Применение углеводородокисляющих микроорганизмов для очистки нефтезагрязненных почв Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

ПРИМЕНЕНИЕ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ОЧИСТКИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ

М. В. Ковальская, И. А. Тарасова

В крупных городах достаточно часто приходится сталкиваться с проблемами увеличения отходов органического состава и поиском способа быстрого эффективного обезвреживания. В настоящее время существует большое количество способов утилизации отходов такого рода, но наиболее перспективны биологичекие, основанные на интродукции активных сапротрофных микроорганизмов в загрязненную среду. Данный подход требует выделения и изучения активных микроорганиз-мов-сапрофитов, выделенных, например, из компостной ямы, наращивания их биомассы и последующего внесения в загрязненный объект.

Цель работы — создание биопрепарата для обезвреживания органических отходов и нефтезагрязнения.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. получить накопительную культуру сапротрофных бактерий;

2. выделить наиболее активные штаммы;

3. исследовать возможность роста выделенных штаммов микроорганизмов на синтетической среде с добавлением нефти, отработанного моторного масла и целлюлозы в качестве единственного источника углерода;

4. определить какой субстрат могут использовать данные штаммы в качестве источника углерода.

Стерилизацию чашек Петри, пробирок и колб производили сухим жаром при температуре 180 °С в течение 60 мин; питательные среды, минеральные добавки — насыщенным паром под давлением 1 атм при 121 °С в течение 20—30 мин [5].

Перед каждым посевом лабораторное помещение проветривали, проводили влажную уборку, обеззараживали воздух в помещении при помощи ультрафиолетового бактерицидного облучателя. Рабочее место (лабораторный стол, ламинарный бокс). и все рабочие поверхности протирали спиртом [3; 4].

Для получения накопительной культуры сапротрофных бактерий были отобраны несколько проб из компостной ямы. Полученную суспензию инокулировали в питательную среду с добавлением МПА. Для получения чистой культуры из отдельной колонии использовали принцип Коха [1].

Культуральные свойства колоний определяли визуально, морфологию клеток и цитологию — путем светлопольного микроскопиро-вания препаратов «раздавленная капля» и «фиксированный над пламенем горелки / окрашенный» (метод окрашивания по Граму) [2; 5].

Для проверки роста штаммов на различных субстратах в качестве единственного источника углерода использовали: нефть, моторное масло и целлюлозу. Нефть и масло вносились из расчета 5 % от общего объема среды. Контролем служили идентичные среды без внесения в них микроорганизмов [6].

Для учета численности микроорганизмов контрольные и опытные колбы помещали в шейкер Water bath shaker type 357 с амплитудой 2, скоростью с.р.ш 140 при температуре 30 °С. В

л

колбах отбирали пробы жидкости на 1-е, 2-е,

3-й, 4-е, 7-е, 9-е, 11-е, 14-е сутки. Численность оп-

t

ределяли путем подсчета клеток в камере Го-ряева-Тома.

Из семи чистых культур микроорганизмов, выделенных из компостной ямы, были отобраны два наиболее продуктивных штамма (№ 1 и N° 2). Данные культуральных свойств коло-

W

ний, морфологии клеток и цитологии представлены в табл. 1 и 2.

Изучена динамика численности сапротрофных бактерий, растущих на водном растворе с добавлением минеральных солей, при 5 % загрязнении среды нефтью, отработанным маслом и при внесении целлюлозы. На рис.1 представлена динамика численности штамма № 1, на рис. 2 — штамма № 2.

Максимальная удельная скорость роста первого штамма наблюдалась на субстрате с

© М. В. Ковальская, И. А. Тарасова, 2008

о

« с

X

5-5

о *

О X * §

5

о ¡5 X

й-б-

о о ? а

X с

*> я а

5

70

60 50 40 30

20

10 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Время, суг

€ -Рисунок 1

Динамика численности штамма № 1 сапротрофных микроорганизмов на водном

растворе с добавлением минеральных солей

а о

I5

а 5 о *

£ I £

О £ ^

2 ° ¥ а

I 5 § °

80 70

60 50 40 30

20

10 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Время, суг

Рисунок 2

Динамика численности штамма ЛЬ 2 сапротрофных микроорганизмов на водном

растворе с добавлением минеральных солей

добавлением нефти. Однако быстрый рост на 7-е сутки сменился резким уменьшением численности. Наиболее устойчивый. рост, о чем

♦ "я

свидетельствует продолжительная фаза «плато», наблюдался на среде с целлюлозой в качестве единственного источника углерода. На среде с добавлением отработанного масла

зафиксирован небольшой скачок численности на 3-й сутки, затем — стабильное уменьшение численности до нуля.

Исходя из полученных данных, можно сказать, что динамика первого штамма говорит о его способности использовать в качестве источника углерода все вышеперечисленные

126

ВЕСТНИК Мордовского университета | 2008 | № 2

Таблица / Свойства штамма № 1

Признаки Результаты

Описание колонии

Форма Круглая

Размер, мм 3

Цвет Белый

Край Бахромчатый

Блеск Матовый

Поверхность Шероховатая

Профиль Кратерообразный

Консистенция Вязкая

Морфология клеток и цитология ** 1 ] | ! 1 « Шш^ЖШж ШвШшШШшш . ^Ч ш ЩШШШШ ¡Ш V . : ■ - * ... " ■ " :• ^ : -х Ш ' * . ■ & % У "V' "• ■■;■ : шШ : ■ Ш * я Л л* я Х'.Х'Т- /Л/ЛЛ^., % Сч ч к-о у. . «V • V: ;«Л-, • \Гуллл- гта/.^^ЯАОтай^'^ух/^% Ж г V ^,чг X у. ^ •: .'"•:': :" УУтЩ^ : • :>. - .< : : '^: > . -ш^Н*.- '«г оВк*. ' • * 'Г ' % # М 1 , щ : уф Ш Ш , Щ Ш - •

! 1 | ( | \ j ^ «г . 1, . : Фш " ШШ : • - '- \ ■ '-

Форма и расположение клеток Укороченные палочки, одиночные, сцепленные по несколько

Подвижность Малоподвижные с круговым вращательным движением

Наличие эндоспор Есть, много

Окраска по Граму Грам «-»

Физиолого-биохимические свойства Рост на среде с нефтью С увеличением численности

Рост на среде с моторным маслом С сокращением чиленности

Рост на среде с целлюлозой С увеличением численности

субстраты или их отдельные компоненты (поскольку нефть и техническое масло — это многокомпонентные вещества). Наибольшим биотоксическим эффектом обладает отработанное масло, вероятно, из-за присутствия в его составе тяжелых металлов и различных присадок. Аналогичный вывод можно сделать на основании динамики роста на нефти.

Штамм № 2 показал сходные свойства на среде с добавлением отработанного масла (незначительный скачок численности и ее плавное уменьшение).

Способность использовать целлюлозу в качестве источника углерода на 2—2,5 по-

рядка выше, чем у предыдущего штамма и выше, чем способность утилизировать нефть.

В результате проделанной работы было выделено 7 сапротрофных штамма и получены их чистые культуры. Два наиболее активных штамма были подробно изучены; описаны культуральные свойства их колоний, морфология клеток и цитология. В будущем планируется провести дополнительные исследования с целью определения их систематической принадлежности.

На втором этапе работы были поставлены эксперименты, направленные на определение

Таблица 2 Свойства штамма № 2

круга субстратов, которые данные штаммы способны использовать в качестве единственного источника углерода и соответственно разлагать его (утилизировать). Данный опыт показал, что штамм № 1 обладает повышенной способностью разлагать нефть, а штамм № 2 — целлюлозу. Отработанное масло для этих видов микроорганизмов ток-

сично и не отвечает условиям их нормального развития.

Данная работа в будущем может иметь практическое применение для создания коллекции штаммов, способных утилизировать органику различного состава, и применения их для биологической утилизации и переработки отходов.

Признаки

Описание колонии

Результаты

Форма

Круглая

Размер, мм

Цвет

1

Белый

Край

Блеск

Гладкий

Матовый

Поверхность

Шероховатая

Профиль

Кратерообразный

Консистенция

Морфология клеток и цитология

Вязкая

Л

м #

т

• У /

'."¿г '.^уУ.^\ «уУХАП»/• ^'"'5' ^ «V ' /,/ Ул у 'Л д.- у ■«• . . .* -.,* -ч

* >> ? /: • : ШйИ

••••б*- '■ •-•". ."-

V -Л-;-.' Ж"

л

^ £

г* ■

ШШЙ йШ ... \vmC-

% ■ - ** # ■фрШШШж

^ йЕ ¿Г : Г№ Ж : Ж,

Форма и расположение клеток

Длинные палочки, одиночные, сцепленные по

несколько

Подвижность

Нет

| I

Наличие эндоспор

Нет

Окраска по Граму

Грам «-»

Физиолого-биохимические свойства Рост на среде с нефтью_

С увеличением численности

Рост на среде с моторным маслом

С сокращением численности

Рост на среде с целлюлозой

С увеличением численности

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

V I

1. Иерусалимский Н. Д. Проблемы микробиологии углеводородов / Н. Д. Иерусалимский, Г. К. Скрябин // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1965. № 1. С. 53.

2. Методы общей бактериологии : под ред. Ф. Герхардта и [др.]. М. : Мир, 1983. С. 536.

3. Общая микробиология ; пер. с нем. М. : Мир, 1987. С. 567.

128

ВЕСТНИК Мордовского университета | 2008 | № 2

4. Определитель бактерий Берджи / под ред. Д. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уильямса. М. : Мир, 1997. Т. 1, С. 430.

5. Практикум по микробиологии / Е. 3. Теппер, В. К. Шильникова, Г. И. Переверзева ; изд. 2-е, перераб. и доп. М. : Колос, 1979. С. 216.

6. Хабибуллина Ф. М., Оценка углеводородокисляющей активности микроорганизмов / Ф. М. Хабибуллина, А. А. Шубаков, И. Б. Арчегова, Г. Г. Романов // Биотехнология. 2002. № 6. С. 57—62.

,7. Rester A. S. Activity of soil microflora in conditions oi oil pollution / A. S. Kester, J. W. Foster /?_ J. Bacteriol. 1963. P. 85.

8. Leahy J. G. Decomposition of mineral oil a various degree of condensation by microorganisms at the lowered temperatures / J. G. Leahy, R. R. Colweil // Microbiol. Rev. 1990, V. 54, P. 305—315.

9. Morgan P. The grounds recultivatsija and clearning of a surface of reservoirs of petropollution / P. Morgan, R. J. Watkinson // Crit. Rev. Biotechnol. 1989, V. 8, P. 305—333.

Поступила 04.02.08.

ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ САПРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ

И. А. Тарасова, М. В. Ковальская

Природные экосистемы, не подвергшиеся вмешательству человека, способны к самоочищению. Таким образом природа сама справляется с переработкой более не нужного ей органического материала. В утилизации органики участвует почва, содержащая естественную биоту (микроорганизмы, эдафон).

С •

Разнообразие почвенных микроорганизмов составляет микрофлору почвы, которая участвует в переработке мертвой органики в плодородный гумус.

Антропогенное воздействие на окружающую среду приводит к загрязнению почвы отходами производств и жизнедеятельности, где значительное место отведено органическим загрязнителям. Из-за этого изменяется соотношение между отдельными группами микроорганизмов, происходит подавление естественной биоты, в целом нарушаются естественные процессы самоочищения, почвообразования, накапливаются неразлагаемые отходы. Скопления трудноразлагаемых отходов приводят к экологическому дисбалансу и ухудшению санитарных условий жизни людей [2].

I *

Данную экологическую проблему позволяет решить использование биопрепарата со специально подобранными микроорганизмами, ранее выделенными из почвы. Подобранные виды микроорганизмов-сапротрофов способны

использовать различные виды мертвой органики в качестве основного источника энергии жизнедеятельности и редуцировать их на безвредные для окружающей среды продукты микробного метаболизма [8]. Данный метод позволит восстановить и ускорить процесс естественного самоочищения почвы.

Цель работы — получение чистой культуры сапротрофных бактерий из отобранных проб компостной ямы.

Для выполнения данной цели были сформулированы следующие задачи:

— получить отдельные колонии с помощью метода Коха;

— провести идентификацию полученных колоний, отобрать колонии с различными видами микроорганизмов.

Стерилизацию чашек Петри, пробирок и колб производили сухим жаром при температуре 180 °С 60 мин; питательные среды — насыщенным паром под давлением 1 атм при 121 °С в течение 20—30 мин [5].

Перед каждым посевом лабораторное помещение проветривали, проводили влажную уборку, обеззараживали воздух в помещении при помощи ультрафиолетового бактерицидного облучателя. Рабочее место (лабораторный стол, ламинарный бокс) и все рабочие поверхности протирали спиртом [3; 4].

© И. А. Тарасова, М. В. Ковальская, 2008