CC BY
88
УДК 582.272:57.083.13:576.315
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИПИДОВ И ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ ПИГМЕНТОВ SACCHARINA CICHORIOIDES (MIYABE)
(СЕМ. LAMINARIACEAE). СЕЗОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ АКТИВНОСТИ
© Е.А. Мартыне1, Н.И. Герасименко1, Н.Г. Бусарова1, Е.А. Юрченко1, А.В. Скрипцова2,
М.М. Анисимов1
1 Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, пр. 100 лет Владивостоку, 159, Владивосток, 690022 (Россия), e-mail: [email protected]
2Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, ул. Пальчевского,
17, Владивосток, 690041(Россия)
Исследовали биологическую активность (противомикробную, цитотоксическую, эмбриотоксическую, гемолитическую) суммарных липидов, отдельных фракций и классов липидов, фотосинтетических пигментов из Saccharina cichorioides (Miyabe), влияние сезона сбора водоросли на их активность и изменение состава жирных кислот липидов на их активность,
Противомикробная активность была более выражена у суммарных липидов, отдельных фракций липидов и у фотосинтетических пигментов S. cichorioides, собранных в марте, Высокую противомикробную активность также показали суммарные липиды из образцов водорослей, собранных в сентябре и ноябре, а гемолитическую - в марте и ноябре, Выраженной гемолитической активностью обладали отдельные классы глицерогликолипидов из образцов ламинарий, собранных в ноябре, Цитотоксическую активность в отношении спленоцитов мышей проявили только суммарные липиды из водорослей, собранных в марте, Токсическое действие на эмбрионы морского ежа оказали липиды из S. cichorioides, собранных в июне и сентябре, В отношении карциномы Эрлиха липиды и пигменты были не активны, Ключевые слова: бурые водоросли, липиды, глицерогликолипиды, жирные кислоты, ГЖХ, биологическая активность,
Введение
Настоящая работа является продолжением наших работ по исследованию биологических активностей липидов и фотосинтетических пигментов (ФСП) из бурых водорослей Дальневосточных морей [1, 2]. За рубежом исследованию биологических активностей различных химических соединений водорослей посвящено большое количество работ [3-14]. В нашей стране изучают, как правило, биологическую активность полисахаридов водорослей [15-18]. Липидам же водорослей, как и ФСП, внимание уделялось в меньшей степени, и только в последние годы стали интенсивно исследовать биологическую активность фукоксантина [19-22], жирных кислот (ЖК) [23-25] и глицерогликолипидов (ГЛ) [26-30].
Целью настоящей работы - исследование противомикробной, цитотоксической, эмбриотоксической и гемолитической активности суммарных липидов (СЛ), отдельных фракций и классов липидов, а также ФСП из бурой водоросли S. cichorioides, влияние сезона сбора водоросли на степень активности этих веществ и участие ЖК в проявлении сезонной активности.
Экспериментальна часть
Сбор водорослей Saccharina cichorioides (Miyabe) C.E.Lane, C.Mayes, Druehl & G.W.Saunders (syn. Laminaria cichorioides (Miyabe)) проводили в период с марта по ноябрь 2010 г. в бухте Троицы залива Петра Великого Японского моря на морской экспериментальной станции ТИБОХ ДВО РАН (Приморский край, Хасанский район) на глубине до 8 м. Каждая выборка водорослей содержала 2-3 таллома.
* Автор, с которым следует вести переписку,
Экстракцию СЛ (включающих ФСП, которые экстрагируются совместно с липидами) проводили, как описано ранее [31]. Количество СЛ определяли гравиметрически. Метиловые эфиры ЖК (МЭЖК) получали переэтерификацией липидов, согласно методу Карро и Дубака [32]. Анализ МЭЖК проводили методом ГЖХ, как описано ранее [31].
Фракции липидов и ФСП получали на колонке с силикагелем 40-100 мкм (Chemapol, Чехия). Для элюирования нейтральных липидов (НЛ) и ФСП использовали последовательно гексан и градиент диэти-лового эфира в гексане, для ГЛ - смесь ацетон - этанол в соотношении 7 : 3 (объемные соотношения). Выход веществ с колонки контролировали ТСХ в присутствии стандартов из шпината Spinacia oleracea: триа-цилглицеринов (ТАГ), свободных жирных кислот (СЖК), холестерина, фукоксантина, хлорофилла (Хл) и ГЛ. В полученных с колонки фракциях НЛ и ГЛ содержание компонентов рассчитывали, используя метод ГЖХ [31]. Содержание свободных стеринов (Сс) определяли, используя реакцию Либермана-Бурхарда с измерением поглощения при 656 нм [31]. Содержание ФСП определяли, как описано ранее [31]. Выделение моногалактозилдиацилглицеринов (МГДГ), дигалактозилдиацилглицеринов (ДГДГ), сульфохиново-зилдиацилглицеринов (СХДГ), фукоксантина, Хл, ТАГ и Сс проводили из фракций, содержащих эти компоненты, на дополнительных колонках с силикагелем 20-40 мкм.
Противомикробную активность исследовали на микроорганизмах Vibrio alginolyticus КММ 644, Staphylococcus aureus ATCC 21027, Escherichia coli ATCC 15034 Candida albicans KMM 453, Fusarium ox-ysporum KMM 4639, Aspergillus niger KMM 4634 из коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН. Противомикробную активность определяли методом диффузии в агар-агар, как описано ранее [2]. Для культивирования V. alginolyticus использовали среду с морской водой (пептон - 0,5%, K2HPO4 - 0,02%, MgSO4 - 0,005%, глюкоза - 0,1%, дрожжевой экстракт - 0,1%, NaOH - 0,01%, агар-агар - 1,8%, морская вода-дистиллированная вода 1 : 1), а для бактерий - без морской воды. C. albicans, F. oxysporum, A. niger культивировали на питательной среде Сабуро (глюкоза - 3%, пептон - 3%, агар-агар - 1,8%, дистиллированная вода). Нитрофунгин (1 мг/мл) (АЙВЭКС, Чешская Республика) использовали как положительный контроль, а ДМСО - как отрицательный.
Гемолитическую активность определяли при двух значениях pH (6,0 и 7,4) с использованием суспензии эритроцитов белых беспородных мышей по методике, описанной ранее [2]. В качестве контроля использовали сапонин (Fluka, Германия).
Для определения цитотоксической активности в качестве тест-объекта использовали спленоциты и опухолевые клетки белых беспородных мышей обоего пола (весом 18-20 г). Спленоциты выделяли из го-могената селезенки, а опухолевые клетки из асцидной жидкости животного троекратным центрифугирова-нием в течение 5 мин при 450 g в физиологическом растворе, после чего их ресуспендировали в физиологическом растворе. Конечная концентрация клеток в культуральной среде 3-5*106 клеток/мл. 10 мкл тестируемого препарата и 190 мкл суспензии клеток помещали в лунки 96-луночной микропланшеты. Планшеты встряхивали и инкубировали в термостате при 37 °С в течение 1 ч. После инкубирования 10 мкл суспензии клеток смешивали с 10 мкл 0,4% трипанового синего в сбалансированном солевом растворе (DiaM, Россия) и переносили на предметное стекло. Через 1-5 мин с помощью светового микроскопа ImagerA1 (Carl Zeiss, Германия), используя программу AxioVision (Carl Zeiss, Германия), подсчитывали количество живых и мертвых клеток и определяли цитотоксическую активность фракций (отношение количества погибших клеток к количеству живых). Затем проводили расчет значений ЭД50 при помощи программы STATISTICA 6,0.
Для определения эмбриотоксической активности в качестве модели использовали половые клетки морского ежа Strongylocentrotus intermedius. Половые клетки отмывали трижды в стерильной морской воде и проводили оплодотворение. Суспензию оплодотворенных яйцеклеток разливали в 24-луночные планшеты с тестируемыми веществами. Инкубировали при 24 °Св течении 3 часов. Процесс развития эмбрионов без добавления исследуемых веществ и с максимальным количеством ДМСО (1%) использовали в качестве контроля. Эмбриотоксическую активность выражали в ингибирующей концентрации ИК50.
Обсуждениерезулътатов
Как показано в таблице 1, СЛ из водорослей, собранных в разное время года, проявили активность в отношении используемых в работе микроорганизмов. При этом степень проявления активности зависела от времени сбора водоросли. Среди бактериальных клеток наиболее чувствительными к ингибирующему
действию СЛ оказались грамположительные бактерии S. aureus, в меньшей степени грамотрицательные бактерии E. coli. Как полагают, это происходит за счет того, что противобактериальные вещества эффективнее транспортируются через плотные пептидогликановые слои грамположительных бактерий, чем через гликолипидные слои грамотрицательных бактерий [5]. Механизм этого процесса не определен.
СЛ водорослей включают в свой состав липиды разного строения. Общим для них является наличие ЖК. В настоящей работе мы рассматриваем влияние ЖК на степень активности СЛ, отдельных классов ГЛ, а также степень активности разных фракций веществ, выделенных из СЛ.
А.П. Десбоис с сотрудниками [24] показали, что ЖК 16 : 1 n-7 и 16 : 3 n-4 из диатомовых водорослей активны против грамположительных бактерий. 16 : 1 n-7 кислота быстро убивает бактерии и является высокоактивной против бактерии S. aureus, устойчивой ко многим лекарствам. Авторы также провели исследование влияния двойной связи на активность ЖК. Оказалось, что 16:0 не активна против бактерий, а присутствие двойной связи в ЖК является критичным для проявления активности. Противобактериальный потенциал ЖК растет с увеличением числа двойных связей у кислот с одинаковым числом атомов углерода. Положение двойных связей также оказывает влияние на степень проявления противомикробной активности. Точный механизм противомикробного действия ЖК не известен, хотя, как предполагают, они инициируют процесс пе-рекисного окисления и ингибируют синтез ЖК, у бактерий или ЖК взаимодействуют с мембранами так, что ингибируют клеточное дыхание. В обзоре (Десбоис и Смит [25]) приводится обширный перечень СЖК, проявляющих различные биологические активности, в том числе противомикробную. Липиды водорослей включают большинство ЖК, представленных в перечне. Однако СЛ из S. cichorioides не всегда проявляли активность и степень проявления ее в разные сезоны сбора имела существенные различия. Так, СЛ из образцов S. cichorioides, собранных в марте, сентябре и октябре, подавляли рост бактерий более активно (табл. 1). Мы проанализировали состав ЖК СЛ для определения ЖК, влияющих на проявление активности (табл. 2).
Липиды из водорослей, собранных в марте, включали 18:1 n-9, 18:2 n-6, 18:4 n-3, 20:4 n-6 и 20:5 n-3 в весьма заметных количествах. В сентябре и в октябре в них был высок уровень 16:1 n-7 и 18:1 n-9 кислот. В марте ПНЖК составляли до 43% от суммы ЖК, а в сентябре и в октябре их доля была примерно в 3,5 раза ниже (табл. 2). Доля же моноеновых и насыщенных ЖК была выше, чем в марте. Противобактериаль-ная активность СЛ из образцов водорослей, собранных в мае и июне, была несколько ниже (табл. 1). В это время в липидах, как и в марте, был высок уровень 18:1 n-9, 18:2 n-6, 18:4 n-3, 20:4 n-6 и 20:5 n-3 ЖК и выше, чем в марте, уровень 16:1 n-7 кислоты. Доля ПНЖК в сумме ЖК была сопоставима с их долей в марте. В июле, как и в марте, в мае и в июне, в липидах был высок уровень тех же ЖК. Однако СЛ, выделенные из водорослей, собранных в июле, были неактивны против S. aureus и показали слабую активность против
Е. coli (табл. 1). СЛ из водорослей, собранных в ноябре, были активные только против S. aureus. Уровень ПНЖК в них был самым высоким из всех исследованных месяцев, а уровень насыщенных ЖК - самым низким (табл. 2). Стоит отметить, что главной по содержанию ЖК в липидах с марта по ноябрь была 16:0. Ее уровень колебался от 15,6 до 40,4%.
Таблица 1. Противомикробная активность Cn из S. cichorioides
Микроорганизм
Время сбора водоросли S. Aureus E. coli C. albicans A. niger F. oxysporum V. alginolyticus
зона лизиса, мм от края лунки
Март: взрослые 6,8±0,2 2,3±0,2 0,8±0,2 2,2±0,2 3,8±0,2
ювенильные 4,3±0,2 8,8±0,2 1,0±0 -
Май* 4,0±0,3 1,3±0,2 - 3,0±0,2 0,8±0,2 -
Июнь* 3,0±0 1,0±0 1,0±0 4,0±0 3,0±0 -
Июль* - 1,0±0 - - -
Сентябрь* 6,7±0,3 3,7±0,2 3,0±0 4,0±0 9,8±0,2 4,0±0
Октябрь* 5,3±0,2 2,5±0 2,0±0 4,8±0,2 7,5±0,5 2,0±0
Ноябрь* 3,4±0,2 - - - 2,0±0 -
Нитрофунгин 14,0±0 3,8±0,2 6,0±0 12,0±0,2 3,8±0,2 6,0±0
*- взрослые водоросли,
Таблица 2. Состав жирных кислот (% от их суммы) липидов у S. cichorioides
Жирные кислоты Месяцы сбора водоросли (с марта по ноябрь)
3* 5* 6* 7* 9* 10 11*
14:0 8,1 9,5 6,0 6,5 12,9 9,7 3,0
15:0 0,4 0,4 0,4 1,4 1,9 1,1 0,2
16:0 23,0 18,8 20,1 19,0 40,4 37,3 15,6
16:1 n-7 3,8 7,2 14,6 9,4 14,2 7,8 4,0
16:2 n-6 СЛ, 0,9 - 1,9 0,9 0,6 0,5
18:0 1,2 1,4 1,4 0,9 2,1 3,0 2,0
18:1 n-9 17,9 15,9 13,6 15,3 16,8 26,0 15,9
18:1 n-7 1,1 0,9 1,4 1,1 - 2,0 1,3
18:2 n-6 9,4 8,8 10,1 8,5 6,1 6,6 8,6
18:3 n-6 - 0,2 - - - - 0,6
18:3 n-3 2,1 5,5 3,7 8,3 2,5 2,0 5,3
18:4 n-3 8,1 7,8 6,2 5,5 - 0,9 5,5
20:0 СЛ, 0,2 СЛ, - - 1,1 1,3
20:3 0,5 - СЛ - - - 1,5
20:4 n-6 13,1 11,1 8,5 9,8 1,3 1,6 15,5
20:4 n-3 0,5 0,5 - - - - 0,8
20:5 n-3 9,2 9,9 13,6 11,7 0,5 0,3 15,2
X насыщенных 32,7 30,3 27,9 27,8 57,3 52,2 22,1
X моноеновых 22,8 24,4 29,6 25,8 31,0 35,8 21,2
X полиеновых 42,9 44,3 42,1 46,4 11,7 12,0 53,5
X ПНЖК n-6 22,5 21,3 18,6 20,9 8,3 8,8 25,2
X ПНЖК n-3 19,9 23,7 23,5 29,5 3,0 3,2 26,8
*- образец содержит не идентифицированные ЖК. Данные приведены как средние значения, рассчитанные по трем повторным анализам. Стандартные отклонения, составляющие порядка + 0,2-1,0% от среднего значения, в таблице не приводятся.
Как видно, нет четкой связи ме^ду степенью проявления активности СЛ с определенными видами ЖК. Для проявления активности, скорее всего, важным является соотношение молекулярных видов ЖК и наличие других компонентов в СЛ. Мы сравнили активность СЛ из взрослых и ювенильных образцов водоросли (сбор в марте). Состав ЖК липидов с возрастом водоросли не изменился, но несколько изменилось соотношение отдельных кислот. Так, у молодых водорослей было выше содержание 20:4 n-6 и 16:1 n-7 кислот - 17,2 и 4,9% против 13,1 и 3,8% у взрослых водорослей и меньше содержание 18:4 n-3 - 6,8% против 8,1% у взрослых водорослей. При этом СЛ из ювенильных водорослей были активны против Е. coli в большей степени, чем против S. aureus, ay взрослых водорослей было наоборот (табл. 1).
В работе мы также исследовали влияние других компонентов СЛ на их активность. Для этого выделили фракции из СЛ водорослей, собранных в марте и в ноябре. Фракции, выделенные из СЛ, собранных в марте (табл. 3), как и СЛ S. cichorioides, имели более заметную активность против бактерий, чем фракции из СЛ водорослей, собранных в ноябре (табл. 4). Активность фракций зависела от их состава. Против
S. aureus была активна в большей степени фракция, включающая в свой состав ТАГ, Сс и Хл, фракция Сс и Хл, фракция Хл и фракция фукоксантина. Фракция ГЛ имела слабую активность против бактерий (табл. 3). Фракции из СЛ водорослей, собранных в ноябре, имели более узкий состав и были, как и СЛ, менее активны против бактерий (табл. 4). Заметной была активность только против S. aureus у фракций Сс, МГДГ и фракции фукоксантина (табл. 4). При сравнении фракций, включающих в свой состав ТАГ (табл. 3 и 4), видно, что с увеличением его количества активность фракций падает. Включение в состав фракций Сс увеличивает активность фракций в большей степени против S. aureus. Фракция, включающая только Сс, обладает самой высокой активностью против S. aureus. Хлорофиллы не проявляли активности (табл. 4), но фракции, включающие их в свой состав, были активны (табл. 3).
В случае фукоксантина разная степень его активности, скорее всего, зависела от соотношения во фракции окисленной и не окисленной форм пигмента и степени чистоты фракций фукоксантина.
Таким образом, на активность фракций оказывает влияние состав и соотношение компонентов в них, а в действии компонентов проявляются эффекты синергизма или антагонизма. Эти же эффекты проявляются и в СЛ. Степень проявления зависит от сезона сбора водоросли, так как в разные сезоны в СЛ водорослей меняется соотношение их компонентов [31, 33].
Таблица 3. Противомикробная активность липидов и ФСП из S. cichorioides (сбор в марте)
Фракции1 Микроорганизмы
S. aureus E. coli C. albicans A.niger F.oxysporum V. alginolyticus
зона лизиса, мм от края лунки
ТАГ, СЖК, Хл2 2,8±0,2 2,0±0 0,8±0,2 - - 1,0±0
ТАГ, Сс, Хл3 6,2±0,3 1,7±0,2 0,8±0,2 3,8±0,3 3,7±0,2 -
Сс, Хл4 5,7±0,3 1,3±0,2 1,0±0 4,7±0,3 - -
Фукоксантин5 8,3±0,3 2,3±0,2 1,0±0 2,0±0 5,0±0 -
Хл 8,0±0 2,0±0 1,7±0,2 4,5±0,2 4,8±0,2 1,0±0
ГЛ 1,3±0,3 1,8±0,2 - 3,0±0 3,0±0 -
МГДГ 3,0±0 - - - - -
ДГДГ - - - - - -
СХДГ - - - - - -
Нитрофунгин 14,0±0 3,8±0,2 6,0±0 12,0±0,2 3,8±0,2 6,0±0
1 - содержание (в %) веществ во фракциях: 2 - 85:5:10; 3 - 10:45:45; 4 - 70:30; 5 - 90:10,
Таблица 4. Противомикробная активность липидов и ФСП из S. cichorioides (сбор в ноябре)
Фракции Микроорганизмы
S. aureus E. coli C. albicans A. niger F. oxysporum V. alginolyticus
зона лизиса, мм от края лунки
ТАГ - - - - 1,5±0,2 -
Сс 3,6±0,3 - - - 4,7±0,3 2,0±0
Хл - - - - 4,0±0 2,0±0
Фукоксантин 1,5±0 - - - 6,0±0 1,7±0
МГДГ 2,0±0 - - - 2,5±0,2 -
ДГДГ - - - - - -
СХДГ - - - - 1,0±0 -
Нитрофунгин 14,0±0 3,8±0,2 6,0±0 12,0±0,2 3,8±0,2 6,0±0
ГЛ составляют значительную часть СЛ водорослей, и, как показано выше, фракция ГЛ, выделенная из СЛ S. cichorioides, собранной в марте, проявила активность против бактерий (табл. 3). В состав фракции входят МГДГ, ДГДГ и СХДГ. Мы исследовали активность каждого класса ГЛ. МГДГ проявили более высокую активность, но только в отношении S. aureus. В отношении Е. coli все классы ГЛ были не активны. Эти же классы ГЛ, выделенные из липидов водоросли, собранной в ноябре, проявили себя аналогично. Мы исследовали состав ЖК этих классов (табл. 5). В МГДГ (март, ноябрь) мы отметили высокий уровень ПНЖК, ав ДГДГ ив СХДГ - насыщенных ЖК. Преобладание в МГДГ полиеновых ЖК, видимо, приводит к его более высокой активности против грамположительной бактерии S. aureus, но не против Е. coli. Высокая степень насыщенности ДГДГ и СХДГ, видимо, влияет на активность этих классов, делая их не активными. Скорее всего, в составе фракции действие отдельных классов ГЛ суммируется, делая фракцию относительно активной как против S. aureus, так и против Е. coli.
ЖК обладают как противобактериальными, так и антифунгальными свойствами [25]. Мы исследовали активность СЛ против диморфных дрожжевых клеток C. albicans, которые являются причиной многих заболеваний у людей - от кожных инфекций до глубоких микозов. Подавление роста было умеренно выражено только у СЛ из водорослей, собранных в сентябре и октябре (табл. 1). Как показано Тибане с сотрудниками [23], липиды, выделенные из морских организмов, богаты ПНЖК и такими из кислот, как 18:4 n-3, 20:5 n-3, 22:5 n-3 и 22:6 n-3 эффективно ингибируют метаболизм в митохондриях C. albicans. СЛ из S. cichorioides, собранных в сентябре и октябре, и проявившие активность против C. albicans, имели высокую долю 16:0, 16:1 n-7, 18:1 n-9 (табл. 2). Уровень же ПНЖК был невысоким (в сумме до 12%), а в них заметным было содержание только 18:2 n-6. Мы исследовали активность фракций, выделенных из образцов водорослей, собранных в марте (табл. 3) и ноябре (табл. 4). СЛ из мартовских водорослей проявили невысокую активность, как и фракции, выделенные из них (табл. 3). Только у фракции ГЛ, как и у отдельных классов ГЛ, активность против C. albicans отсутствовала. СЛ из ноябрьских образцов водорослей и их отдельные вещества были не активны против C. albicans (табл. 4). И в марте, и в ноябре СЛ водорослей содержали высокий уровень ПНЖК (табл. 2), а активными были только первые. Как и в случае бактерий, СЛ проявляют активность за счет совместного действия отдельных веществ, входящих в их состав. Содержание отдельных веществ имеет сезонные колебания.
Таблица 5. Состав жирных кислот (% от их суммы) у ГЛ бурой водоросли X cichorioides
Жирные кислоты МГДГ ДГДГ СХДГ
март ноябрь март ноябрь март ноябрь
14:0 16,9 6,5 - 2,0 3,5 1,3
15:0 - - - 8,8 0,6 -
16:0 16,7 21,4 66,7 29,8 44,4 48,3
16:1 n-7 - 7,1 - 2,1 1,2 7,9
16:1 n-5 2,5 - - - 3,5 -
17:0 - - - 1,4 - -
18:0 1,8 4,2 6,0 22,9 3,1 2,0
18:1 n-9 9,6 19,8 11,6 7,0 28,4 31,7
18:1 n-7 - - - 11,7 0,8 0,8
18:2 n-6 11,7 9,8 9,9 3,8 9,4 8,0
18:3 n-6 n-3 4,5 14,1 - 2,4 - -
18:4 n-3 13,6 7,6 - 4,1 1,4 -
20:0 - - - - 1,5 -
20:3 - - 5,8 - - -
20:4 n-6 6,6 2,6 - - 0,8 -
20:4 n-3 9,2 - - - - -
20:5 n-3 6,9 6,9 - 4,0 1,4 -
X насыщенных X моноеновых X полиеновых 35.4 12,1 52.5 32,1 26,9 41,0 72.7 11,6 15.7 64,9 20,8 14,3 53,1 33,9 13,0 51,6 40,4 8,0
A. niger является условно-патогенным возбудителем, однако в условиях сниженного иммунитета он приобретает патогенные свойства, становясь паразитом. Особенно опасен он в стадии плодоношения, когда на стенах сырых помещений образует черную плесень. Для его уничтожения чаще используют химические препараты, ультразвук или ультрафиолет. СЛ ламинарий проявляют более выраженную активность против A. niger, чем против C. albicans (табл. і). Активность против A. niger была более выражена у СЛ из S. cichorioides, собранных в июне, в сентябре и в октябре СЛ из образцов водорослей, собранных в июле и в ноябре, не проявили активности (табл. і). Фракции, выделенные из образцов водорослей, собранных в марте, показали более высокую активность, чем СЛ (табл. 3). Более выраженная активность была у фракций, включающих Сс и Хл, у Хл и у ГЛ (табл. 2). Следует отметить, что отдельные классы Г Л оказались не активными. Фракции липидов и ФСП из S. cichorioides, собранных в ноябре, были не активны против A. niger (табл. 4).
F. oxysporum является патогенным грибом, вызывающим болезни многих культурных растений. СЛ из водорослей, собранных в сентябре, октябре и марте проявили высокую активность против этого гриба (табл. і). Отдельные фракции липидов из ламинарий, собранных в марте, проявили высокую активность - это фракции, ТАГ, Сс и хлорофиллы; хлорофиллы; фукоксантин и ГЛ (табл. 3). Фракции липидов и ФСП из водорослей, собранных в ноябре, также показали высокую степень активности против F. oxysporum (табл. 4). ТАГ проявили активность против гриба, в то же время в составе фракций (март), они были не активны, или активность их увеличивалась при сочетании с Сс и Хл. МГДГ и СХДГ были активны против F. oxysporum, аМГДГ, ДГДГ и СХДГ, выделенные из мартовских водорослей, были не активны против этого гриба (табл. 3). В ноябре все классы ГЛ содержали 16:1 n-7, в марте в этих классах ГЛ - она отсутствовала или ее уровень был низок (табл. 5). В ноябрьских образцах МГДГ, ДГДГ и СХДГ был выше, чем в марте, уровень моноеновых ЖК, а уровень полиеновых ЖК уменьшился. Скорее всего, изменения в соотношении моноено-вых и полиеновых ЖК оказывает влияние на активность отдельных классов ГЛ против F. oxysporum.
В отношении морского вибриона V. alginolyticus, патогенного для людей и рыб, были активны только СЛ из водорослей, собранных в сентябре и в октябре. В остальные месяцы СЛ активности не проявили (табл. і). Фракция, содержащая ТАГ, СЖК и Хл, и фракция Хл (сбор водоросли в марте) проявили слабую активность против этого патогена (табл. 3). Хл, фукоксантин и Сс из ноябрьских водорослей проявили активность против V. alginolyticus, в то время как ТАГ и отдельные классы ГЛ были неактивны (табл. 4).
Гемолитическая активность экстрактивных веществ морских водорослей связана с их токсическим действием [34]. Многие авторы эту активность связывают с присутствием глицерогликолипидов [35-37]. Гемолитическая активность СЛ также зависела от сезона сбора S. cichorioides (табл. 6). Наиболее выражен-
ными гемолитиками оказались СЛ из водорослей, собранных в марте и ноябре. Они же обладали относительно высокой цитотоксической активностью в отношении спленоцитов мышей. СЛ из водорослей, собранных в мае, июне, сентябре и октябре, вызывали лизис эритроцитов в весьма высоких концентрациях (табл. 6). Усиление гемолиза происходило при смещении pH среды от 7,4 до 6,0.
Таблица 6. Цитотоксическая активность СЛ и отдельных веществ из S. cichorioides. Все значения рассчитаны в ЭД50 и приведены в мкг/мл
Месяцы сбора водо- Гемолитическая активность Цитотоксическая Эмбриотоксическая
росли/вещества pH 6,0 pH 7,4 активность активность
СЛ
март 2,3 3,2 8,6 75,3
май 43,2 >100,0 72,8
июнь 15,2 25,0 >100,0 36,0
сентябрь 40,6 36,6 >100,0 20,3
октябрь 26,0 24,0 63,0 68,4
ноябрь 2,42 5,8 15,8
Вещества (март):
ТАГ, СЖК, Хл2 4,03 7,7 >100,0 4,5
ТАГ, Сс, Хл3 >100,0 >100,0 >100,0 2,9
Сс, Хл4 >100,0 >100,0 >100,0 >100,0
Фукоксантин5 >100,0 >100,0 >100,0 4,3
Хл >100,0 >100,0 >100,0 3,9
ГЛ >100,0 >100,0 >100,0 >100,0
МГДГ 93,7 97,8 >100,0
ДГДГ >100,0 >100,0 >100,0
СХДГ >100,0 >100,0 >100,0
Вещества (ноябрь):
ТАГ 10,8 >100,0 >100,0
Сс 9,8 19,6 32,0
МГДГ 5,8 14,3 >100,0
ДГДГ 2,3 45,3 >100,0
СХДГ 5,8 47,3 >100,0
хлорофиллы 10,3 45,8 26,2
фукоксантин 12,8 18,8 35,3
Сапонин 7,5 40,0
Как показано в обзоре (Десбоис и Смит [25]), гемолитическую активность проявляют такие ЖК, как 20:4 n-6, 20:5 n-3 и кислоты с 18 атомами углерода. СЛ S. cichorioides содержали эти ЖК, однако соотношение их в СЛ, как и соотношение разных классов липидов и пигментов, зависело от времени года.
Фракции, выделенные из СЛ водорослей, собранных в марте, не проявили гемолитической активности, за исключением одной фракции, включающей ТАГ, СЖК и Хл, которая вызывала лизис эритроцитов в относительно низких концентрациях (табл. 6). Вещества же, выделенные из водорослей, собранных в ноябре, вызывали гемолиз в относительно низких концентрациях (табл. 6). Более высокую активность проявили МГДГ, ДГДГ и СХДГ, в меньшей степени - ТАГ, Сс, хлорофиллы и фукоксантин. Усиление гемолиза эритроцитов под действием этих веществ происходило при смещении pH среды от 7.4 до 6.0. Гемолитическая активность классов ГЛ из S. cichorioides, собранных в разное время года, имела существенные различия. Не исключено, что за способность ГЛ разрушать мембрану эритроцитов отвечают в большей степени моноеновые ЖК и, в частности, 16:1 n-7 кислота. МГДГ, ДГДГ, СХДГ и ТАГ, выделенные из СЛ S. cichorioides (ноябрь), были не токсичны в отношении спленоцитов мышей. Только у пигментов и Сс наблюдалась небольшая токсичность (табл. 6). Все фракции, полученные из мартовских водорослей, были не токсичны относительно спленоцитов мышей. СЛ и их фракции были не активны в отношении карциномы Эрлиха. Наиболее токсичными для эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius были СЛ из водорослей собранных в июне и в сентябре. Причины активности трудно объяснить только составом ЖК липидов, так как в эти месяцы он сильно различался. СЛ из мартовских водорослей проявили слабую эм-бриотоксическую активность, а фракции (ТАГ, Сс и Хл), (ТАГ, СЖК и Хл), Хл и фукоксантин, напротив, обладали высокой активностью (2,9; 4,5; 3,9 и 4,3 мкг/мл соответственно).
Выводы
Таким образом, в результате проведенной работы были зафиксированы сезонные изменения в биохимическом составе и биологической активности бурой водоросли S. cichoriodes. У S. cichorioides мы обнаружили существенные различия в содержании ЖК в СЛ и отдельных глицерогликолипидах, отдельных классов липидов, а также в содержании ФСП, которые связаны со временем года и жизненным циклом водоросли. Проявление противомикробной активности СЛ и их фракций, видимо, является видоспецифичным и определяется структурой воздействующих на микроорганизмы веществ. Для проявления активности липидов против бактерий важным является не только степень ненасыщенности ЖК, а и их соотношение. ФСП S. cichorioides (март) показали достаточно высокую противомикробную активность, не обладая при этом токсичностью, для животных клеток. Тогда как ФСП S. cichorioides (ноябрь) не обладали выраженной противомикробной активностью, однако вызывали лизис эритроцитов в достаточно низких концентрациях. Такое сезонное проявление активности, вероятно, происходит из-за изменения соотношения молекулярных видов хлорофиллов или каротиноидов в их фракциях. Активность отдельных классов глицерогликолипи-дов также зависела от сезона сбора водорослей. Проявление противомикробной и гемолитической активностей липидами, их отдельными фракциями и классами носит сложный характер. По всей видимости, в проявлении активности велика роль как соотношения компонентов в СЛ, так и распределения ЖК по классам липидов, степень ненасыщенности ЖК и положение двойных связей в ЖК.
Полученные в работе данные о периодах накопления у S. cichorioides отдельных видов ЖК и ФСП представляют производственный интерес, так как многие из них обладают высоким биологическим потенциалом.
Список литературы
1, Герасименко Н.И,, Чайкина Е.Л., Бусарова Н.Г,, Анисимов М.М, Противомикробная и гемолитическая активности низкомолекулярных метаболитов бурой водоросли Laminaria cichorioides Miyabe // Прикладная биох, микробиол, 2010, Т, 46, С, 467-471,
2, Анисимов М.М,, Мартыяс Е.А,, Чайкина Е.П., Герасименко Н.И, Противомикробная, гемолитическая и фиторегулирующая активности липидных экстрактов из морских водорослей // Химия растительного сырья, 2010, №4, С, 125-130,
3, Matta C.B.B. da, Souza E,T, de, Queiroz A,C, de, Lira D,P, de, Araujo M,V, de, Cavalcante-Silva L.H.A., Miranda G,E, de, Araujo-Junior J,X, de, Barbosa-Filho J,M,, Oliveira Santos B,V, de, Alexandre-Moreira M.S. Antinociceptive and anti-inflammatory activity from algae of the genus Caulerpa // Mar. Drugs, 2011, V, 9, Pp. 307-318,
4, Folmer F., Jaspars M., Dicato M., Diederich M, Photosynthetic marine organisms as a source of anticancer compounds // Phytochem. Rev, 2010, V, 9, Pp. 557-579,
5, Fenical W., Hugles C.C. Antibacterials from the sea // Chem. Eur, J, 2010, V, 16, Pp. 12512-12525,
6, El Gamal A.A. Biological importance of marine algae // Saudi Pharm. J, 2010 V, 18, Pp. 1-25,
7, Ben Aoun Z., Ben Said R., Farhat F, Anti-inflammatory, antioxidant and antimicrobial activities of aqueous and organic extracts from Dictyopteris membranacea // Bot, Mar. 2010, V, 53, N3, Pp. 259-264,
8, Tierney M.S., Croft A.K., Hayes M, A review of antihypertensive and antioxidant activity found in macroalgae // Bot. Mar. 2010, V, 53, N5, Pp. 387-408,
9, Kamenarska Z., Serkedjieva J,, Najdenski H., Stefanov K., Tsvetkova I,, Dimitrova-konaklieva S., Popov S. Antibacterial, antiviral, and cytotoxic activities of some red and brown seaweeds from the Black Sea // Bot. Mar. 2009, V, 52, Pp. 80-86.
10, Demirel Z., Yilmaz-Koz F.F., Karabay-Yavasoglu U.N., Ozdemir G., Sukatar A, Antimicrobial and antioxidant activity of brown algae from the Aegean sea // J, Serbian Chem, Soc, 2009, V, 74, N6, Pp. 619-628,
11, Manial A,, Sujith S., Selvin J,, Shakir C., Kiran G.S. Antibacterial activity of Falkenbergia hillebrandii (Born) from the Indian coast against human pathogens // Phyton-Intern. J. Exp. Bot. 2009. V. 76. Pp. 161-166.
12, Lategan C., Kellerman T., Afolayan A.F., Mann M.G., Antunes E.M., Smith P.J., Bolton J.J., Beukes D.R. Antiplasmo-dial and antimicrobial activities of South African marine algal extracts // Pharm, Biol, 2009, V, 47, N5, Pp. 408-413,
13, Ibtissam C., Hassane R., Jose M.L., Francisco D.S.J., Antonio G.V.J., Hassan B., Mohamed K, Screening of antibacterial activity in marine green and brown macroalgae from the coast of Morocco // African J, Biotech, 2009, V, 8, N7, Pp. 1258-1262,
14, Kandhasamy M., Arunachalam K.D. Evaluation of in vitro antibacterial property of seaweeds of southeast coast of India // African J, Biotech, 2008, V, 7, N12, Pp. 1958-1961,
15, Kuznetsova T.A. Fucoidan extracted from Fucus evanescens brown algae corrects immunity and hemostasis disorders in experimental endotoxemia // Bull, Exp. Biol, Med, 2009, V, 147, N1, Pp. 66-69,
16. Lapicova E.S., Drozd N.N., Tolstenkov A.S., Makarov V.A., Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Bacunina I.U., Besednova N.N., KuznetsovaT.A. Inhibition of thrombin and factor Xa by Fucus evanescens fucoidan and its modified analogs // Bull. Exp. Biol. Med. 2008. V. 146, N3. Pp. 328-333.
17. Cumashi A, Ushakova NA, Preobrazhenskaya ME, V., D’Incecco A., Piccoli A., Totani L., Tinari N., Morozevich G.E., Berman A.E., Bilan M.I., Usov A.I., Ustyuzhanina N.E., Grachev A.A., Sanderson C.J., Kelly M., Rabinovich G.A., Iacobelli S., Nifantiev N.E. A comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds// Glycobiology. 2007. V. 17, N5. Pp. 541-552.
18. Kuznetsova T.A., Besednova N.N., Mamaev A.N., Momot A.P., Shevchenko N.M., Zvyagintseva T.N. Anticoagulant activity of fucoidan from brown algae Fucus evanescens of the Okhotsk sea// Bull. Exp. Biol. Med. 2003. V. 136, N5. Pp. 471-473.
19. Vilchez C., Forjan E., Cuaresma M., Bedmar F., Garbayo I., Vega J.M. Marine Carotenoids: Biological Functions and Commercial Applications // Mar. Drugs. 2011. V. 9. Pp. 319-333.
20. Hosokawa M., Okada T., Mikami N., Konishi I., Miyashita K. Biofunctions of marine carotenoids // Food Sci. Bio-technol. 2009. V. 18, N1. Pp. 1-11.
21. Maeda H., Hosokawa M., Sashima T., Funayama K., Miyashita K. Effect of mediumchain triacylglycerols on antiobesity effect of fucoxantin // J. Oleo Sci. 2007. V. 56, N12. Pp. 615-621.
22. Sugawara T., Matsubara K., Akagi R., Mori M., Hirata T. Antiangiogenic activity of brown algae fucoxanthin and its deacetylated product, fucoxanthinol // J. Agric. Food Chem. 2006. V. 54. Pp. 9805-9810.
23. Thibane V.S., Kock J.L.F., Ells R., van Wyk P.W.J., Pohl C.H. Effect of Marine Polyunsaturated Fatty Acids on Biofilm Formation of Candida albicans and Candida dubliniensis // Mar. Drugs. 2010. V. 8. Pp. 2597-2604.
24. Desbois A.P., Lebl T., Yan L., Smith V.J. Isolation and structural characterisation of two antibacterial free fatty acids-from the marine diatom, Phaeodactylum tricornutum// Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. V. 81. Pp. 755-764.
25. Desbois A.P., Smith V.J. Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 85. Pp. 1629-1642.
26. Eitsuka T., Nakagawa K., Igarashi M., Miyazawa T. Telomerase inhibition by sulfoqunovosuldiacylglycerol from edible purple laver (Porphyrayezoensis) // Cancer Lett. 2004. V. 212. Pp. 15-20.
27. Arunkumar K., Selvapalam N., Rengasamy R. The antibacterial compound sulphoglycerolipid 1-0 palmitoyl-3-0(6'-sulpho-a-quinovopyranosyl)- glycerol from Sargassum wightii Greville (Phaeophyceae) // Bot. Mar. 2005. V. 48, N5. Pp. 441-445.
28. Bruno A., Rossi C., Marcolongo G., Di Lena A., Venzo A., Berrio C.P., Corda D. Selective In Vivo AntiInflammatory Action of the Galactolipid Monogalactosyldiacylglycerol // Europ. J. Pharmacol. 2005. V. 524. Pp. 159-168.
29. Kim Y. H, Kim E. H, Lee C. Kim M. H., Rho J. R Two new monogalactosyl diacylglycerols from brown alga Sargassum thunbergii // Lipids. 2007. V. 42. Pp. 395-399.
30. Zou Y., Li Y., Kim M-M., Lee S-H., Kim S-K. Ishigoside, a new glyceroglycolipid isolated from brown alga Ishige okamurae // Biotech. Bioprocess Engin. 2009. V. 14. Pp. 20-26.
31. Герасименко Н.И., Бусарова Н.Г., Моисеенко О.П. Возрастныеизменения в содержании липидов, жирных кислот и пигментов у бурой водоросли Costaria costata // Физиология растений. 2010. Т. 57. С. 217-223.
32. Carreau J.P., Dubacq J.P. Adaptation of a Macroscale Method to the Micro-Scale for Fatty Acid Methyl Transesteri-fication of Biological Lipid Extracts // J. Chromatogr. 1978. V. 151. Pp. 384-390.
33. Хотимченко С.В. // Липиды морских водорослей-макрофитов и трав. Структура, распределение, анализ. Владивосток, 2003. 234 c.
34. Meldahl A.S., Edvardsen B., Fonnum F. Toxicity of four potentially ichthyotoxic marine phytoflagellates determined by four different test methods // J. Toxicol. Environ. Health. 1994. V. 42, N3. Pp. 289-301.
35. Yasumoto T, Underdal B, Aune T, Hormazabal V, Skulberg O.M, Oshima Y Screening for hemolytic and ichthyotoxic components of Chrysochromulina polylepis and Gyrodinium aureolum from Norwegian coastal waters. In: Graneli E, Sundstrom B, Edler L, Anderson DM (eds) Toxic marine phytoplankton. Elsevier, New York, 1990. Pp. 436-440
36. Mooney B.D., Nichols P.D. de Salas M.F., Hallegraeff G.M. Lipid, fatty acid, and sterol composition of eight species of Kareniaceae (Dinophyta): chemotaxonomy and putative lipid phycotoxins // J. Phycol. 2007. V. 43. Pp. 101-111.
37. Dorantes-Aranda J.J., Garcia-de la Parra L.M., Alonso-Rodriguez R., Morquecho L. Hemolytic activity and fatty acids composition in the ichthyotoxic dinoflagellate Cochlodinium polykrikoides isolated from Bahia de La Paz, Gulf of California // Marine Pollution Bulletin. 2009. V. 58. Pp. 1401-1405.
Поступило в редакцию 19 января 2012 г.
