CC BY
42
Химия растительного сырья. 2011. №4. С. 219-222.
УДК 547.915:665.5
ПОЛИЕНОВЫЕ КИСЛОТЫ ЛИСТЬЕВ CORTUSA TURKESTANICA A. LOZINSK. (СЕМЕЙСТВО PRIMULACEAE)
© Д. Т. Асилбекова , Х.Р. Нуриддинов
Институт химии растительных веществ им. акад. С.Ю. Юнусова АН РУз, ул. Мирзо Улугбека, 77, Ташкент, 700170 (Республика Узбекистан)
Впервые выделены липиды из свежих листьев Cortusa turkestanica A. Lozinsk. (Семейство Primulaceae), установлен состав липидов и жирных кислот основных ацилсодержащих ингредиентов. Кислоты, полученные из гомогенных фракций фосфолипидов (ФЛ, 25,5% от массы ОЛ), моно- (МГДГ, 17,3) и дигалакгозилдиацилглицеринов (ДГДГ, 7,6), триа-цилглицеринов (6,0), эфиров алканолов и фитостеролов с жирными кислотами (ЭС, 6,0), а также свободные жирные кислоты (СЖК, 14,1) анализированы методом ГХ/МС в виде их метиловых эфиров. Среди ацильных фрагментов МГДГ, ДГДГ и ТАГ идентифицированы редко встречающиеся в высших растениях полиеновые кислоты 18:4 ю3 (стеаридоновая кислота, 6,9, 6,2 и 2,1) и 18:3 ю6 (у-линоленовая кислота, 2,4, 2,0 и 1,2), обнаруженные ранее в ТАГ и полярных липидах семян изученного вида. В наборе кислот ТАГ листьев дополнительно обнаружены мзо-15:0, антеизо-15:0 и антеизо-17:0 кислоты (0,2, 1,1 и 1,2% ГХ соответственно), а в СЖК найдена только у-линоленовая кислота (1,7%).
Устаовлено, что в качестве хемотаксономического маркера для идентификации вида Cortusa turkestanica A. Lozinsk. и систематики растений, содержащих Д-6 18:3 и 18:4 кислоты, более достоверно использовать состав кислот га-лактолипидов листьев и ТАГ семян.
Ключевые слова: Primulaceae, Cortusa turkestanica A. Lozinsk., липиды, полиеновые жирные кислоты, у-линоленовая кислота, стеаридоновая кислота.
Введение
На территории Узбекистана произрастает 19 видов растений семейства Primulaceae (Первоцветных), относящихся к 8 родам, в том числе единственный вид, относящийся к роду Cortusa - Cortusa turkestanica A. Lozinsk. (кортуза туркестанская). Вид распространен в основном в среднем поясе гор, в тени скал, на влажных лужайках и по берегам ручьев [1, 2].
Представители семейства Primulaceae, растущие в нашем регионе и Средней Азии в целом, исследованы в химическом отношении совершенно недостаточно. Имеются некоторые сведения о видах, произрастающих в Киргизии [3]. Среди них вид C. turkestanica, содержащий 7,3% сапонинов с гемолитическим индексом 25000, выделен как перспективное сапониноносное растение. Отмечено, что для всех первоцветных характерно присутствие сапонинов, тритерпеновых гликозидов [4].
Известно [5-10], что виды триба Primuleae, к которым относится род Cortusa, содержат биологически активные Д6-полиеновые жирные кислоты C18: октадека-62,92,122-триеновую (у-линоленовую, 18:3 ю6) и OKTafleKa-6Z,9Z,12Z, 15Z-Terpaeновую (стеаридоновую, 18:4 ю3). Кроме первоцветных, они вместе присутствуют в липидах семян представителей семейств Boraginaceae, Saxifragaceae и Scrophulariaceae [5].
Кислоты 18:3 ю6 и 18:4 ю3 идентифицированы в листьях, корнях и семенах растений рода Primula ив виде C. cortusoides L., принадлежащей к секции Cortusoides [6-9]. В надземной части P. macrophylla и P. macrocalyx [8, 9] дополнительно были идентифицированы разветвленные изо- и антеизо-кислоты. Авторы работы [9] находили полиеновые и разветленные кислоты не только в общих липидах, но и в наборе свободных жирных кислот P. macrocalyx.
Результаты нашей предыдущей работы показали, что в семенах Cortusa turkestanica присутствуют полиеновые 18:3 ю6, 18:4 ю3 и разветвленные изо-17:0 и антеизо-17:0 кислоты [10]. Полиеновые и разветвленные кислоты находились в составе ацильных фрагментов триацилглицеринов и полярных липидов, но отсутствовали в наборе свободных жирных кислот. В аспекте фундаментальных исследований липидов
* Автор, с которым следует вести переписку.
растений отечественной флоры представляет интерес сравнительное изучение жирных кислот различных групп липидов запасных и фотосинтетических тканей, так как данные подобного типа для таксонов, содержащих Аб-полиеновые кислоты, почти отсутствуют. В связи с вышеуказанным целью представленной статьи является исследование состава жирных кислот основных ацилсодержащих липидов листьев C. turkestanica, а также кислот, обнаруживаемых в листьях в свободной форме.
Экспериментальная часть
В работе использовали листья из свежей надземной части растения, собранной в Ташкентской области (Узбекистан) в 2008 г.
Перед извлечением общих липидов (ОЛ) ферменты исследуемого материала инактивировали горячим изопропанолом, общие липиды экстрагировали смесью хлороформ - метанол (2 : 1, v/v). Для удаления нелипидных примесей экстракт промывали 0,04% раствором CaCl2 [11].
Компоненты ОЛ идентифицировали методом ТСХ с применением специфических проявителей следующим образом: нейтральные липиды (НЛ), в том числе и фитостеролы, обнаруживали раствором 50% H2S04 при сжигании, фосфолипиды (ФЛ) - нингидрином (фосфатидилэтаноламины) и реагентами Драген-дорфа (фосфатидилхолины) и Васьковского, гликолипиды (ГЛ) - а-нафтолом и 50% H2SO4 при нагревании. ТСХ для аналитических и препаративных целей осуществляли на готовых пластинках Silufol UV-254 (Венгрия) и на пластинках с силикагелем марки L 5/40, содержащим 15% CaSO4 (Чехия). Применяли следующие системы растворителей (по объему): гексан - диэтиловый эфир (4:1), гексан - диэтиловый эфир - уксусная кислота (90 : 10 : 1 и 70 : 30 : 1; для НЛ), хлороформ - ацетон - метанол - уксусная кислота - вода (65 : 20 : 10 : 10 : 3; для ГЛ) и хлороформ - метанол - 25% аммиак (13 : 5 : 1; для ФЛ).
КХ проводили на силикагеле марки L100/160 (Чехия), промытом смесью хлороформа с метанолом (2 : 1, v/v). НЛ липиды элюировали бензином (60-70 °С) с постепенно увеличивающейся концентрацией диэтилового эфира (4, б, 10, 15, 20, 50 и 100%), ГЛ - ацетоном, ФЛ - метанолом. Фракции, обогащенные моно- (МГДГ) и дигалактозилдиацилглицеринами (ДГДГ), триацилглицеринами (ТАГ), свободными жирными кислотами (СЖК), эфирами алканолов, тритерпенолов и стеролов (ЭС), дополнительно очищали препаративной ТСХ с силикагелем. Для выделения чистых фракций галактолипидов применяли систему растворителей хлороформ - бензол - вода (91 : 30 : 8).
Жирные кислоты липидов получали после мягкого щелочного гидролиза и метилировали диазометаном.
ГХ/МС метиловых эфиров жирных кислот осуществляли на газовом хроматографе Agilent GC 7890A c квадрупольным масс-селективным детектором Agilent 5975B inert MSD в качестве детектора. Использовали капиллярную кварцевую колонку HP-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Газ-носитель - гелий, скорость потока 1 мл/мин (split less ввод пробы). Температурный режим колонки: 4 мин при 70 °С, от 70 до 280°С со скоростью 10 °С/мин, 10 мин при 280 °С. Температура инжектора, источника ионов и квадрупола 280, 230 и 150 °С соответственно. Идентификация метиловых эфиров жирных кислот основана на сравнении времени удерживания и полных масс-спектров с данными электронной масс-спектральной библиотеки Wiley 8th Edition/NIST05. Соотношение ненасыщенных кислот оценивали по масс-спектрометрическим данным.
Обсуждениерезультатов
Выход ОЛ из листьев C. turkestanica составил 5,3% в пересчете на сухую массу.
Данные по составу ОЛ, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что в общей сумме преобладает доля полярных компонентов (59,4%), состоящих из ГЛ и ФЛ. Уровень ГЛ оказалось выше, чем ФЛ, но меньше, чем сумма НЛ.
В составе НЛ определили СЖК, ТАГ, СЭ, свободные жирные спирты, тритерпенолы и стеролы, а также углеводороды, каротиноидные и хлорофилловые пигменты. Наибольший вклад в состав НЛ вносят СЖК (14%) (табл. 1), а нейтральные ацилсодержащие компоненты - ТАГ и СЭ присутствуют в равных количествах (по 6%). Доля липофильных веществ (сумма углеводородов, пигментов и спиртов) в ОЛ превышает 14%.
Гликолипиды включали МГДГ и ДГДГ, сульфохиновозилдиацилглицерины, стерилгликозиды и их эфиры. Основные компоненты представлены галактолипидами - МГДГ и ДГДГ.
Хроматографированием на микроколонке ГЛ с последующим рехроматографированием препаративной ТСХ выделили гомогенные фракции галактолипидов. Выход МГДГ и ДГДГ составил 17,3 и 7,6% от массы ОЛ соответственно.
Компоненты Содержание, %
Углеводороды и ^-каротин 3,8
Эфиры алканолов и фитостеролов и ком- 6,0
поненты эфирных масел
Триацилглицерины 6,0
Свободные жирные кислоты 14,1
Жирные спирты, тригерпенолы и стеролы 9,2
Сумма пигментов и неидентифицирован- 1,5
ных липофильных веществ
Гликолипиды 33,9
Фосфолипиды 25,5
В составе ФЛ качественно Таблица 1. Состав общих липидов листьев Cortusa urkestanica идентифицировали следующие соединения: фосфатидилглицерины, фосфа-тидилэтаноламины, фосфатидилхо-
лины, фосфатидилинозиты и фосфа-ТИДНЫе кислоты, среди них последний компонент является минорным.
По составу жирных кислот липидов листьев C. turkestanica, представленному в таблице 2, видно, что они существенно различаются качественно и количественно. В наборе кислот ТАГ присутствуют 17 ингредиентов, из которых 14 компонентов обнаруживаются также в неглицеридных эфирах (СЭ). В составе ацильных фрагментов СЭ превалируют насыщенные компоненты, в основном пальмитиновая кислота. В этих двух нейтральных ацилсодержащих липидах находится разветвленные кислоты С15 и С17. Анализ имеющихся литературных данных показал, что изо- и антеизо-кислоты содержатся в общих липидах надземной части P. macrocalyx [9]. В данном растении, распространенном а Алтайском крае, идентифицирован большой набор средне- (С12-С19) и высокомолекулярных (С25-С29) изо- и антеизо-кислот, некоторые из которых найдены и составе СЖК. В общих липидах надземной части родственного вида P. macrophylla, собранном на Памире авторами работы [8], обнаружены только изо-С16 иС18и антеизо- С15 и С17 кислоты. Ранее нами были идентифицированы изо-17 : 0 и антеизо-17 : 0 кислоты (0,1 и 0,2% соответственно) в ТАГ семян C. turkestanica [10]. Как и в семенах, так и в листьях изученного вида мы не находили разветвленные кислоты, присутствующие в свободной форме.
В наборе кислот полярных липидов и среди СЖК листьев C. turkestanica находятся 7-8 компонентов, которые различаются по содержанию отдельных ингредиентов. В МГДГ и ДГДГ, а также в составе СЖК доминируют ненасыщенные составляющие, причем основной является а-линоленовая (18:3 œ3). В отличие от полярных глицеролипидов, в ТАГ и СЭ больше содержание 18:2 шб (линолевой) кислоты, чем 18:3 ш3.
Отличительная особенность состава кислот галактолипидов (МГДГ и ДГДГ) и ТАГ листьев C. turkestanica - наличие в них одновременно у-линоленовой и стеаридоновой кислот. Наибольшее их содержание определено в МГДГ, чуть меньше - в ДГДГ. Из двух Аб кислот только у-линоленовая кислота присутствовала в свободной форме. В фосфолипидах, обогащенных ненасыщенными ацилами 18:3 ш3 и 18:2 шб, отсутствовали Аб-полиеновые кислоты.
Таблица 2. Состав жирных кислот липидов листьев Cortusa turkestanica, %
Кислота Нейральные липиды Полярные липиды
ТАГ СЭ СЖК МГДГ ДГДГ ФЛ
12:0 0,8 0,6 0,5 - - Следы
13:0 0,5 0,1 - - - -
14:0 3,3 4,8 1,2 - - 0,9
изо-15:0 0,2 - - - - -
антеизо-15:0 1,1 0,5 - - - -
15:0 1,2 0,6 - - - -
16:0 20,9 34,2 13,2 10,2 18,0 29,3
16:1 2,9 1,1 - - - 0,5
антеизо-17:0 1,2 1,7 - - - -
17:0 0,7 0,5 - - - -
18:0 7,8 12,7 1,9 0,7 1,3 7,1
18:1 ю9 12,9 6,2 Следы Следы 0,3 4,8
18:2 ю6 21,1 27,2 10,5 5,3 16,5 19,3
18:3 ю3 17,4 9,8 70,9 74,5 55,7 38,1
18:3 ю6 (у-линоленовая) 1,2 - 1,7 2,4 2,0 -
18:4 юЗ (стеаридоновая) 2,1 - - 6,9 6,2 -
20:0 1,1 4,0 - - - -
У ^насыщенных 41,5 55,7 16,9 10,9 19,3 40,3
у ^ненасыщенных 58,5 44,3 83,1 89,1 80,7 59,7
^полиеновых ш3 и шб 20,7 9,8 72,6 83,8 63,9 38,1
При изучении липидов семян C. turkestanica [10] мы находили 18:3 юб и 18:4 ю3 кислоты в ТАГ (8,8 и 0,7% от суммы кислот соответственно) и полярных липидах (2,0 и 0,3% соответственно), но они не обнаруживались во фракции СЖК семян. Сравнивая профиль жирных кислот липидов листьев и семян исследованного нами вида, можем заключить, что стеаридоновая кислота в основном накапливается в галакто-липидах листьев, в то время как у-линоленовая кислота обнаруживается в большем количестве в ТАГ семян. Подобно галактолипидам, в составе кислот ТАГ листьев превалирует содержание 18:4 ю3 кислоты над 18:3 юб, а в ТАГ семян уровень 18:3 юб кислоты значительно выше. Эти результаты подтверждают мнение, изложенное в работе [7], что 18:4 ю3 и 18:3 юб кислоты синтезируются в листьях и семенах соответственно из 18:3 ю3 и 18:2 юб кислот под действием фермента Аб-десатуразы.
Из литературных данных известно [б—10], что в вегетативных и генеративных органах растений рода Primula содержание 18:4 ю3 кислоты в большинство случаях превышает уровень 18:3 юб кислоты. Отмечено [5], что наличие 18:3 юб кислоты (3-4% от суммы общих жирных кислот) в сочетании со значительным количеством 18:4 ю3 (11-14%) кислоты в семенных липидах является таксономическим признаком для идентификации растений рода Primula.
Как и в нашем случае, в липидах листьев близкого вида C. Cortusoides, относящегося к секции Cortusoides [7], превалирует доля стеаридоновой кислоты (18,8%) над у-линоленовой (4,0%), а в семенах, наоборот, больше содержание у-линоленовой кислоты (1б,б%), чем стеаридоновой (4,5%). Изученный нами вид отличается от данного вида лишь тем, что в липидах листьев и семян значительно ниже содержание обеих Аб-ненасыщенных кислот. Таким образом, на основании вышеуказанного можем заключить, что запасные и фо-тосинтетические ткани C. turkestanica проявляют избирательную способность к накоплению Аб 18:3 и 18:4 кислот в нейтральных и полярных глицеролипидах. Следует отметить, что в качестве хемотаксономического признака данного вида растений, содержащих Аб 18:3 и 18:4 кислоты, более достоверно было бы использование одновременно составов кислот галактолипидов листьев и ТАГ семян.
Заключение
Впервые изучены липиды листьев Cortusa turkestanica A. Lozinsk. из семейства Primulaceae, установлен состав кислот основных компонентов ацилсодержащих липидов и свободных жирных кислот. Среди ацильных фрагментов МГДГ, ДГДГ и ТАГ, обогащенных ненасыщенными кислотами (89,1, 80,7 и 58,5% ГХ, соответственно) с помощью ГХ/МС, идентифицированы редко встречающиеся в высших растениях полине-насыщенные 18:4 ю3 (стеаридоновая, б,9, б,2 и 2,1) и 18:3 юб (у-линоленовая, 2,4, 2,0 и 1,2) кислоты. у-линоленовая кислота обнаружена в свободной форме в количестве 1,7%. Результаты показали, что в качестве хемотаксономического маркера для идентификации изученного вида и систематики растений, содержащих Аб 18:3 и 18:4 кислоты, более достоверно использовать состав кислот галактолипидов листьев и ТАГ семян.
Список литературы
1. Флора Узбекистана. Ташкент, 19б1. Т. 5, C. 31.
2. Флора СССР, М.; Л., 1952. Т. 18. С. 107.
3. Алимбаева П.К., Мухамедзяев М.М. К характеристике сапониноносных растений сем. Primulaceae, произра-стающихв Киргизии// Растительные ресурсы, 19б9, Т. 5, вып. 3. С. 380-385.
4. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения и их химический состав, использование: Сем. Paeoniaceae-Thymelaeaceae. Л., 198б. Т. 2. 33б с.
5. Bruneton J. Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal plants. New York, Paris, 1995. 915 p.
6. Aitzetmüller K., Werner G. Stearidonic acid (18:4 ю3) in Primula florindae // Phytochemistry. 1991. V. 30, N12. Pp. 4011-4013
7. Sayanova O, Napier J.A., Shewry P.R. Ae-Unbaturated fatty acids in species and tissues of the Primulaceae // Phytochemistry. 1999. V. 52, N3. Pp. 419-422
8. Tsydendambaev V.D., Christie W.W., Brechany E.Y., Vereshchagin A.G. Identification of unusual fatty acids of four alpine plant species from the Pamirs // Phytochemistry. 2004. V. б5, N19. Pp. 2б95-2703
9. Косенкова Ю.С., Половинка М.П., Комарова Н.И., Корчагина Д.В., Морозов С.В., Вялков А.И., Курочкина Н.Ю., Черемушкина В.А., Салахутдинов Н.Ф. Жирнокислотный состав и вторичные метаболиты малополярных экстрактов надземной части Primula macrocalyx // Химия природных соединений. 2008. №5. C. 457-4б0.
10. Асилбекова Д.Т., Нуриддинов Х.Р., Нигматуллаев А.М, Абдуллаев Н.Д., Глушенкова А.И.
Полиненасыщенные жирные кислоты масла семян Cortusa turkestanica // Химия природных соединений. 2010. №2. С. 151-153.
11. Кейтс М. Техникалипидологии. М., 1975 [Kates M. Techniqies of lipidology. Isolation, analysis and identification of lipids. Amsterdam, London, New York, 1972].
Поступило в редакцию 14 октября 2010 г.
