CC BY
67
УДК:616.311.2-055.26:57.083.3
Л.Й. Островська, Т.О. Петрушанко, 1.П.Кайдашев
ПОЛ1МОРФ1ЗМ А8р299С1у ГЕНА То11-ПОД1БНОГО РЕЦЕПТОРА 4 У ГЕНЕЗ1 ЗМ1Н ЯСЕН У ВАГ1ТНИХ
Вищий державний навчальний заклад Украши "Украшська медична стоматолопчна академiя", Науково-дослiдний iнститут генетичних та iмунологiчних основ розвитку патологii та фармакогенетики, м. Полтава
Вступ. Передумови формування та мехашзми реашзаци генетично обумовленоi патологii в людини потребують усебiчного вивчення. Особливо це важливо щодо вродженоi та спадковоi патологи. Ефективна пренатальна дiагностика генетично обумовлених хвороб передбачае досконалу iх преконцепцшну профiлактику, тобто формування груп ризику щодо вщтворення дано!' патологii ще до настання вагiтностi [1]. На сьогодш осо6ливо!' актуальностi набувае вивчення полiморфiзму генiв регуляторних молекул запалення [2]. Знання 'хньо!' ролi в патогенезi багатьох хвороб, поряд iз досягненнями сучасноi геномiки, дозволяе прогнозувати ризик розвитку патологи або тяжюсть и перебiгу та пiдiбрати специфiчну терапiю або ж вiдповiдну корекцш в схемi лжувально-профiлактичних заходiв для вагiтних. Так, установлено, що вiдправною точкою запуску запалення при гшпвт е наявнiсть Toll-подiбних (То11-т1ег1еикт-1-гесер1;ог) рецепторiв у зовнiшнiй мембраш нейтрофiлiв, макрофагiв, кератиноцитiв, якi забезпечують молекулярну рецепцiю патогена iз подальшим включенням важливих компонентiв спадкового iмунiтету [3,4].
Метою нашого дослщження було вивчення ролi полiморфiзму Asp299Gly гена Toll-подiбного рецептора 4 (TLR4) в реашзацп схильност до виникнення запальних процесiв ясен у I тримес^ вагiтностi.
Об'екти i методи дослiдження. Проведено кшшко-лабораторне обстеження в першому триместрi 104 ваптних вiком 18-37 рокiв, як перебували на облiку в жшочш консультацiï м. Полтави. Усi жшки проходили стоматологiчний огляд i3 детальним вивченням пародонтологiчного статусу, оцiнкою ппени порожнини рота. Об'eктивiзували стан тканин пародонта на основi аналiзу пашлярно-маргiнально-альвеолярного iндексу (РМА) в модифжацп C.Parma (1960), iндексу CPITN, кровоточивост за Muhlemann-Sax. Отриманi показники стоматолопчного обстеження реестрували в спецiально розроблених картах шдивщуального спостереження за ваптними.
Забiр зразк1в букальних епiтелiоцитiв ваптних проводили стерильним одноразовим зондом, який вносили в епендорфи з реактивом "ДНК-експрес". Геномну ДНК видели за допомогою набору "ДНК-експрес" ("ЛитТех", Москва). Полiморфну дiлянку Asp299Gly гена Toll-подiбного рецептора 4 амплiфiкували за допомогою полiмеразноï ланцюговоï реакцiï в 25 мкл реакцiйноï сумiшi, що мiстила:
• 2,5 мкл 10 х Buf для амплiфiкацiï;
• 2 мМ хлориду магнш;
• 0,2 мМ кожного dNTP;
• 2,5 од. ДНК-полiмерази Tag;
• 20-50 нг. геномно!' ДНК;
• по 66 нг праймерiв для Asp299Gly:
F: 5'-GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3' R: 5'-GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC-3' У пробiрки нашаровували 25 мкл мiнерального масла. Амплiфiкацiю проводили на амплiфiкаторi "Терцик" ("ДНК-Технология", Москва). Для
щентифшаци алелей проводили рестрикцiйний аналiз амплжошв за допомогою ендонуклеази рестрикцп Nco I. У результатi рестрикцп були отримаш фрагменти розмiром 263 bp та 222 bp. Продукти розщеплення полiморфноi дiлянки гена виявили за допомогою електрофорезу в 3% агарозному гелi в 1 х TBE (50 мМ трис-Н3В03 та 2 мМ ЕДТА, рН 8.0) (протягом 2 год. при напрузi 2V на 1 см. гелю). У ролi маркера молекулярноi ваги ДНК використовували pBR322/BsuRI. Гелi фарбували етидiумом бромiдом iз подальшою вiзуалiзацieю результат в УФ-свiтлi.
Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою критерш х2 . Для аналiзу взаемозв'язюв к1льк1сних параметрiв, як1 вивчалися, визначали коефiцieнт парноi кореляцп Кендела.
Результати дослщження. Клiнiчне обстеження вагiтних у стоматолога виявило, що основними скаргами були кровоточивють ясен, неприемний запах iз порожнини рота, бiль у яснах шд час чищення зубiв. Бiльшiсть жiнок указували на появу зазначених скарг шд час ваптносп, але деяк1 обстеженi вказували на ix наявнiсть ще до появи вагiтностi.
За результатами об'ективних дослщжень змiни тканин пародонта зареестровано в жшок уже в I триместрi вагiтностi, при цьому реестрували переважно генералiзований катаральний гiнгiвiт (85,2%), що зб^аеться з даними С.М. Толмачевоi [5], а також папiлiт (13%) та пародонтит (1,8%); шдекс гшени в середньому склав 0,47±0,03, що, загалом, вiдповiдае рiвню доброго стану гшени порожнини рота; середш показники шдексу кровоточивостi за Muhlemann-Sax склали 1,02±0,13. Аналiзуючи результати iндексу CPITN, можна зазначити, що 42 жшки (40,3%) потребували застосування заxодiв професiйноi гiгiени порожнини рота.
Переважна бшьшють хвороб тканин пародонта мала запальний (папiлiт, гiнгiвiт) та запально-дистрофiчний характер (пародонтит). Мшробного генезу гiнгiвiт виникае внаслщок запально!' вiдповiдi макроорганiзму на скупчення мiкробiв, що контактують iз тканинами ясен.
З самого початку вщповщь оргашзму спрямована винятково на факультативну мжрофлору порожнини рота, що утворюе основу зубного нальоту, в якому превалюють грампозитивш бактерп [6,7]. По Mipi прогресування запалення та включення в процес перюдонтально!' зв'язки, юстково!' тканини в зубному нальот з'являються, а попм превалюють грамнегативнi штами [8]: Porphyromonas gingivalis (P.g.), Actinobacillus actinomycetemcomitans (A.a.), Bacteroides forsythus, Prevotella intermedia, Treponema denticola та ш. [9]. Захисна функщя здорових ясен забезпечуеться системою iмунокомпетентних клiтин, дисфункцiя яких розглядаеться як основа запуску та розвитку гшпвггу i пародонтиту. Останнiм часом у науковш лiтературi, в тому чи^ i з пародонтологп, помина зацiкавленiсть дослiдженнями молекулярного рiвня, зокрема бшьш ранньо!' системи захисту оргашзму вщ патогенiв - уроджено!' iмунноi вiдповiдi [2-4,10,11,14,15].
Слiд зазначити, що найчастшою причиною вiдмiнностей у структурi генiв е точковi мутацп - замши одиничних нуклеотидiв, так званий полiморфiзм одиничних нуклеотидiв (SNP-single-nucleotide polymorphism), який за рахунок формування специфiчних алелей генiв посилено впливае на особливост розвитку захисних реакцiй та схильшсть до низки захворювань [10,11]. Захист на мюцевому рiвнi шсля потрапляння в тканини патогена розвиваеться шляхом формування типово!' запально!' реакцп з ii класичними проявами: гiперемiя, набряк, поява больового синдрому та порушення функцп. Епiтелiальнi клiтини ясен першими за допомогою мембранного рецепторного апарату починають реагувати на скупчення бактерiальних продуклв у складi мжробно!' бляшки генерацiею сигналiв. Початок розвитку ще' реакцп пов'язують iз первинним з'еднанням TLR4 iз молекулярними патернами (РАМР) бактерш, вiрусiв, грибiв, що е пусковим мехашзмом розвитку запального процесу. Сигнал, що передаеться в кштину через цей рецептор, функцюнально близький до
рецептора штерлейкшу-1 та е одним iз головних у системi антибактерiального захисту оргашзму. Толл-подiбнi рецептори активуються рiзними лiгандами, що, головним чином, е структурними компонентами бактерiй, вiрусiв та грибiв. Пiсля зв'язування лiганда та активацп рецептора останнiй зв'язуеться в цитоплазмi з Т1Я-домен-умiсними адаптерними бшками. ТЬЯ4 може взаемодiяти з МуБ88 або Т1ЯАР, iндукуючи синтез протизапальних цитокiнiв, або з Т1САМ-1 i Т1САМ-2, що приводить до синтезу штерферошв. Адаптернi бiлки зв'язуються зi специфiчними ферментами-к1назами, що значно тдсилюють сигнал та приводять до шдукцп певних генiв, як1 визначають запальну вщповщь клiтини.
За результатами проведених полiмеразних ланцюгових реакцiй для визначення алеля О ТЬЯ4 у букальних епiтелiоцитах 104 вагiтних виявили його наявшсть у 17,3±3,7 % обстежених (18 жшок), у яких кштчно також дiагностовано наявнiсть запальних змш у тканинах пародонта. У анамнезi хвороби 10 (9,6±2,9,8%) iз 18 вищезазначених вагiтних вiдмiтили наявшсть кровоточивост ясен, больових вiдчуттiв у них, а також виразного запального процесу задовго до настання ваптность
Детальний аналiз результат генетичного дослщження показав, що 16 ваптних iз дiагностованими змiнами тканин пародонта мали фрагменти розмiром 263 Ьр (АА/АО - гетерозигота), а ще 2 жшки - фрагменти розмiром 222 Ьр (ОО/ОО - гомозигота мутантного типу). Бшьш вираженi клiнiчнi прояви запальних змш у тканинах пародонта спостершали в жшок iз наявнiстю гомозиготи мутантного типу (ОО/ОО). "Дикий тип" (АА/АА) генотипу Авр299О1у (нормальний розподш алелей) загалом склав у груш 104 обстежених 82,7±3,7% (табл. 1).
Таблиця 1
Розподш мутантних алелей Asp299Gly TLR4 у вагiтних залежно вщ
стану тканин пародонта
Характеристика обстежених Гомозигота (AA/AA) Гетерозигота (AA/AG) Гомозигота (GG/GG) Алель А Алель G
Ваптш з штактним пародонтом (50 жшок) 50(100%) 0(0%) 0(0%) 50(100%) 0(0%)
Ваптш з1 змшами тканин пародонта (54 жiнки) 36(66,7%) 16(29,6%) 2(3,7%) 52(75%) 18(25%)
Лiтературнi дат свщчать, що полiморфiзм гена TLR4 мае зв'язок iз характером розвитку запально!' патологii, особливо при хворобах, викликаних грамнегативними мiкроорганiзмами, що повною мiрою обгрунтовуеться 'хньою ключовою роллю в розпiзнаваннi та розвитку запально!' вiдповiдi на ЛПС, а носи цього полiморфiзму характеризуються схильнiстю до тяжчого переб^у хвороби, що зб^аеться з лiтературними даними [12,13].
За результатами статистичного аналiзу критерiю X отримат данi щодо виявлення алеля G винятково в групi ваптних, якi мають запальнi змiни тканин пародонта (33,3%), та не зустрiчаеться в груш обстежуваних з штактним пародонтом. Так, у пацiентiв, як мають мутантнi алелi, вiдсутня резистентшсть до розвитку запалення пародонта ^ропдтсть вiдмiнностей, р<0,001). Натомiсть у 36 жшок (66,7%) не пiдтверджено наявшсть зазначених виявлених мутантних алелей гешв, але зареестровано клiнiчнi прояви хвороб тканин пародонта, що, можливо, обумовлено впливом комплексу мюцевих патогенних чинниюв та гормональних змiн у перюд вагiтностi [13], що призводить до появи чи посилюе перебiг
патолопчних реакцш у тканинах пародонта. Необхщно зазначити наявнiсть достовiрного прямого кореляцшного зв'язку за Кенделом (p<0,05) алеля G в I тримес^ з показниками, що характеризують запалення тканин пародонта ваптних, зокрема, iндекс РМА, iндекс кровоточивост за Muhlemann-Sax, iндекс CPITN та негативного зв'язку зi швидкiстю сал1ваци.
Епiтелiй порожнини рота перебувае шд впливом змiн як при стоматолопчнш, загальносоматичнiй патологи, так i шд час вагiтностi. Адгезiя кандидозних кштин та патогенно!' флори знаходить свое вщображення в низькому рiвнi ппени порожнини рота, високому рiвнi запальних процесiв у яснах, що може бути пов'язане з шдсиленням кератишзацп клiтин та збiльшенням адгезивних властивостей букальних епiтелiоцитiв пiд дiею естрогенних гормонiв протягом вагiтностi, що е додатковим причинним фактором у реалiзацil схильност до виникнення запальних процешв ясен у I триместрi ваптность При цьому пiсля взаемодп бактерiальних лiпополiсахаридiв (ЛПС) iз мембранними патерн-розпiзнавальними рецепторами (ПРР) запускаеться внутршньокштинний каскад передачi сигналу, що, в свою чергу, призводить до експресп гешв цитокiнiв, ферментiв, регуляторних молекул запалення, тдсилення функцюнально! активностi лейкоципв [14,15]. Загалом толл-подiбнi рецептори е одним iз найсильнiших клiтинних модуляторiв.
Отже, виявленi результати свiдчать про виявлення алеля G, який достовiрно пов'язаний iз виникненням запалення в тканинах пародонта. Тому ниш виникае необхщшсть урахування дiагностики полiморфiзму гешв, а саме Asp299Gly TLR4, з метою прогнозування виникнення i розвитку запальних хвороб тканин пародонта, що важливо для обгрунтування та розробки профiлактично-лiкувальних заходiв у вагiтних.
Л^ература
1. Заставна Д.В. 1муногенетичш фактори реашзацп генетично обумовлено!' патологи : автореф. дис. на здобуття наук. ступеня доктора мед. наук: 03.00.15 / Д.В. Заставна. - К., 2004. - 16 с.
2. Симбирцев А.С. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления / А.С.Симбирцев, А.Ю. Громова // Цитокины и воспаление. - 2005. - Т.4, №1. - С. 3-10.
3. Симбирцев А.С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета / А.С. Симбирцев // Иммунология. - 2005. -№6. - С. 368-376.
4. Байракова О.Л. Роль и биологическое значение толл-подобных рецепторов в антиинфекционной резистентности организма / О. Л .Байракова, Е.А.Воропаева, С.С.Афанасьев [и др.] // Вестник Российской АМН. - 2008. - №1.- С. 45-54.
5. Толмачева С.М. Стоматологические заболевания в период беременности и их профилактика / С.М. Толмачева, Л.М. Лукиних. - М.: Медицинская книга, 2005. - 150 с.
6. Перова М.Д. Новый взгляд на развитие и репарацию повреждений тканей пародонта с позиций молекулярной медицины (аналитический обзор). Ч. I. Механизмы рецепции патогенов и передачи сигналов о функциональном состоянии тканей / М.Д.Перова, М.Г.Шубич, В.А.Козлов // Стоматология. - 2007 - №3. - С.76-80.
7. Bainbridge B.W. Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide: an unusual pattern recognition receptor ligand for the innate host defense system / B.W. Bainbridge, R.P. Darveau // Acta Odontol. Scand. - 2001. - N 59. - P. 131-138.
8. Darveau R.P. The microbal challenge in periodontitis / R.P. Darveau, A. Tanner, R.C. Page // Periodontol. - 2003. - Vol. 14. - P. 12-32.
9. Jassens S. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition / S. Jassens, R. Beyaer // Clin. Microbiol. Rev. - 2003. - Vol. 16. - P. 637 - 646.
10. Sandor F. Toll-like receptors. Biological significance and impact for human medicine / F. Sandor, M. Buc // Folia Biol. ( Praha). - 2005. - Vol. 51. - P. 198 - 203.
11. Human toll-like receptor 4 mutation but not CD14 polymorphisms are associated with an increased risk of gram-negative infection / D. Agness, J. Calvano, S. Hahm [et al.] // J. Infect. Dis. - 2002. - Vol.186. - P. 1522-1528.
12. Сапронова Е.А. Сравнительная морфологическая характеристика десневого и буккального эпителия у женщин в разные фазы менструального цикла / Е.А. Сапронова, Б.Я. Рыжавский, И.Ф.Служаев // Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - №8. - С.34-37.
13. Schnare M. Toll-like receptors: sentinels of host defence against bacterial infection / M. Schnare, M. Rollinghoff, S. Qureshi // J.Allergy Immunol. -2006. - Vol.139.- P.75-85.
14. Toll-like receptors 4 polymorphisms and atherogenesis / S. Kiechl, E. Lorenz, M. Reindl M. [et al.] // N. Engl. J. Meed. - 2002. - Vol.347. - P.185-192.
15. Association between the Asp299Gly polymorphisms in the Toll-like receptor 4 and premature births in the Finnish population / E. Lorenz, M. Hallmam, R. Marttila [et al.] // Pediatr. Res. - 2002. - Vol. 52. - P. 373 - 376.
Стаття надшшла 3.10.2009 р.
Резюме
Проведено изучение роли полиморфизма Asp299Gly гена Toll-видного рецептора 4 (TLR4) в реализации склонности к возникновению воспалительных процессов десен в 1 триместре беременности. Представлен анализ взаимосвязей аллеля G с обнаруженными изменениями в тканях пародонта у беременных путем статистической обработки и обнаружены корреляционные связки аллеля G с показателями, которые характеризуют воспаление десен у беременных, в частности,
индекс РМА, индекс кровоточивости за Muhlemann-Sax, индекс CPitn и со скоростью саливации.
Ключевые слова: беременность, пародонт, Toll-видный рецептор 4, аллели A, G.
Summary
The role of polymorphism of a gene of Toll-like receptor 4 (TLR4) in the realization of inclination to inflammatory processes occurrence in gums in women in the first trimester of pregnancy has been studied. The analysis of interrelations of allele G with determined changes in parodentium tissues in pregnant women has been represented. The correlated connections of allele G with indices, which characterize the inflammation of gums in pregnant women, PMA index, index of bleeding according to Muhlemann-Sax, index CPITN, and with rate of salivation have been estimated.
Key words: pregnancy, parodentium, Toll-like receptor 4, alleles A,G.
