размножаются и также быстро отмирают при неблагоприятных условиях. Но их биомасса и продукты жизнедеятельности составляют необходимый для растений набор веществ, в который входят не только простые соединения необходимые для растений, но и аминокислоты, витамины, ауксины, антибиотики и многие другие питательные вещества и стимуляторы роста растений.
В данной статье рассмотрена технология наращивания биомассы биологического удобрения, способного обеспечить растения доступными формами фосфора, на основе чистой культуры фосфорных бактерий Bacillus megaterium sub. phosphaticum. Действие препарата основано на способности этих бактерий усваивать малоподвижные формы фосфора и делать их доступными для растений [4].
Микробиологический препарат можно применять при выращивании любых сельскохозяйственных культур как отдельно, так и в сочетании с другими микробиологическими удобрениями. Применение фосфобакгерина улучшает фосфорное и азотное питание растений и увеличивает урожайность за счет более полного использования биогеохимического потенциала почв. Положительный эффект от применения бактериального удобрения связан не только с доставкой усвояемых фосфатов к растениям, но и действием биологически активных веществ (тиамина, биотина, никотиновой и пантагеновой кислот, витамина В12и др.), вырабатываемых в процессе жизнедеятельности.
Технологический процесс выращивания посевного материала на на авизованной среде приведен ниже.
Выращивание посевного материала производят в пробирках, пересевом чистых культур - в ламинарном боксе, методом «зигзага». Для выращивания посевной культуры Bacillus megaterium в пробирках используют питательную среду следующего состава:
- натрий хлористый- 5 г;
- пептон- 5-10 г;
- мясной экстракт- Зг;
- марганец сернокислый- 10 мг;
- агар- 15г;
- вода водопроводная- до 1000 мл.
Для приготовления питательной среды все соли растворяют в небольшом количестве воды, перемешивая на магнитной мешалке, добавляют пептон и
мясной экстракт. Затем раствор доводят до заданного объема водопроводной водой и подтитровывают 40% раствором едкого натра или 10% раствором соляной кислоты до значения pH 6,0- 6,2, чтобы после стерилизации величина pH была равной 6,5 - 7,5. После доведения pH в среду добавляют агар и расплавляют его на водяной бане. Агаризованную среду разливают в пробирки и стерилизуют в автоклаве 40 минут при 0,5 атм.
Чистоту культур проверяют микроскопированием с фазово- контрастным устройством и высевом на три параллельных косяка с мясо- пептонным агаром (МПА) и в три пробирки с мясо - пептонным бульоном (МПБ) с целью идентификации посторонней микрофлоры. Выращивание проводят в течение 48 часов
при температуре 37 + 1°С.
В случае, если пробы с одного косяка окажутся загрязненными посторонними бактериями, данную пробирку бракуют и проверяют таким же образом вторую, а затем, в случае необходимости, и другие пробирки.
Одну пробирку культуры, проверенную на чистоту, пересевают на 8-12 пробирок с авизованной средой методом «зигзага». Засеянные пробирки выдерживают в течение 3-4 суток в термостате при температуре 31 ± 1°С. Чистспу культур, полученных рассевом, проверяют на стерильность вышеуказанным способом.
Выращенный и проверенный на стерильность посевной материал хранят в холодильнике при температуре 5 ± 1°С в течение полутора месяцев.
На следующем этапе производится выращивание посевного материала в жидкой среде (I генерация). Для получения посевной культуры колбу с жидкой питательной средой засевают смывом с агара колонии Bacillus megaterium «sub. phosphaücum»npH помощи пипеток с отбитыми концами (3 мл среды). Для этого культуру микроорганизмов с одного косяка следует использовать для засева только одной колбы с питательной средой. Посев в колбы производят в ламинарном шкафу.
Выращивание посевного материала в колбах ведется в шейкере при режиме 220-240 оЯмин, температуре 31 ± 1°С в течение 24 часов. Поверх ватных пробок одевают марлевые «косыночки». Процесс ведется в темноте.
Выросшую посевную культуру контролируют на отсутствие посторонней микрофлоры и морфологическое состояние клеток микроскопированием с фазово- контрастным устройством и с окрашиванием метиленовой синью при увеличении 15x100. Для выявления посторонней микрофлоры суспензию бактерий из колбы высевают на мясо - пептонный агар и мясо - пептонный бульон в несколько параллельных пробирок.
II генерация - выращивание посевной культуры в жидкой среде - следующий этап технологического процесса, в котором посевной материал I генерации используют для засева колб с жидкой средой прошедшей обработку в автоклаве,
из расчета 10 мл посевного материала на 100 мл среды. Используется среда, приведенная в описании первой генерации, но без агара.
Выращивание проводят в колбах с ватными пробками, поверх- марлевые «косыночки». Колбы закрепляют на шейкере. Процесс перемешивания осуществляют в течение 48-50 часов при температуре 31 + 1°С при отсутствии воздействия света.
Выросшую культуру Bacillus megatenum «sub. phosphaticura» контролируют на загрязненность посторонней микрофлорой, морфологическое состояние клеток и подсчитывают их количество в 1 мл среды.
Методы контроля, применяемые при выращивании фосфорных микробиологических удобрений:
Контроль посевного материала под микроскопом.
Контроль производится с помощью светового микроскопа с фазово-контрас-тным устройством в при увеличении 15x100 с использованием иммерсионного масла. В жидкой 2-х суточной культуре Bacillus megatcrium «subsp. phosphaticum» бациллы должны находиться в стадии образования спор. При микроскопирова-нии с помощью масла данный штамм Bacillus megatenum после культивиования в течение 2-3-х суток на МПБ должен выглядеть преимущественно в виде круглых спор, возможно присутствие палочковидных клеток.
Проверка жидкой питательной среды после стерилизации на стерильность. Из каждой партии берут по 3-4 колбы с готовой автоклавированной средой, помещают в термостат при температуре 37 + 1°С и инкубируют 48-50 часов. Затем высевают на среду на косяки с мясо - пептонным агаром и одновременно - в пробирки с мясо - пептонным бульоном. В случае появления в среде посторонней микрофлоры всю партию среды следует ликвидировать.
Для определения титра клеток готовят несколько разведений культуры Bacillus megatenum «subsp. phosphaticum» из жидкого препарата.
Разведение 1:10.
10 мл жидкого препарата помещают в стеклянные мерные флаконы или колбы вместимостью 200-250 мл с 90 мл стерильной воды. Содержимое взбалтывают в течение трех минут и оставляют стоять в течение одного часа.
Разведение 1:100.
Из приготовленной бактериальной суспензии стерильной пипеткой отбирают 1 мл и вносят в колбу или флакон, содержащую 90 мл стерильной воды, затем хорошо перемешивают.
Затем готовят последующие десятикратные разведения препарата, используя для каждого разведения отдельные стерильные пипетки и колбы, со стерильной водой до разведения 1:108-1:10s.
Из каждого разведения 1:Ю8-1:109 засевают по три чашки Петри: берут 1 мл суспензии стерильной пипеткой из каждого разведения и помещают в центр стерильной чашки Петри. Затем в чашки заливают по 10 мл расплавленной и охлажденной до 40°С питательной среды и закрывают их крышкой. После застывания чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат при температуре +31±1°С.
Подсчет выросших колоний проводят визуально через 3-4 суток.
На мясо- пептонном агаре колонии Bacillus megaterium «subsp. phosphaticum мелкие, с ровными краями, круглые, выпуклые, матовые, гладкие, без слизи, непрозрачные, желтовато-белые. Титр (число жизнеспособных бактериальных клеток) в миллиардах на 1 мл препарата вычисляют по формуле:
A=nxl0*
где п. - среднее арифметическое числа колоний в трех чашках Петри
х - число десятикратных разведений .
За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое трех параллельных определений. За конечный титр принимается среднее арифметическое подсчетов трех биологических повторностей (три опыта по три чашки Петри в каждом).
Готовый жидкий препарат сливают в стерильную емкость для смешивания готового препарата. Из этой емкости с помощью стерильного цилиндра и воронки разливают препарат в стерильные флаконы из темного стекла и закрывают стерильными крышками с резиновыми или пластмассовыми прокладками.
Сушка препарата. Выращенную культуру Bacillus megaterium сушат в распылительной сушилке при 65 - 75 °С. Биомассу с остаточной влажностью 2- 3% смешивают с каолином. В 1 г препарата содержание жизнеспособных клеток должно быть не менее 8 млрд. Сухой препарат фосфобакгерина стабилен. При хранении в течение года потеря жизнеспособности бацилл составляет не более 20%.
Апробация готового удобрения показала высокую эффективность бактериального препарата в обеспечении растений фосфором. Данное удобрение может применяться как отдельно, так и в комплексе с другими микроорганизмами, обеспечивающими растения азотом, калием, кремнием, железом и другими необходимыми элементами минерального питания. Применение микроорганизмов способствует повышению урожайности, улучшает качество почвы и обеспечивает оптимизации использования биогеохимического потенциала почвы.
Вопросом, требующим отдельного изучения является экономичность и эко-логичность микробиологического удобрения в сравнении с внесением минерального фосфорного удобрения. Известно [5], что при внесении в почву фосфорных удобрений, вместе с ними вносятся мышьяк и радиоактивные вещества, натапливающиеся в почве и изменяющие ее агрономические свойства. С этой точки
зрения очевидно преимущество биологического способы повышения плодородия почвы с использованием штаммов автохтонных организмов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Звягинцева Д.Г. Почва и микроорганизмы,- М.: МГУ, 1987. - С. 256.
2. Почвоведение. - М.: Колос, 1975. - С. 496.
3. Сэги Й. Методы почвенной микробиологии. - М.: Колос, 1983. - С. 296.
4. Бабьсва И.П., Зенова Г.М. Биология почв. - М.: МГУ, 1989. - С. 336.
5. ХайнишЭ.идр. Агрохимикаш в окружающей среде.-М.:Кшос, 1979.-С. 357.
