CC BY
45
С. С. Ляшенко (асп.)1, С. Г. Юнусова (к.х.н., с.н.с.)2, М. С. Юнусов (д.х.н., зав.лаб.)2, Е. Г. Галкин (д.х.н., с.н.с.)3, О. Н. Денисенко (д.х.н., проф., заф.каф.)1
Липиды семян Borago officinalis L. (сем. Boraginaceae)
Пятигорская государственная фармацевтическая академия,
1 кафедра фармации
357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11; тел. (8793) 26574. e-mail: [email protected] Институт органической химии Уфимского научного центра РАН,
2лаборатория биоорганической химии,
3лаборатория физико-химических методов анализа 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71; факс (347) 2356066, е-та11: [email protected]
S. S. Lyashenko, S. G. Yunusova, M. S. Yunusov, E. G. Galkin, O. N. Denisenko
Lipids of seeds Borago officinalis L. (fam. Boraginaceae)
Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy II, Kalinin Pr, 357532, Pyatigorsk, Russia; ph. (8793) 26574, e-mail: [email protected] Institute of Organic Chemistry of Ufa Scientific Center of Russian Academy of Science 7I, October Pr, 450054, Ufa, Russia; ph. (347) 2356066, e-mail: [email protected]
Изучен состав липидов семян Borago officinalis Геем. Boraginaceae), интродуцированных в ботаническом саду Пятигорской государственной фармацевтической академии. Определено содержание нейтральных липидов (НЛ) и гамма-линоленовой кислоты (ГЛК) в них, при использовании различных растворителей и методов извлечения масла. Определено количество полярных (ПЛ): глико- и фосфолипидов, идентифицированы состав НЛ и ПЛ, установлено, что наибольшее количество ГЛК (18%) дислоцируется в триацилглицеридах. В шроте, оставшемся после удаления липидов, обнаружены алкалоиды в количестве 0.26% от веса шрота, что составило 0.15% от веса семян. Установлен состав неомыляемых липорастворимых компонентов.
Ключевые слова: Borago officinalis; гамма-линоленовая кислота; липиды.
Borago officinalis ( сем. Boraginaceae) -бурачник лекарственный (огуречная трава) — является одним из богатейших источников гамма-линоленовой кислоты (ГЛК), относящейся к эссенциальным и являющейся первым промежуточным продуктом при метаболизме линолевой кислоты в арахидоновую в организме человека, ее содержание в этом масле достигает 25% 1. Масло из семян этого растения нашло широкое применение в медицине, косметологии. В шроте, оставшемся после удаления масла, присутствуют фенольные соединения 2, которые обладают ярко выраженными
Дата поступления 9.06.10
The lipid composition of Borago officinalis (fam. Boraginaceae) seeds introduced in the Botanical garden of Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy was studied. The content of the neutral lipids (NL) and y-linolenic acid (GLA) was determined with application to the different solvents and the oil extraction methods. Amount of the polar (PL): glycol (GL) and phospholipids (PL) was determined. The NL and PL composition was identified. It was established, the greatest amount (GLA) (18%) is in the triacylglycerols. The alkaloids (0.26% from the rest weight) was found in the rest after removal of lipids. The composition of the unsaponifiable components was established.
Key words: Borago officinalis; y-linolenic acid; lipids.
антиоксидантными свойствами. Родиной бу-рачника лекарственного является Африканское побережье Средиземного моря и малая Азия. В диком виде он произрастает также в Европе и Северной Америке. Культивируется в странах Западной Европы, Азии, Северной Америки. Сырье, необходимое для получения масла и фармацевтической продукции, в Россию импортируется из-за границы, практически вся фармацевтическая продукция, присутствующая на рынках России, импортного производства. В промышленных масштабах культурной интродукцией бораго не занимаются (хотя в диком виде эти растения достаточно широко
распространены на территории России) и масла в больших объемах не производятся. Небольшие фирмы, которые работают на импортном сырье (семена), производят масло холодным отжимом и реализуют небольшими партиями.
Сведения о липидном составе семян Borago officinalis., произрастающего на территории России, в литературе отсутствуют.
Целью данной работы явилось изучение липидного состава семян Borago officinalis L., интродуцированного в условиях Ставропольского края. Для интродукции использовались семена из доступных коммерческих источников, импортируемые на территорию РФ. Интродукцию проводили на опытных делянках в ботаническом саду Пятигорской государственной фармацевтической академии, поскольку, как показали предварительные опыты, климатические условия данного региона РФ являются наиболее благоприятными для этих целей3. Изучали нейтральные (НЛ), полярные (ПЛ): глико- (ГЛ) и фосфо- (ФЛ) липиды двух образцов семян: I-коммерчески доступные и II-интродуцированные. Коммерческие семена были использованы для сравнения.
По основным показателям (табл.1) семян и масел образцы мало отличались друг от друга и были окрашены в зеленый цвет, что говорило о наличии пигментов — хлорофиллов. Наличие такой окраски не характерно для генеративных органов растений. Для того чтобы определить, что является ответственным за эту окраску, в обоих образцах с помощью жидкого азота отделяли кожуру от ядра семян, образцы измельчали и экстрагировали гексаном. Масло из ядра было окрашено в желтый, а из кожуры — в зеленый цвет. В УФ-спектре этого образца присутствовали полосы поглощения в видимой части спектра при 440, 644, 664 нм, характерные для хлорофиллов и каротиноидов. Наличие пигментов подтвердили тонкослойно-хроматографическим анализом (ТСХ) (система растворителей 1). Таким образом, за зеленую окраску масла ответственны пигменты, нахо-
дящиеся в кожуре. Количественное определение пигментов в масле, выделенном из семян гексаном показало, что в образцах I и II содержится: хлорофиллов 8.8 и 5.9 мг% а каротиноидов — 7.7 и 9.3 мг% соответственно.
Для получения масла из семян использовали различные способы и растворители, которые чаще всего применяются в промышленности (табл. 2). Для всех полученных образцов масел определяли выход липидов и состав жирных кислот (ЖК). Наибольший выход липидов был при экстракции в аппарате Со-кслета. Поскольку состав ЖК масел образцов I и II, полученных стандартной экстракцией в аппарате Сокслета и настаиванием, практически не отличался (табл. 2), в дальнейшем этот показатель определяли только для интродуцированного (II) образца. Содержание гамма-ли-ноленовой кислоты (ГЛК) в обоих образцах было практически одинаково (18.7 и 18.6%). Как видно из табл.2, состав ЖК масел, выделенных гексаном различными способами, практически не различался; в масле же, полученном холодным отжимом, количество ненасыщенных жирных кислот было выше, чем в предыдущих образцах, в том числе и ГЛК. При экстракции масла хлористым метиленом количество насыщенных жирных кислот в нем было наивысшим за счет присутствия гептаде-кановой кислоты (17:0, 6%) и наименьшего содержания ГЛК.
Используя препаративную тонокослой-ную хроматографию (ПТСХ) в системах растворителей 2-4, масла, полученные из обоих образцов, разделили на составляющие классы соединений (табл.3): в НЛ идентифицировали 7 классов липидов. По составу и содержанию отдельных классов образцы НЛ были близки. В НЛ исследуемых нами образцов, по сравнению с литературными данными, повышено содержание эфиров тритерпеновых спиртов и продуктов метаболизма триацилглицеридов (ТАГ) (свободные жирные кислоты (СЖК), диацилглицериды (ДАГ), моноацилглицериды
Таблица 1
Некоторые показатели семян и масел из коммерчески доступных (I) и интродуцированных (II) образцов Borago officinalis (сем. Boraginaceae)
Образцы Влажность, % Маслич-ность,%, на абс.сух.в-во Кислотное число, мг/КОН Плотность, г/см3 Показатель преломления при 20 оС
I 7.9 36.5 0.7 0.9073-0.9186 1.473-1.479
II 8.0 39.1 4.5 0.9050-0.9089 1.470-1.476
Таблица 2
Состав жирных кислот масел из коммерчески доступных (I) и интродуцированных (Н)семян Borago officinalis (сем. Вогадіпасєае), выделенных разными способами
Кислоты Сокслет (экстракция гексаном)** Настаивание, (экстракция гексаном) (35.6 и 36%)* Настаивание, (экстракция хлористым метиленом)* (34.2%) Холодный отжим (34.3%)*
(I) (II) (I) (И) (II)*** (II)
12:0 0.2 - - - - 0.5
16:0 10.9 10.5 11.1 10.7 10.2 10.0
16:1 - 0.5 - 0.4 - —
18:0 5.3 5.4 5.3 5.5 4.2 3.2
18:1 19.9 20.1 20.6 20.5 22.9 20.0
18 2 37.7 36.9 37.0 36.6 36.6 39.1
у-18:3 18.7 18.6 17.7 18.1 16.1 19.8
а-18:3 0.3 0.2 0.1 0.2 -
18:4 0.4 0.7 1.3 0.6 — 0.9
19:1 - 0.3 0.2 0.3 - 0.3
20:0 3.9 4.1 4.0 4.2 4.0 3.9
20:1 0.3 0.1 0.2 0.1 - —
22:0 Сл. 0.2 0.2 0.2 - -
22:1 2.4 2.4 2.3 2.6 - 2.3
Насыщ.кислот 20.3 20.2 20.6 20.6 24.4 17.6
£ Ненасыщ. кислот 79.7 79.8 78.5 79.4 75.6 82.4
* — в скобках указан выход липидов; ** — выход липидов дан в табл. 1 (см.масличность); ЖК присутствует 6% 17:0 кислоты.
— в составе
(МАГ))4. Скорее всего, это связано с различием климатических и почвенных условий произрастающих растений.
Из шрота, оставшегося после отделения НЛ, смесью хлороформ-метанол выделяли глико- (ГЛ) и фосфолипиды (ФЛ). Для получения гомогенных фракций ФЛ и ГЛ использовали многократно ПТСХ. Содержание ПЛ наших образцов (табл.З) было значительно ниже указанного в литературе 4. Гликолипидов в образце I содержалось в 2 раза больше, в то время как количество фосфолипидов образцов практически не отличалось (табл. 3).
Идентификацию ГЛ и ФЛ проводили на силикагелевых пластинках в системах растворителей 6—9 путем сравнения их хроматографической подвижности с модельными образцами, на основании качественных реакций и химических превращений. Количественную оценку каждого класса не проводили. Качественный набор классов ГЛ и ФЛ образцов не различался:
-ГЛ: Моногалактозилдиглицериды, гли-козиды стеринов, дигалактозилдиацилглице-риды, сульфохиновозилдиацилглицериды;
- ФЛ: N-метилфосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилхолин, фосфати-дилинозитол, фосфатидовая кислота.
Таблица 3
Состав липидов семян Borago officinalis L (сем .В or agin ace ae): из коммерческих источников (I) и интродуцированных растений (II)
Классы липидов Содержание,%
I II
Нейтральные липиды Сложные эфиры тритерпе-новых соединений (СЭТТС) 1.6 1.8
Триацилглицериды (ТАГ) 88.7 90.5
Свободные жирные кислоты (СЖК) + токоферолы 3.6 3.3
Диацилглицериды (ДАГ) + стерины 3.5 3.8
Моноацилглицериды (МАГ) 2.6 0.6
Полярные липиды* 0.52 0.27
1. Фосфолипиды (ФЛ) 0.03 0.02
2. Гликолипиды (ГЛ) 0.49 0.25
"Содержание ПЛ в семенах.
26
Башкирский химический журнал. 2010. Том. 17. J4b 4
Состав и содержание жирных кислот в ацилсодержащих классах липидов приведен в табл. 4. Общее содержание насыщенных и ненасыщенных жирных кислот обоих образцов в ТАГ и продуктах их метаболизма (СЖК, МАГ), за исключением ДАГ, практически не отличается, так же, как и содержание ГЛК. Основное количество ГЛК внутри этих классов липидов находится в ТАГ.
Состав неомыляемых компонентов образца I установлен с помощью метода хромато-масс-спектрометрии. В неомыляемой фракции удалось идентифицировать 7 компонентов циклических тритерпеновых спиртов, в том числе пять из них относились к 4.4' - десметил-стеролам: а-ситостерол, ^-стерол, у-стерол, фукостерол, кампестерол; один — к 4-мономе-тилстеролам — обтусифолиол и один — к 4,4'-диметилстеролам — циклоартенол.
Известно, что растения сем. Ботадтасвав содержат в своем составе пирролизидиновые алкалоиды, которые были обнаружены в листьях, цветках и семенах 5. Мы определяли наличие алкалоидов в нейтральных липидах, полярных липидах и в шроте, оставшемся после их удаления. Во всех образцах ИЛ (масла), выделенных различными способами и растворителями, и в ПЛ алкалоиды отсутствовали.
Из шрота нам удалось выделить: при рН 9— 0.18 %; при рН 12—0.08 % алкалоидов от веса шрота, что составило соответственно 0.1% и 0.05% от массы семян.
Таким образом, проведенный анализ липидов коммерческих и интродуцированных семян показал, что они близки по составу и практически не отличаются содержанием гам-ма-линоленовой кислоты, семена легко поддаются интродукции в условиях Ставропольского края, что в дальнейшем может быть использовано для введения в культуру этого растения и промышленного получения масла из семян.
Экспериментальная часть
Масс-спектры получены на спектрометре МХ-1320; хромато-масс-спектры — с использованием системы хроматограф — масс-спектрометр — ЭВМ: хроматограф НР 5890 с масс-се-лективным детектором НР 5972А. Условия анализа: капиллярная кварцевая колонка ИНга-250 м х 0.2 мм, привитая фаза 5% РЬМе5Ю2, начальная температура 30 0С, скорость подъема 100/мин, конечная — 300 0С, расход газа-носителя N 1 мл/мин, температура испарителя 305 0С. Сканирование спектров со скоростью 1 спектр/с, диапазон сканирования 39—500 а.е.м.,
Таблица 4
Состав жирных кислот ацилсодержащих фракций нейтральных липидов семян Borago officinalis (сем. Boraginaceae): коммерчески доступных (I) и интродуцированных семян (II) (% ГЖХ)
Жирные кислоты СЭТТС ТАГ СЖК ДАГ МАГ ГЛ ФЛ
I II I II I II I II I II I II I II
12:0 4.6 1.4 - - 2.0 - 2.9 6.5 28.4 22.5 - - - -
13:0 1.1 - - - - - - 2.6 6.5 10.3 2.5 - 2.1 -
14:0 0.1 - - - 0.61 3.6 1.8 3.8 Сл. 6.4 5.0 0.4 - -
14:1 - - - - - - - - - - 2.6 - - -
15:0 0.3 - - - 0.2 - - - - - 7.1 - 3.2 -
16:0 10.6 21.2 10.9 10.3 28.0 21.0 15.8 13.2 15.6 13.2 33.9 18.1 33.4 26.2
16:1 1.7 1.4 - - 0.8 4.8 2.0 - 7.5 - 0.3 3.3 5.6
17:0 0.8 1.5 - - 0.4 - - - - - 2.4 - 2.4 -
18:0 2.5 5.8 5.5 5.3 11.1 8.1 4.8 12.0 7.3 5.7 8.0 10.0 11.0 15.7
18:1 6.6 28.3 19.9 21.4 28.4 27.6 15.0 16.2 10.4 14.6 13.0 20.0 9.8 16.7
18:2 67.4 18.9 37.7 36.8 21.8 26.1 37.2 26.0 18.7 19.6 15.1 31.0 26.9 26.4
у-18:3 4.0 1.7 18.9 17.8 3.0 2.5 15.0 10.2 5.6 7.7 2.6 11.9 3.8 7.2
а-18:3 - 2.5 - - 0.8 - - - - - - 0.3 - -
18:4 0.2 3.9 0.4 Сл.- 1.5 - - - - - - 1.4 - -
20:0 0.2 5.2 4.1 4.6 1.4 1.8 1.7 2.0 - - - 3.3 - 2.2
20:1 - - - 1.2 - - - 5.8 - - 7.8 - -4.1 -
22:0 0.2 - - - - 4.5 1.8 - - - - - - -
22:1 - - 2.6 2.6 - - 2.0 1.7 - - - 2,8 - -
23:0 - 2.7 - - - - - - - - - 0,5 - -
24:0 - 5.5
2 Насыщ.. 20.3 43.3 20.5 21.4 43.7 39.0 28.8 40.1 57.8 58.1 66.6 32.3 56.2 44.1
2 Ненасыщ.. 79.7 56.7 79.5 78.6 56.3 61.0 71.2 59.9 42.2 41.9 33.4 67.7 43.8 55.9
компьютерная обработка данных - Chem-Station HPMS, интерпретация масс-спектров при помощи библиотечных данных, на основе спект-ро-структурных корреляций, а также на основании закономерностей и особенностей фрагментации тритерпеновых соединений.
ГЖХ-анализ метиловых эфиров жирных кислот проводили на хроматографе «GC-2014» (Shimadzu), капиллярная колонка «Omegawax 250» длиной 30.0 м, диаметром 0.25 мм, сорбент - полиэтиленгликоль, Т колонки - 205 °С, t испарителя - 250 oC, t детектора - 260 oC, газ-носитель Не, скорость подачи газа - 30 мл/мин.
Для разделения, очистки и идентификации липидов использовали системы растворителей:
Для НЛ:
1) Гексан - ацетон - бензол - изопропанол, 69.5 : 25.0 : 4.0 : 1.5.
2) гексан - диэтиловый эфир, 9:1;
3) гексан - диэтиловый эфир, 8:2;
4) гексан - диэтиловый эфир, 7:3;
5) гексан - диэтиловый эфир, 5:5;
Для ПЛ:
6) хлороформ - метанол - 25% раствор аммиака, 65:25:4.
Для ГЛ:
7) хлороформ - ацетон - метанол - уксусная кислота - вода, 65:20:10:10:3;
8) ацетон - толуол - уксусная кислота -вода, 60:60:20:1.
Для ФЛ:
9) а) хлороформ - метанол - бензол -25% раствор аммиака, 26:12:4:2.4,
б) хлороформ - метанол - бензол -ацетон - уксусная кислота, 28:12:4:2:1.6.
Выделение, разделение и идентификацию липидов проводили, как описано 6.
Семена Borago officinalis L. были получены из коммерчески доступных источников. Далее эти семена были интродуцированы на опытных делянках в ботаническом саду Пятигорской государственной фармацевтической академии и с выросших растений были собраны семена (интродуцированные семена).
Количество пигментов определяли по ме-
7 8
тодике , плотность и показатель преломления .
Извлечение алкалоидов из НЛ и ПЛ 9
-500 мг НЛ (в гексане) и ПЛ (в хлороформе) экстрагировали 6 раза 1% раствором H2SO4: 1x20 мл; 2x10 мл; 3x10 мл. Последнюю
кислотную вытяжку проверяли кремнийволь-фрамовой кислотой на наличие алкалоидов. Экстракт, содержащий НЛ или ПЛ, промывали до нейтральной реакции водой и отсутттива-ли над Na2SO4. Объединенные кислотные вытяжки доводили NH4OH до рН 9—10 и экстрагировали алкалоиды хлороформом, растворитель полностью удаляли на роторном испарителе, полученные алкалоиды взвешивали.
Извлечение алкалоидов из шрота
Шрот, оставшийся после удаления НЛ и ПЛ, экстрагировали 3—4 раза смесью растворителей ацетон : вода (8:2). Водно-ацетоновый экстракт упаривали до полного удаления ацетона, водный остаток подкисляли 5% H2S04 до рН 3 и извлекали неалкалоидные вещества хлороформом. Кислотные вытяжки, содержащие алкалоиды в виде солей, подщелачивали Na2CO3 до рН=9 и алкалоиды извлекали хлороформом. Растворитель полностью удаляли на роторном испарителе, полученный остаток взвешивали.
Оставшийся содовый экстракт доводили КОН до рН 12, алкалоиды извлекали хлороформом, хлороформ удаляли на роторном испарителе.
Литература
1. Gunstone F. D. //Prog. Lipids Res.— 1992.— N2. - P. 145.
2. Zadernowski R., Naczk M., Nowak-Polakowska H. // J. Amer. Oil Chem. Soc.- 2002.- V.79, №4.- P. 335.
3. Интродукция бурачника лекарственного в условиях ботанического сада Пятигорской ГФА и изучение посевных качеств его семян. Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Пятигорск.- 2010.-№65.- C. 84.
4. Muhammad Ahmad Khan, Fereidon Shahidi. // J. Amer. Oil Chem. Soc.- 2000.- V.77, №9. -P. 963.
5. WretensjH I., Karlberg B. // J. Amer. Oil Chem. Soc.- 2003.- V. 80.- P. 963.
6. Юнусова C. Г., Юнусов М. C., Каримова А. Р., Миронов В. Ф., Минзанова C. Г., Коновалов А. И., Ефремов Ю. Я., Денисенко О. Н., Чернова Е. В. // Химия природ. соедин.- 2007.- C. 430.
7. Методы биохимического анализа растений.-Л.: Изд-во Ленинградского университета.-1978.- C. 97.
8. Государственная фармакопея РФ.- М.- 2007.-XII.- ч.1.— C.52.
9. Орехов А. П. Химия алкалоидов.- М.: Изд.-во АН CCCP, 1955.- C.13.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента РФ для поддержки ведущих научных школ РФ НШ-3756.2010.3
