CC BY
62
УДК 547.915:665.33
С. Г. Юнусова (к.х.н., с.н.с. )1, М. С. Юнусов (акад. РАН, д.х.н., зав. лаб.)1, О. Н. Денисенко (д.х.н., проф., зав. каф.) 2, Е. В. Чернова (асп.) 2, В. Ф. Миронов(чл.-корр. РАН, д.х.н., зав. лаб.) 3, С. Г. Минзанова (к.х.н., с.н.с.) 3,
Л. М. Абрамова (д. биол. н., зав. лаб.) 4
Липиды семян Oenothera L. с различных мест произрастания.
Сообщение II
1 Институт органической химии Уфимского научного центра РАН, лаборатория биоорганической химии 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71, тел. (347) 235-58-39, е-таil: [email protected] 2Пятигорская государственная фармацевтическая академия 357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11, тел. (8793) 2-65-74, e-mail: [email protected] 3Институт органической и физической химии им. А. Е. Арбузова Казанского научного центра РАН г. Казань, ул. им. акад. Арбузова, 8, тел. (8432) 75-22-53, e-mail: [email protected] 4Ботанический сад - Институт Уфимского научного центра РАН 450080, г. Уфа, ул. Полярная, 8, тел. (347) 252-60-33, 228-13-55, e-mail: [email protected]
S. G. Yunusova1, M. S. Yunusov1, O. N. Denisenko 2, E. V. Chernova 2, V. F. Mironov 3, S. G. Minzanova 3, L. M. Abramova 4
Lipids of seeds Oenothera L. from various places of growth.
The report II
1 Institute of Organic Chemistry of Ufa Scientific Centre of Russian Academy of Sciences 71, Oktyabrya Pr, Ufa, 450054, Russia; ph. (347) 235-58-39, e-mail: [email protected]
2Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy 11, Kalinina Pr., 357532, Pyatigorsk, Russia; Ph.: (8793) 26574; e-mail: [email protected] 3 Institute of Organic and Physical Chemistry named A. E. Arbuzov of Kazan Scientific Centre of the RAS 8, Akademika Arbuzova Str., Kazan, Russia; Ph.: (8432) 752253; e-mail: [email protected] 4Botanical Garden-Institute of Ufa Scientific Centre of the RAS 8, Polarnaya Str., 450080, Ufa, Russia; Ph.: (347) 2526033, 2281355; e-mail: [email protected]
Проведен экспресс-анализ 6 образцов семян 4-х видов Oenothera (сем. Onagraceae) с различных мест произрастания.— Oen. biennis, Oen. lamarckiana, Oe.n..speciosa Oen. rubiginosa. Подробно изучен состав нейтральных и полярных липидов — глико-, фосфолипидов семян Oenothera biennis (Краснодарский край). Установлено, что наибольшее количество у-линоле-новой кислоты концентрируется в триацилгли-церидах. С помощью метода хромато-масс-спектрометрии определен состав липофильных компонентов. Основным компонентом был ¡3-си-тостерин. Методом панкреатического гидролиза установлен состав триацилглицеридов Oenothera biennis (Краснодарский край). Показано, что sn-2-положение в молекулах триацилглицеридов занято преимущественно ненасыщенными жирными кислотами. Рассчитан позиционно-видовой и позиционно-типовой составы триацилглицеридов.
Ключевые слова: жирные кислоты; у-линоле-новая кислоталипиды; Oenothera biennis.
Дата поступления 10.03.09
The express analysis of 6 samples of seeds of 4 kinds Oenothera (sem. Onagraceae) from various places of growth: Oen. biennis, Oen. lamarckiana, Oen. Speciosa, Oen. rubiginosa. The structure of neutral and polar gliko- and phospholipids seeds Oenothera biennis (Krasnodar Territory) is in detail investigated. It is established, that the greatest quantity of ?-linoleic acid concentrates in triacylglycerols. By means of a chromato-mass spectrometry method the structure of lipofeelic components is certain. The basic component is ?-sitosterol. By method of pancreatic hydrolysis the structure of triacylglycerols Oenothera biennis (Krasnodar Territory) is established. It is shown, that sn-2-position in triacylglycerol molecules is occupied by mainly nonsaturated fat acids. It is calculated positionally-specific and positionally-typical structures of triacylglycerols.
Key words: fat acids; y-linolenic acid; lipids; Oenothera biennis.
Ранее мы сообщали о липидном составе и содержании у-линоленовой кислоты (18:3, Д6,9,12; ю-6) (ГЛК) в семенах вечерней прима-розы (Oenothera biennis L.сем. Onagraceae), выращенной на территории Российской Федерации в республике Татарстан Семена этого растения являются важным источником масла, которое широко используется на Западе в качестве биологически активной добавки при заболеваниях сердца и сосудов, так как проявляет выраженное антисклеротическое и кардиоза-щитное действие 2. Основным поставщиком семян являются Америка и Канада.
В продолжение этой работы по поиску доступных источников масла, пригодных по всем параметрам для промышленного производства, мы определили некоторые показатели семян, масел и состав жирных кислот разных видов энотеры с различных мест произрастания. Объектом исследования служили семена растения Oenothera, произрастающего: в Краснодарском крае Oen. biennis; г. Уфе -Оеп.. biennis; Пятигорском ботаническом саду — Оеп.. speciosa и Оеп. lamarkiana; ст. Таш-булатово, Абзелиловском районе РБ — Оеп. rubiginosa и оз. Яктыкуль, Абзелиловском районе РБ — Оеп. rubiginosa..
Стандартными методиками во всех образцах определили масличность, влажность, кислотное число. Показатели были в следующих пределах: масличность — 21.9—25.4 %; влажность — 6.5—7.5 %; кислотное число 0.4—1.8
мг/КОН. Согласно этим данным семена всех изученных видов энотеры можно отнести к среднемасличным с низким показателем КЧ и влажностью.
Состав жирных кислот изученных образцов семян представлен в табл. 1. Как видно, наиболее разнообразными по составу жирных кислот являются Оеп. speciosa и Оеп. lamarckiana, в них идентифицировано 13 и 14 кислот соответственно. Основными кислотами (> 1%) для всех изученных нами сейчас и ранее 1 видов энотеры с разных мест произрастания являются пять - 16:0, 18:0, 18:1, 18:2 и у-18:3 (табл. 1). Среди ненасыщенных кислот изученных видов растений лидирующей является линолевая (18:2). Олеиновая (18:1) кислота больше содержится в видах biennis (Уфа
и Краснодарский край) и ее количество, как
1 3
показывают наши и литературные данные ,
может меняться в пределах от 5 (территория г. Казани) до 26% (Ташкентский ботанический сад) 3 в зависимости от условий и места произрастания. Наибольшими по содержанию ГЛК (табл. 1) являются образцы Oenothera biennis (г.Уфа, Краснодарский край), Оеп. lamarckiana и Оеп.rubiginosa (г. Пятигорск и Абзелиловс-кий район РБ). Поскольку вид Oen. biennis из Краснодарского края достаточно широко распространен в этом регионе и хорошо поддается интродукции, более подробно липидный состав был изучен на нем и на двух видах энотеры из Пятигорского ботанического сада -
Таблица 1
Состав жирных кислот нейтральных липидов семян энотеры с различных мест произрастания, (%)
Oenothera Oenothera Oenothera Oenothera Oenothera
Oenothera biennis speciosa lamarckiana rubiginosa rubiginosa
Кислоты biennis (Красно- (Пятигорский (Пятигорский (ст. Ташбулато- (оз. Яктыкуль,
(г. Уфа) дарский ботанический ботанический во, Абзелилов- Абзелиловский
край) сад) сад) ский район РБ) район РБ)
12:0 0.1 0.1 - 0.1 0.9 3.9
14:0 0.1 Сл. 0.1 0.1 0.2 1.6
15:0 - - 0.1 - 0.5 Сл.
16:0 6.4 7.5 9.3 6.9 6.4 7.6
16:1 - Сл. 0.1 0.2 - -
17:0 - - 0.1 - 0.3 -
18:0 1.8 1.7 2.4 1.6 1.9 Сл.
18:1(®-9) 14.1 14.7 5.9 8.9 7.6 11.5
18:1(®-7) 0.5 0.7 0.6 0.6 0.6 0.4
18:2 69.8 67.4 76.4 70.7 72.2 68.0
>-18:3 7.2 7.8 4.1 10.0 9.4 7.0
а-18:3 - - 0.3 0.3 - -
20:0 - Сл. 0.1 0.1 - -
20:1 - 0.1 0.3 - -
22:0 - - - 0.1 - -
22:1 - - 0.5 0.1 - -
^Нас. 8.4 9.4 12.0 8.9 10.2 13.1
^Ненас. 91.6 90.6 88.0 91.1 89.8 86.9
speciosa и lamarckiana. Виды — Оеп. biennis и rubiginosa не являются характерными для территории РБ, первый интродуцирован, а второй считается заносным видом.
Нейтральные липиды извлекали гексаном и, учитывая полученные ранее результаты для разделения по классам воспользовались препаративной ТСХ на силикагеле, что дало возможность ограничить длительный контакт липидов с силикагелем. Идентификацию липи-дов проводили, как описано .
Как видно из табл. 2, состав нейтральных липидов (НЛ) изученных видов энотеры практически не различался ни по набору отдельных классов, ни по их содержанию; идентифицировано 7 классов соединений. Окисленные липиды, о выделении которых из Оеп. biennis сообщалось ранее 3, в исследуемых образцах не обнаружили.
Из НЛ Оеп. biennis выделяли неомыляе-мые компоненты, используя колоночную хроматографию (КХ) и препаративную тонкослойную хроматографию (ПТСХ) на силикаге-ле, и разделяли их на составляющие. В результате получили три фракции, две из которых относились к тритерпеновым соединениям и одна к токоферолам. Состав фракций, относящихся к тритерпеновым соединениям, идентифицировали с помощью хромато-масс-спектро-метриии. Подробным анализом токоферолов не занимались. Во фракции тритерпеновых соединений идентифицировали стерины: в-сито-,
кампе- и стигмастерин; тритер-пеновые спирты: лупеол, циклоартенол и 24-метиленцикло-артенол. Основным компонентом был ß-ситос-терол. В НЛ speciosa и lamarckiana ß-ситосте-рол был также основным компонентом тритер-пеновых соединений.
Таблица 2 Состав нейтральных липидов семян Oen. biennic (Краснодарский край ) (I), Oen. speciosa (II) и Oen. lamarkiana (III) (Пятигорский ботанический сад)
Классы липидов Содержание, %
I II III
Нейтральные липиды
1. Сложные эфиры тритерпе- 4.3 3.2 2.8
новых соединений (СЭТС)
2. Триацилглицериды (ТАГ) 90. 90. 92.
3. Свободные жирные кислоты 9 8 4
(СЖК) 0.9 1.7 2.2
4. Токоферолы + + +
5. Диацилглицериды (ДАГ) 1.8 1.4 0.7
6. Тритерпеновые соединения 1.0 2.2 1.3
7. Моноацилглицериды (МАГ) 1.1 0.7 0.6
Состав полярных липидов (ПЛ) — фосфо-(ФЛ) и гликолипидов (ГЛ) был изучен только для. Оеп. biennis. Полярные липиды выделяли классическим методом 4 с последующей многократной очисткой, содержание их было: 5.5 • 10-2 и 1.5 • 10-2 % для ГЛ и ФЛ соответственно. В ГЛ идентифицировали моногалакто-зилдиацилглицериды, основными компонентами ФЛ были: фосфатидилхолины (ФХ), фосфати-
Таблица 3
Состав жирных кислот ацилсодержащих классов липидов семян Oen. biennis (Краснодарский край ) (I), Oen. speciosa (II) и Oen. lamacrkiana (III) (Пятигорский ботанический сад) (ГЖХ, %)
Кислоты СЭТТС ТАГ* ДАГ МАГ ФЛ** ГЛ**
I II III I II III I II III I II III I I
12:0 - - - Сл. - - 0.9 - - 1.1 - - 7.6 3.4
14:0 8.5 Сл. 4.5 Сл. 3.2 1.1 2.5 6.1 2.4 5.6 13.9 4.9 1.3 3.0
15:0 - - 2.7 - - 0.9 0.7 - 1.5 - - - - -
16:0 28.5 22.7 8.7 8.2 10.2 5.9 17.8 15.6 9.3 14.2 36.2 11.6 16.7 20.1
16:1 - - - - Сл. Сл. - - - 6.5 - - - -
17:0 6.8 1.9 - - - - - 0.8 0.7 3.3 1.4 2.4 -
18:0 2.3 1.6 1.0 1.7 2.4 1.2 6.9 2.5 1.2 5.0 2.6 1.4 4.7 6.8
18:1(9) 9.8 2.8 6.3 16.1 5.1 7.3 23.0 3.9 7.8 17.9 3.6 7.1 13.0 39.8
18:1(7) 0.5 0.7 0.6 0.5 0.5 0.7 1.0 0.3 0.6 0.7 0.2 0.4 0.2 0.1
18:2 40.5 70.3 68.9 66.1 73.9 72.0 43.1 69.0 70.2 44.5 37.9 65.5 47.2 24.6
^18:3 3.1 Сл. 7.3 7.4 4.3 10.3 4.1 1.8 6.3 4.4 2.3 7.7 3.8 -
20:0 - - - Сл. 0.1 Сл. - Сл. Сл. 0.1 - - 1.6 -
20:1 - - - Сл. - 0.1 - - - - - - -
^Нас. 46.1 26.2 16.9 9.9 15.9 9.1 28.8 25.0 15.1 26.0 56.0 19.3 35.8 35.5
^Ненас. 53.9 73.8 83.1 90.1 84.1 90.9 71.2 75.0 84.9 74.0 44.0 80.7 64.2 64.5
*В ТАГ присутствовали кислоты : в II — 22:1 — 0.3 %; сл. — а-18:3; в III — сл.:-а-18:3 и 22:0; 22:1—0.5%. ** В ФЛ и ГЛ — присутствовала кислота 21:0 — 1.5 и 2.2 % соответственно.
дилэтаноламины (ФЭ) и фосфатидилинозитолы (ФИ). Данные по количеству и составу ФЛ согласуются с имеющимися в литературе 5 6. Сведения о составе ГЛ в литературе отсутствуют.
Для определения преимущественной дислокации ГЛК в ацилсодержащих классах НЛ и ПЛ, устанавливали в них состав жирных кислот, используя метод ГЖХ анализа. (табл. 3). Содержание ГЛК кислоты (табл. 3) варьирует от 1.8% (в ДАГ) до 10.3% (в ТАГ). Наибольшее количество ГЛК концентрируется в ТАГ, насыщенные жирные кислоты в заметных количествах присутствуют в СЭТС, ДАГ, МАГ, что согласуется с литературными данными.
Было показано, что содержание ГЛК в масле зависит от многих факторов внешней среды, из которых одним из важнейших является температура 7. В литературе нет единого мнения по динамике изменения ГЛК в процессе созревания семян 8' 9. а-Линоленовая кислота (18:3, Д,9,12,15; ю-3; АЛК) накапливается, главным образом, в ФЛ и ГЛ, а ГЛК — в ТАГ. Листья Oenothera содержат только АЛК 10.
Как показали наши исследования, в изученных образцах семян (табл. 1) АЛК в незначительных количествах присутствовала только в Oenothera speciosa и. lamarckiana. В ФЛ и ГЛ мы ее не обнаружили, как и ГЛК в ГЛ.
Свойства жиров и возможность их использования для пищевых и технических целей в значительной мере определяются их гли-церидным составом. Основным компонентом всех масел являются триглицериды. Масла представляют собой сложную смесь разных по составу триглицеридов. Типы и виды триглице-ридов зависят от набора жирных кислот, которые входят в их состав. Чем больше набор, тем разнообразнее виды триглицеридов. Позицион-но-видовой (табл. 4) и типовой составы ТАГ Oenothera biennic (Краснодарский край) устанавливали методом панкреатического гидролиза, который дает информацию о том, какие жирные кислоты преимущественно этерифи-цируют 2-е положение в молекулах ТАГ.
По данным ГЖХ анализа составы исходных ТАГ и 2-МАГ, полученных в результате гидролиза были (моль,%) ТАГ: 16:0 - 8.9; 18:0 -1.7; 18:1 - 16.3; 18.2 - 65.7; у-18:3 - 7.4; 2-МАГ: 16:0 - 4.4; 18:0 - 1.3; 18:1 - 20.4; 18:2 — 66.2; у-18:3 - 7.7. Всего видов ТАГ было 38, из них в табл. 4 приведены 17, содержание которых превысило 1%. Типовой состав ТАГ представлен шестью типами (%): UUU - 71.8; SUU+UUS - 21.4; SUS - 1.4; USU - 4.3; USS+ SSU - 1; SSS - 0.1 (U - ненасыщенные жирные
кислоты; S — насыщенные), из которых почти 95% — это типы с ненасыщенной кислотой во 2-м положении. Фактор селективности этого положения для: 18:1 (0), 18:2 (Л), у-18:3 (Ле) и 16:0+18:0 (П) жирных кислот был соответственно — 1.3; 1.0; 1.0; 0.5. т.е. кислоты, которые преимущественно этерифицируют 2-е положение согласно фактору селективности располагаются в ряд О>Л=Ле>П.
Таблица 4 Позиционно-видовой состав триацилглицеридов семян Оеп. Ь1епп1о (Краснодарский край) с содержанием видов > 1%
Виды ТАГ Содержание, моль %
18:2-П*-18:2 2.4
18:2-18:1-18:2 8.7
П-1 3:1-18:2 + 18:2-18:1-П 3.4
18 3:1-1 3:1-18:2 + 18:2-18:1-18:1 3.8
18:2-18:1-18:3 + 18:3-18:1-18:2 2.0
П-18:2-П 1.2
18:1-П-18:1 1.4
18:2-18:2-18:2 28.5
18:2-18:3-18:2 3.3
П-1 8:2-18:1 + 18:1-18:2-П 2.4
П-1 8:2-18:2 + 18:2-18:2-П 11,4
П-1 8:2-18:3 + 18:3-18:2-П 1,2
18 3:1-1 8:2-18:2 + 18:2-18:2-18:1 12,4
18 3:1-1 8:2-18:3 + 18:3-18:2-18:1 1,4
18 3:3-1 8:2-18:2 + 18:2-18:2-18:3 6.4
П-1 8:3-18:2 + 18:2-18:3-П 1.4
18 3:1-1 8:3-18:2 + 18:2-18:3-18:1 1.4
Остальные - 21 вид 7.3
П* - сумма 16:0 + 18:0
Мы не проводили стереспецифический анализ ТАГ энотеры, результаты которого дают исчерпывающую информацию о распределении жирных кислот по трем положениям в молекуле. Однако в литературе такие данные имеются. Авторы работы 11 показали, что в ТАГ из Oenothera biennis , как и во многих растительных маслах sn-2 положение преимущественно занято ненасыщенными жирными кислотами, в sn-1 - предпочтительно находятся насыщенные — 16:0 и 18:0, ГЛК примерно в равных количествах распределяется в положениях sn-2 и sn-3.
Таким образом, согласно полученным данным по триглицеридному и липидному составам семена Oenothera biennis, произрастающие на территории Краснодарского края, близки к выращиваемым на территории США и Канады и масло данного вида растения, произрастающего на территории РФ, может быть использовано для получения фармпродукции.
Экспериментальная часть
Масс-спектры получены на спектрометре МХ-1320; хромато-масс-спектры - с использованием системы хроматограф-масс-спектрометр — ЭВМ: хроматограф НР 5890 с масс-се-лективным детектором НР 5972А. Условия анализа: капиллярная кварцевая колонка Ultra-250 мх0.2 мм, привитая фаза 5% PhMeSiO2, начальная температура 30оС, скорость подъема 10о/мин, конечная 300оС, расход газа-носителя N2 1 мл/мин, температура испарителя 305оС. Сканирование спектров со скоростью 1 спектр/с, диапазон сканирования 39—500 а.е.м., компьютерная обработка данных — ChemStation НРMS, интерпретация масс-спектров при помощи библиотечных данных, на основе спектро-структурных корреляций, а также на основании закономерностей и особенностей фрагментации тритерпеновых соединений.
ГЖХ-анализ метиловых эфиров жирных кислот проводили на хроматографе «GC-2014» (Shimadzu), капиллярная колонка «Omegawax 250» длиной в 30.0 м, диаметром в 0.25 мм, сорбент — полиэтиленгликоль, Т колонки — 205 оС, Т испарителя — 250 оС, Т детектора — 260 оС, газ-носитель Не, скорость подачи газа — 30мл/мин.
Выделение, разделение и идентификацию липидов проводили также, как описано 1; панкреатический гидролиз триацилглицеридов
12
осуществляли как описано 12, липазой из поджелудочной железы свиньи фирмы «Sigma».
Литература
1. Юнусова С. Г., Юнусов М. С., Каримова А. Р., Миронов В. Ф., Минзанова С. Г., Коновалов А. И., Ефремов Ю. Я., Денисенко О. Н., Чернова Е. В. // Химия природ. соедин.— 2007. —№ 5.— С. 430.
2. D. F. Horrobin, Prog. Lipid Res.— 1992.- V.31.— № 2.— P. 163.
3. Ульченко Н. Т., Глушенкова А. И. // Химия природ. соедин.— 1999.—№ 3.— С. 317.
4. Bligh E. G., Dyer W. J. // Can. J. Biochim. Physiol.— 1959.— V.37.— P. 911.
5. Lotti. G. and Quartacci. M.F. // Agrochemicf.— 1990.— V.34.— P. 243.
6. Christi. W.W. // Industrial Crops and Products.— 1999.— V. 10.- № 2.— P.73.
7. Syokuy N., Fujimoto J., Hori I., Ohashi H. // Shoyakugaku Zasshi.— 1976.— V. 30.— P.101.
8. Peiretti P. G., Palmegiano G. B., Masoero G. // Animal Feed Science and Technology.— 2004.— V.116.— N 3.— P. 293.
9. Mukherjee K. D., Kiewitt I. J. // Agric Food Chem.— 1987.— V.35.— P. 1009.
10. Stymne S., Stobart S. K. // J. Biochem.— 1986.— V. 240.— P. 385; Griffiths G, Stobart S. K. // J. Biochem.— 1988.— V. 252.— P. 641.
11. Lawson L. D., Hughes B. H. // Lipids.— 1988.— V. 23.— N 4.— P. 313.
12. Litchfild C., Analysis of Triglycerides.— New York, London: Acad. Press., 1972.— 173p.
Работа выполнена при финансовом содействии программы Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ (НШ-1725.2008.3) и гранта РФФИ 08-03-90265 -Узб.
