CC BY
27
УДК 577.15: 541.128
Поиск поврежденных участков ДНК метил-Срё-связывающим ферментом MBD4
Д. А. Яковлев1, А. А. Кузнецова1, О. С. Федорова1,2*, Н. А. Кузнецов1,2* 'Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 8
2Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2 *E-mail: [email protected], [email protected] Поступила в редакцию 12.05.2016 Принята к печати 04.07.2016
РЕФЕРАТ Метил-СрО-связывающий фермент MBD4 инициирует процесс деметилирования ДНК, удаляя модифицированное азотистое основание и формируя апуриновые/апиримидиновые сайты в ДНК. MBD4 содержит два домена - метилцитозинсвязывающий, обеспечивающий локализацию фермента в CpG-доменах ДНК, и ДНК-гликозилазный, отвечающий за каталитическую активность. Изучены механизмы специфического узнавания сайтов деметилирования и образования каталитически активного комплекса между модельными ДНК-субстратами и каталитическим N-гликозилазным доменом MBD4cat. Методом остановленной струи в режиме реального времени по изменению интенсивности флуоресценции остатков триптофана в MBD4cat и флуорофоров в ДНК зарегистрированы конформационные переходы в белке и ДНК-субстратах в процессе их взаимодействия, установлен кинетический механизм и рассчитаны константы скорости образования и распада интермедиатов реакции. Используя дуплексы разной длины, показали, что образованию каталитически активного комплекса MBD4cat предшествует стадия первичного связывания с ДНК, на которой происходят поиск и узнавание модифицированного основания. Установлена природа взаимных конформационных перестроек в процессе взаимодействия ДНК-гликозилазы MBD4cat с ДНК, содержащей модифицированные нуклеотиды.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА MBD4, деметилирование ДНК, конформационная динамика, предстационарная кинетика, репарация ДНК.
СОКРАЩЕНИЯ MBD4cat - каталитический домен MBD4 человека (метилцитозинсвязывающий домен 4); 5-hmU - 5-гидроксиметилурацил; АР - апуриновый/апиримидиновый сайт; F - (2К,3£)-2-(оксиметил)-3-окситетрагидрофуран; aPu - 2-аминопурин; FAM - 6-карбоксифлуоресцеин; BHQ1 - тушитель флуоресценции black hole quencher; FRET - резонансный перенос энергии флуоресценции; ПААГ - полиакриламидный гель.
ВВЕДЕНИЕ
Процессы метилирования и деметилирования ДНК лежат в основе эпигенетической регуляции экспрессии генов, которая играет большую роль в клеточной дифференцировке, геномном импринтинге, канцерогенезе, а также во многих возрастных изменениях организмов. Известно, что в процессе деметилиро-вания ДНК участвуют различные ферментативные системы: ДНК-метилтрансферазы, диоксигеназы и ДНК-гликозилазы [1, 2]. ДНК-гликозилазы инициируют процесс деметилирования путем удаления метилированного основания ДНК, поэтому для восстановления исходного нуклеотида необходимы
и другие ферменты, такие, как АР-эндонуклеазы (АРЕ1), ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы [3-5].
ДНК-гликозилаза MBD4 [КФ 3.2.2.-] содержит два домена - метилцитозинсвязывающий и ДНК-гликозилазный. Каталитический ^гликозилазный домен MBD4cat состоит из 138 аминокислотных остатков (остатки 437-574), образующих девять а-спиралей, которые формируют глобулярную структуру и карман активного центра [6]. Структура MBD4cat позволяет отнести его к семейству «спираль-шпилька-спираль» (HhH), названному так из-за мотива а7-петля-а8, характерному для различных белков этого семейства.
Л
Gly536, Ile532,l Leu534, Ile537 J
Gly538,1 Lys539, > Tyr540 J
Leu466,l Asp560,> Lys562 J
Gly471
Asp510
Tyr509
Рис. 1. Схематическое изображение пространственной структуры комплекса MBD4cat с ДНК. А - функционально важные аминокислотные остатки, участвующие в образовании специфических контактов между ферментом и ДНК [12]. Б - сравнение структуры свободного фермента MBD4cat (розовый, PDB Ю 4Е9Е, [11]) и комплекса фермента MBD4cat с ДНК (зеленый, PDB Ю 4DK9, [12]). АР-сайт (черный) вывернут из дуплекса и расположен в активном центре фермента, аминокислотные остатки Агд468 и Leu508 (синий) встроены в дуплекс ДНК
Основным субстратом MBD4 является ДНК, содержащая некомплементарные пары G • T либо G • U [2]. MBD4 также активен в отношении 5-гидроксимети-лурацила (5-hmU) [7]. Считается, что 5-hmU образуется в качестве интермедиата в многостадийном пути активного деметилирования, в котором 5-meC ги-дроксилируется TET-диоксигеназами с образованием 5-гидроксиметилцитозина (5-hmC). Затем 5-hmC дезаминируется дезаминазой AID с образованием 5-hmU и удаляется при участии MBD4 в процессе эксцизионной репарации [8]. MBD4 активен и в отношении некоторых галогенированных субстратов: 5-ClU и 5-BrU, образующихся при воспалительных процессах, и 5-FU, который может возникать при химиотерапии [9]. Более того, фермент активен по отношению к 3,№-этеноцитозину (eC), который образуется при перекисном окислении липидов и метаболизме винилхлорида [10].
В настоящее время определены структуры MBD4cat в свободном состоянии и в комплексах с ДНК-дуплексами, содержащими пары 5-hmU/G, T/G и AP/G [11, 12]. Как показано на рис. 1А, в комплексе с продуктом реакции фермент взаимодействует преимущественно с пятью нуклеотидами
поврежденной цепи ДНК. Образование фермент-субстратного комплекса не приводит к значительным конформационным перестройкам по сравнению со свободным белком (рис. 1Б). В то же время ДНК-дуплексы в комплексе с MBD4cat изогнуты в области модифицированного нуклеотида, нуклеотид вывернут из двойной спирали, а азотистое основание находится в активном центре. MBD4cat образует прямые контакты с пятью фосфатными группами, расположенными с 5'- и 3'-стороны от вывернутого нуклеотида [12]. Два аминокислотных остатка, А^468 и Leu508, встраиваются в ДНК через малую бороздку и заполняют пространство в дуплексе, которое образуется после выворачивания модифицированного нуклеотида. Предполагается, что гидролиз ^гликозидной связи протекает по механизму ну-клеофильного замещения [7]. Нуклеофильная атака на С1'-атом осуществляется либо координированной в активном центре фермента молекулой воды, либо карбоксильной группой Asp560 [7, 12].
Ранее в работе [13] была изучена предстацио-нарная кинетика накопления продукта реакции ^гликозилирования G/T-содержащего ДНК-субстрата в ходе катализируемого MBD4 процесса
в условиях одного оборота фермента в течение 15 с -10 ч. Показано, что кинетика процесса характеризуется двумя фазами: начальной быстрой и следующей за ней медленной фазой, возникающей из-за прочного связывания фермента с продуктом реакции - АР-сайтом.
Цель настоящей работы состояла в изучении механизмов узнавания ферментом специфического сайта в субстрате и формирования каталитически компетентного состояния. Для этого исследовали конформационную динамику MBD4cat и модельных ДНК-субстратов на коротких временах в интервале 2 мс-200 с в условиях, соответствующих или близких «одному обороту фермента». Изменения конформа-ции белка регистрировали по изменению флуоресценции остатков триптофана (Trp), а конформации ДНК - по изменению флуоресценции остатка 2-ами-нопурина (aPu) или по эффективности резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) пары красителей FAM/BHQ1. В качестве субстратов использовали дуплексы, содержащие пару U : G, а в качестве аналога продукта - дуплексы, содержащие неразрезаемый аналог AP-сайта - остаток (2R,3S)-2-(оксиметил)-3-окситетрагидрофурана (F-сайт). Влияние длины дуплекса на связывание фермента с ДНК и поиск повреждения изучали с использованием субстратов разной длины: 12, 17 и 28 п.н. На основании полученных данных определили кинетический механизм взаимных конформационных перестроек в процессе взаимодействия ДНК-гликозилазы MBD4cat с ДНК, содержащей модифицированные ну-клеотиды.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали реактивы производства Sigma-Aldrich (США): акриламид, N,N'-метиленбисакриламид, дитиотреит, мочевину, EDTA, ацетонитрил, глицерин, трис-(гидроксиметил)-аминометан, а также отечественные реактивы квалификации «ос. ч.». Все растворы готовили на дважды дистиллированной воде.
ДНК-субстраты
Дезоксирибоолигонуклеотиды синтезированы в лаборатории бионанотехнологий ИХБФМ СО РАН на автоматическом ДНК/РНК-синтезаторе ASM-800 («Биоссет», Новосибирск, Россия) с использованием коммерческих амидофосфитов нуклеозидов и CPG-носителей (GlenResearch, США). Нативные и модифицированные дезоксирибоолигонуклеотиды выделяли с помощью ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1200 (США), используя колонку Zorbax SB-C18 (5 мкм) 4.6 х 150 мм, в линейном градиенте ацетони-трила (0 — 50%) в присутствии 20 мМ ацетата три-
Таблица 1. Нуклеотидные последовательности дезок-сирибоолигонуклеотидов и структуры модифицированных нуклеотидов
Сокращенное название Последовательность
и12-субстрат СТСТС (U)ССТТСС GAGAG G GGAAGG
Е12-лиганд СТСТС(F)ССТТСС GAGAG G GGAAGG
FaPu^^ra^^ СТСТС(F)(aPu)CTTCC GAGAG G С GAAGG
и17-субстрат GCTCA(U)GTACAGAGCTG CGAGT G CATGTCTCGAC
UaPu^-субстрат GCTCA(U)(aPu)TACAGAGCTG CGAGT G С ATGTCTCGAC
FAM-U-BHQ1- субстрат FAM-GCTCA(U)GTACAGAGCTG CGAGT G CATGTCTCGAC-BHQ1
и28-субстрат GTGTCACCACTGCTCA(U)GTACAGAGCTG CACAGTGGTGACGAGT G CATGTCTCGAC
VW*( )-1 ХААГО-1
о о
F aPu
этиламмония, рН 7, в течение 30 мин при скорости элюции 2 мл/мин. Фракции, содержащие дезокси-рибоолигонуклеотиды, высушивали под вакуумом, растворяли в воде и осаждали 2% LiClO4 в ацетоне. После промывки чистым ацетоном и высушивания осадки дезоксирибоолигонуклеотидов растворяли в воде и хранили при -20°С до использования. Гомогенность очищенных дезоксирибоолигонуклео-тидов подтверждали с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях (20% полиакриламид-ный гель, 8 М мочевина, 0.1 М трис-боратный буфер, рН 8.3). Дезоксирибоолигонуклеотиды визуализировали с помощью красителя Stains-All (Sigma, США). Субстраты и лиганды фермента представляли собой 12-, 17- и 28-звенные дезоксирибоолигонуклеотид-ные дуплексы, представленные в табл. 1.
Фермент MBD4cat
Каталитический домен ДНК-гликозилазы человека MBD4cat (аминокислотные остатки 426-580) был вы-
делен из клеток Escherichia coli Rosetta 2, трансформированных плазмидой pET29b-MBD4cat как описано ранее [11, 14]. Плазмида pET29b-MBD4cat, содержащая ген MBD4cat, была любезно предоставлена М.К. Сапарбаевым (Groupe Réparation de l'ADN, Université Paris-Sud XI, Institut Gustave Roussy, Франция). Культуру клеток E. coli Rosetta 2 выращивали в среде LB (1 л), содержащей 50 мкг/мл канамицина, при температуре 37°С до оптической плотности 0.6-0.7 на длине волны 600 нм. После этого температуру понижали до 20°С и индуцировали транскрипцию, добавляя изопропил-ß-D-тиогалактопиранозид до 0.2 мМ. После индукции клетки инкубировали в течение 16 ч, затем осаждали центрифугированием (10 мин при 12000 об/мин) и готовили суспензию клеток в 30 мл буферного раствора I (20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.8), содержащего 50 мМ KCl. Клетки лизировали под давлением при помощи Френч-пресса SIM AMINCO. Все последующие процедуры проводили при 4°С. Клеточный лизат центрифугировали (40 мин при 30000 об/мин), супернатант наносили на колонку I (Q-Sepharose Fast Flow, Amersham Biosciences, Швеция) и промывали буферным раствором I (20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.8), содержащим 50 мМ KCl. Фракции, содержащие белок, собирали и наносили на колонку II (HiTrap-Helating™, Amersham Biosciences, Швеция) в буферном растворе II (20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.8), содержащем 500 мМ NaCl и 20 мМ имида-зол. Хроматографию проводили в буферном растворе II и линейном градиенте 20 ^ 500 мМ имидазола. Оптическую плотность раствора регистрировали на длине волны 280 нм. Чистоту белка определяли с помощью гель-электрофореза. Фракции, содержащие белок MBD4cat, диализовали в буфере (20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.5, 1 мМ EDTA, 1 мМ дитиотре-ит, 250 мМ NaCl, 50% глицерин) и хранили при -20°С. Концентрацию фермента рассчитывали из значения оптической плотности раствора белка на длине волны 280 нм и коэффициента молярной экстинкции 54493 М-1см-1 [15].
Все эксперименты по исследованию ферментативной реакции проводили в буферном растворе: 50 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 50 мМ KCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ дити-отреит, 9% глицерин при 25°C.
Электрофорез в ПААГ
Продукты реакции разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с использованием меченных 32P по 5'-концу олигонуклео-тидов, содержащих модифицированное основание. Мечение олигонуклеотидов по 5'-концу проводили согласно [16]. Зависимости степени превращения субстрата от времени определяли следующим об-
разом. К 10 мкл буферного раствора, содержащего 32Р-меченый олигонуклеотид и эквимолярное количество комплементарного олигонуклеотида, добавляли 10 мкл 2.0-4.0 мкM фермента в том же буферном растворе. Реакционную смесь быстро перемешивали и через определенные промежутки времени отбирали аликвоты объемом 2 мкл, которые переносили в предварительно подготовленные пробирки, содержащие 2 мкл раствора 7 M мочевины, 0.1% бромфе-нолового синего и 0.1% ксиленцианола. Затем добавляли 1 мкл 1 M NaOH и инкубировали при 56°C в течение 15 мин для гидролиза фосфодиэфирных связей в АР-сайтах. Раствор нейтрализовали эквивалентным количеством соляной кислоты, наносили на ПААГ и проводили электрофорез при напряженности 50 В/см. Количество образующегося продукта определяли путем сканирования радиоавтографа на приборе Molecular Imager FX phosphorimager (Bio-Rad, США) и обработки данных в программном пакете Gel-Pro Analyzer 4.0 (Media Cybernetics, США). Степень накопления продуктов рассчитывали как отношение площадей пиков продуктов к сумме площадей пиков продуктов и пика исходного оли-гонуклеотида. Ошибка определения, как правило, не превышала 20%.
Изучение кинетики процесса методом остановленной струи
Кинетические кривые флуоресценции регистрировали методом остановленной струи на спектрометре SX.18MV (Applied Photophysics, Великобритания). Белок MBD4cat содержит восемь остатков Trp и семь остатков Tyr. Возбуждение флуоресценции MBD4cat проводили на длине волны 290 нм, регистрацию флуоресценции - на длинах волн более 320 нм (фильтр WG-320, Schott, Германия). В этих условиях основной вклад в флуоресценцию белка обеспечивают остатки Trp (> 90%). При использовании субстратов, содержащих остатки aPu, флуоресценцию возбуждали на длине волны 310 нм, а регистрацию проводили на длинах волн более 370 нм (фильтр LG-370, Corion, США). Для анализа эффективности переноса энергии FRET пары FAM/BHQ1 флуоресценцию красителя FAM возбуждали на длине волны 494 нм. Флуоресценцию красителя FAM регистрировали на длинах волн более 515 нм при использовании светофильтра OG-515 (Schott, Германия). «Мертвое» время прибора составляло 1.4 мс. Каждую кинетическую кривую получали, усредняя, как минимум, три экспериментальные кривые.
Анализ кинетических данных
Для получения минимальной кинетической схемы, описывающей взаимодействие фермента с субстра-
тами, и расчета констант скорости конформационных переходов в ходе всех элементарных стадий получали набор кинетических кривых для разных концентраций фермента или субстрата. Количественную обработку результатов проводили с помощью программы DynaFit (BioKin, США) [17] путем оптимизации значений параметров, входящих в кинетические схемы, как описано ранее [18-20].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Взаимодействие MBD4cat с 28-звенным ДНК-дуплексом
На рис. 2А представлены кинетические кривые изменения интенсивности флуоресценции остатков Trp в процессе взаимодействия MBD4cat с 28-звенным субстратом U28. Поскольку MBD4cat образует контакты лишь с пятью нуклеотидами ДНК, использование в качестве субстрата 28-звенного ДНК-дуплекса приводит к значительному вкладу в суммарную скорость процесса стадии поиска остатка урацила в ДНК. Действительно, из полученных кинетических кривых (рис. 2А) видно, что интенсивность флуоресценции Trp уменьшается в широком временном диапазоне - 2 мс-10 с. Затем следует фаза роста интенсивности флуоресценции Trp (10-100 с).
Анализ накопления продуктов реакции с помощью электрофоретического разделения реакционной смеси в ПААГ (рис. 2Б) показал, что процесс характеризуется двумя фазами: быстрой (до ~200 с) и медленной (до 1600 с и выше). На начальном участке кинетических кривых (до 200 с) наблюдается «скачок», за которым следует медленный рост. Такой вид кривых свидетельствует о существовании скоростьлимитирующей стадии после каталитической реакции. Увеличение концентрации U28 с 0.25 до 1.0 мкМ приводит к увеличению количества расщепляемого субстрата на стадии «скачка» до 0.7 мкМ. Однако при дальнейшем увеличении концентрации и28-субстрата до 2.0 мкМ это значение незначительно увеличивается до 0.9 мкМ, что свидетельствует о насыщении активной формы фермента ДНК-субстратом. Таким образом, данные о накоплении продуктов реакции показывают, что концентрация активной формы фермента равна примерно 1.0 мкМ. Достаточно низкое значение активной формы каталитического домена MBD4cat (~ 25%), по-видимому, связано с особенностями сборки полипептида в функциональный белок в клетках E. coli, что согласуется с данными [13].
Таким образом, можно предположить, что падение интенсивности флуоресценции Trp в области 2 мс-~10 с характеризует образование первичного комплекса и поиск модифицированного основания,
А
[MBD4cat] = 2.0 мкМ
[Ц8], мкМ
ГТ|-.—I .......
0.1 1 Время, с
[MBD4cat] = 4.0 мкМ
"Т-
100
[UJ, мкМ
М
к м
800 Время, с
Рис. 2. Кинетика взаимодействия MBD4cat с и28-субстратом. А - экспериментальные кинетические кривые изменения интенсивности флуоресценции остатков Тгр и расчетные кривые, полученные путем обработки данных согласно схеме. [MBD4cat] = 2.0 мкМ, концентрация и28 изменяется от 1.0 до 4.0 мкМ. Б - накопление продукта реакции по данным электрофореза в ПААГ. [MBD4cat] = 4.0 мкМ, концентрация и изменяется от 0.25 до 2.0 мкМ
а рост в интервале ~10-100 с - каталитически-компетентной конформации фермента и начало процесса накопления продукта. Необходимо отметить, что повышение интенсивности флуоресценции Тгр в интервале 10-100 с (рис. 2А) совпадает по времени с началом накопления продуктов реакции (рис. 2Б). Скоростьлимитирующей стадией ферментативного процесса скорее всего является стадия диссоциации комплекса фермент-продукт, что согласуется с выводами, сделанными ранее [10].
Количественный анализ кинетических кривых взаимодействия MBD4cat с 28-звенным ДНК-
Б
0
400
200
1600
субстратом (рис. 2А) позволил предложить минимальную кинетическую схему, удовлетворительно описывающую экспериментальные данные. Две равновесные стадии характеризуют первичное связывание ДНК и последующий процесс перестройки конформации фермента, приводящий к образованию каталитически компетентного комплекса, в котором ^гликозидная связь подвергается необратимому гидролизу. Завершает ферментативный цикл равновесная стадия диссоциации комплекса фермента и ДНК-продукта. Константы скорости и константы равновесия, характеризующие приведенные на схеме стадии, представлены в табл. 2. Используя константы скорости элементарных стадий, получены значения стационарных параметров ферментативного процесса (Кт и к которые хорошо согласуются с данными [11, 13].
Используя уравнение (1), на основании данных (е0 = 4.0 мкМ, = 0.5 мкМ, рис. 2Б) оценили фактическую скорость стационарной фазы реакции V « (3.2 ± 1.2) х 10-5 мкМ/с. Ожидаемое значение максимальной скорости каталитической реакции, оцененное по формуле ^^ = &са(; х е0, где е0 - исходная концентрация фермента, с учетом 25% активности фермента равно 4.6 х 10-2 мкМ/с. Это означает, что лимитирующей является не химическая стадия, а, вероятно, диссоциация комплекса фермента с продуктом реакции, что коррелирует с наличием «скачка» на кинетических кривых накопления продукта.
V = A[P]/At,
(1)
где Д[Р] - прирост концентрации продукта Р за время
Взаимодействие MBD4cat с 17-звенным ДНК-дуплексом
Кинетические кривые, полученные при взаимодействии MBD4cat с более коротким 17-звенным ДНК-субстратом, имеют две фазы изменения интенсивности флуоресценции Тгр, как и в случае с 28-звенным дуплексом (рис. 3А). Анализ продуктов реакции с помощью электрофоретического разделения реакционной смеси в ПААГ (рис. 3Б) показал, что в случае и17-субстрата накопление продуктов происходит в интервале времени < 1000 с. Кинетические кривые имеют выраженный «скачок» накопления продукта в интервале времени до 200 с с последующим медленным увеличением концентрации продукта. Последующее замедление накопления продуктов реакции свидетельствует о том, что процесс диссоциации комплекса фермент-продукт является скоростьлимитирующим, как и для и28-субстрата.
Кинетический механизм взаимодействия MBD4 с ДНК-субстратами. Е - фермент, S - субстрат, (Е • S)1 и (Е • S)2 - комплексы фермента с субстратом, (Е-Р) -комплекс фермента с продуктом, Р - продукт превращения субстрата, к. и к . - константы скорости прямых и обратных реакций равновесных стадий, к3 - константа скорости каталитической стадии, Кр - равновесная константа диссоциации комплекса Е-Р
Анализ кривых кинетики флуоресценции, представленных на рис. 3А, показал, что они описываются минимальной кинетической схемой. Константы скорости и равновесия, характеризующие эти стадии, представлены в табл. 2. Интересно отметить, что уменьшение на 11 нуклеотидов неспецифического участка дуплекса и17-субстрата по сравнению с и28-субстратом не приводит к значительным изменениям констант скорости образования и распада первичного комплекса (E • S)r Тем не менее уменьшение длины дуплекса привело к увеличению константы равновесия K2, характеризующей образование каталитического комплекса (E • S)2, в 2.4 раза по сравнению с и28-субстратом (13.0 и 5.5 соответственно). Это должно быть связано с уменьшением времени поиска поврежденного участка, который происходит как путем одномерной диффузии вследствие скольжения и небольших «прыжков» (hopping) [21-23] фермента по цепи ДНК, так и трехмерной диффузии, включающей множественные акты ассоциации-диссоциации.
Как и в случае и28-субстрата, у и17-субстрата
фактическая стационарная скорость накопления
продукта V составляет ~ (6.2 ± 0.9) х 10-5 мкМ/с
при е0 = 4.0 мкМ, s0 = 0.5 мкМ, и меньше значения
V = 4.2 х 10-2 почти в 1000 раз. Это различие, а тактах 1 1 '
же «скачок» на кинетических кривых накопления продукта реакции (рис. 3Б) свидетельствуют о том, что диссоциация комплекса фермента с продуктом реакции лимитирует скорость ферментативного процесса.
Взаимодействие MBD4cat с 12-звенным ДНК-дуплексом
На рис. 4 представлены кривые изменения интенсивности флуоресценции остатков Trp, соответствующие процессу взаимодействия MBD4cat с 12-звенным субстратом U12. Из рис. 4А видно, что кинетические кривые имеют две фазы: падения интенсивности (10-500 мс) и роста с выходом на плато (0.5-10 с). Кинетика накопления продуктов
Таблица 2. Константы скорости и константы равновесия процессов взаимодействия MBD4cat с различными субстратами, полученные из анализа флуоресцентных данных
^^^^^^^Субстраты Константы^^^^^^^^ и28 и!7 и!2 F 12
к, Х 10-6, с-1М-1 7.0 ± 2.0 12.0 ± 3.0 0.5 ± 0.2 10.0 ± 4.0
к,, с-1 30 ± 10 45 ± 20 3.3 ± 0.5 8.0 ± 4.0
К Х 10-6, M-1 0.2 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.15 ± 0.06 1.2 ± 0.8
к,, с-1 2.1 ± 0.3 3.0 ± 1.0 0.18 ± 0.04 0.08 ± 0.01
к 2, с-1 0.38 ± 0.05 0.23 ± 0.05 0.12 ± 0.01 0.03 ± 0.01
К, 5.5 ± 1.1 13.0 ± 5.0 1.5 ± 0.3 2.7 ± 0.9
кз, с-1 0.056 ± 0.007 0.046 ± 0.002 < 0.01
КР, М (1.0 ± 0.2) Х 10-7 (1.5 ± 0.2) Х 10-7
К М 6.6 Х 10-7 2.7 Х 10-7 2.6 Х 10-6 2.2 Х 10-7
вКт, М 7.4 Х 10-7 3.2 Х 10-7
гк „ с-1 4.6 Х 10-2 4.2 х 10-2
а К, = к/к,, К2 = к2/к_2, б К = Kass = К + К, Х K2,
в Кт = (к^ + к_,/с_2 + к_,кз)/к1(к2 + к_2 + кз), Г кса, = к2кз/(к2 + к2 + кз).
ферментативной реакции, определенная с помощью электрофоретического разделения реакционной смеси в ПААГ (рис. 4Б), свидетельствует о том, что каталитическая стадия проходит на временах порядка (> 1000 с), т.е. значительно медленнее стадий, соответствующих изменению интенсивности Тгр. Следовательно, изменения интенсивности флуоресценции остатков Тгр, зарегистрированные в интервале времени до 200 с, скорее всего отражают начальные конформационные изменения фермента в ходе образования фермент-субстратного комплекса и дальнейшую перестройку конформации фермента. При этом каталитически компетентное состояние формируется неэффективно, и реакция гидролиза ^гликозидной связи значительно замедляется по сравнению с 17- и 28-звенными субстратами. Поэтому для анализа серии кинетических кривых использовали только равновесные стадии связывания ДНК, характеризующие образование комплексов (Е • S)1 и (Е • S)2 на схеме. Константы скорости, характеризующие эти стадии и полученные путем анализа кинетических кривых изменения интенсивности флуоресценции фермента (рис. 4А), представлены в табл. 2.
Сравнение констант скорости взаимодействия MBD4cat с 12- и 17-звенным субстратами показывает, что при уменьшении длины дуплекса на пять нуклеотидов значительно уменьшается скорость как образования первичного комплекса (Е • S)1, характеризуемого константой скорости к , так и его распада, кЛ, - в 24 и 14 раз соответственно. При этом константа ассоциации Е и S с образованием комплекса (Е • S)1, К1, уменьшается лишь в 2 раза. Можно
предположить, что неспецифический участок и17-субстрата выполняет функцию матрицы, с которой в условиях быстрого равновесия образуется первичный комплекс (Е • S)1, что позволяет ферменту производить эффективный поиск поврежденного участка. Действительно, константа образования к2 каталитического комплекса (Е • S)2 в случае и17-субстрата в 17 раз больше, чем в случае и12-субстрата. Таким образом, увеличение неспецифического участка дуплекса на пять нуклеотидов в и17-субстрате по сравнению с и12-субстратом приводит к уменьшению общей константы диссоциации К в 10 раз (табл. 2). Отсутствие в и12-субстрате неспецифического участка, по-видимому, препятствует образованию правильно ориентированной активной конформации фермента.
Взаимодействие MBD4cat с аналогом продукта
Удаление модифицированного основания ферментом MBD4 приводит к образованию АР-сайта в ДНК. Для того чтобы идентифицировать природу кон-формационных изменений фермента и ДНК, происходящих в процессе связывания продукта реакции, содержащего АР-сайт, использовали его стабильный аналог, представляющий собой остаток (2R,3S)-2-(оксиметил)-3-окситетрагидрофурана ^-сайт), не содержащий ОН-группу в положении С1' дезок-сирибозы. Взаимодействие MBD4cat с F12-лигандом должно приводить к формированию комплекса, имитирующего комплекс фермента с продуктом реакции после осуществления каталитической стадии ферментативного процесса.
Кинетические кривые изменения интенсивности флуоресценции Тгр при взаимодействии MBD4cat
[MBD4cat] = 2.0 мкМ
[U17], мкМ
[MBD4cat] = 2.0 мкМ
0.1 1 Время, с
[MBD4cat] = 4.0 мкМ
кМ
I 0.6 -
1200 Время, с
[U17], мкМ 2.0
Время, с
[MBD4cat] = 4.0 мкМ
800 1200 Время, с
[U12], мкМ 1.0
[U12], мкМ 20.0
Рис. 3. Кинетика взаимодействия MBD4cat с Ц7-субстратом. А - экспериментальные кинетические кривые изменения интенсивности флуоресценции остатков Тгр и расчетные кривые, полученные путем обработки данных согласно схеме. [MBD4cat] = 2.0 мкМ, концентрация и17 изменяется от 1.0 до 4.0 мкМ. Б - накопление продукта реакции, по данным электрофореза в ПААГ. [MBD4cat] = 4.0 мкМ, концентрация и изменяется от 0.25 до 2.0 мкМ
Рис. 4. Кинетика взаимодействия MBD4cat с и12-субстратом. А - экспериментальные кинетические кривые изменения интенсивности флуоресценции остатков Тгр и расчетные кривые, полученные путем обработки данных согласно схеме (стадии 1 и 2); [MBD4cat] = 2.0 мкМ, концентрация Ц2 изменяется от 1.0 до 3.0 мкМ. Б - накопление продукта реакции, оцененное методом электрофореза в ПААГ; [MBD4cat] = 4.0 мкМ, концентрация и12 изменяется от 2.0 до 20.0 мкМ
А
А
Б
Б
8
6
4
2
0
0
400
800
1600
2000
2400
0
400
1600
2000
2400
и F^-лиганда имеют двухфазный профиль (рис. 5), как и в случае и12-субстрата (рис. 4). Можно предположить, что уменьшение и последующий рост интенсивности флуоресценции Trp имеют такую же природу, как и у ДНК-дуплекса, содержащего ури-дин. Таким образом, независимо от природы модифицированного нуклеотида первичное связывание и дальнейшая перестройка конформации фермента в процессе взаимодействия MBD4cat с ДНК приводят к образованию каталитически активного комплекса
(рис. 5). Полученные кинетические кривые удовлетворительно описываются двухстадийной равновесной кинетической схемой. Константы скорости, характеризующие эти стадии, представлены в табл. 2.
Сравнение констант скорости и равновесия (табл. 2), характеризующих взаимодействие MBD4cat с и12-субстратом и F12-лигандом, показывает, что с аналогом продукта реакции первичный комплекс образуется примерно в 10 раз более эффективно. Нужно отметить, что константы равновесия
[MRD4cat] = 2.0 мкМ
[F,,], мкМ
IVV™^
2.0
[MRn4cat] = 2П мкМ
I I I I I I I I | I I I I I I I I | I I I I I I I I | I I 1 | гтттп-1 р I I I I и |
0.01 0.1 1 10 100 Время, с
Рис. 5. Кинетика взаимодействия MBD4cat с F12-лигандом. Экспериментальные кинетические кривые изменения интенсивности флуоресценции остатков Тгр и расчетные кривые, полученные путем обработки данных согласно схеме (стадии 1 и 2). [MBD4cat] = 2.0 мкМ, концентрация F12 изменяется от 1.0 до 4.0 мкМ
второй стадии отличаются менее чем в 2 раза. Таким образом, можно сделать заключение, что поиск и связывание поврежденного участка ДНК ферментом MBD4cat происходят более эффективно в случае дестабилизированного F-сайтом ДНК-дуплекса.
Сравнительный анализ конформационных изменений фермента и ДНК
Для того чтобы уточнить природу процессов, происходящих при образовании каталитического комплекса и зарегистрированных по изменению интенсивности остатков Тгр фермента, использовали модельные ДНК-дуплексы, несущие флуоресцентные остатки (табл. 1) в качестве «сенсоров» конформационных изменений ДНК. Известно, что интенсивность флуоресценции аРи в ДНК зависит от микроокружения флуорофора и изменяется, например, в результате локального плавления дуплекса в непосредственной близости от флуорофора [24-26]. В двухцепо-чечных структурах ДНК при образовании стэкинга с соседними основаниями интенсивность флуоресценции остатков аРи резко уменьшается по сравнению с одноцепочечной ДНК. Использование иаРи17-субстрата, несущего остаток аРи с 3'-стороны от уридина, позволило зарегистрировать конформа-ционные изменения в ДНК, происходящие при взаимодействии с MBD4cat, вероятно, в результате вы-
0.01 0.1 1 10 100 1000 Время, с
Рис. 6. Сравнение кинетических кривых, зарегистрированных по изменению интенсивности флуоресценции остатков Тгр, aPu или FRET-сигнала в процессе взаимодействия MBD4cat с и17, ШРи17, FaPu12 и FAM-U-BHQ1-субстратами и по накоплению продуктов реакции. Показаны экспериментальные и теоретические кинетические кривые. Концентрация ДНК-субстратов равна 1.0 мкМ, [MBD4cat] = 2.0 мкМ
ворачивания поврежденного нуклеотида из ДНК и встраивания в образовавшуюся полость остатков Arg468 и Leu508. Как видно из рис. 6, на кинетической кривой, характеризующей взаимодействие MBD4cat и иаРи17-субстрата, имеется фаза быстрого роста (1-50 мс) интенсивности флуоресценции aPu, свидетельствующая о дестабилизации центральной части дуплекса на начальных этапах фермент-субстратного взаимодействия.
Кроме того, для исследования изменений структуры ДНК-субстрата применили метод FRET. Для этого использовали FAM-U-BHQl-субстрат, содержащий красители FAM и BHQ1 на 5'-концах олигонуклеоти-дов, формирующих дуплекс, что позволило зарегистрировать конформационные изменения дуплекса, связанные с изменением расстояния между красителями. Видно (рис. 6), что на начальном участке кинетической кривой (1-50 мс) происходит небольшое уменьшение FRET-сигнала, свидетельствующее об изгибании дуплекса. Сравнение с кривой изменения интенсивности флуоресценции остатков Trp показывает, что в этот момент времени (< 100 мс) фермент не претерпевает значительных конформа-ционных изменений. Поэтому можно предположить, что в процессе первичного связывания ДНК происходит изгибание спирали и частичное плавление центральной части дуплекса. По-видимому, именно
такие индуцированные ферментом изменения структуры дуплекса позволяют MBD4cat различать модифицированные и немодифицированные основания в процессе скольжения по двойной спирали ДНК.
Интересно, что фаза роста интенсивности флуоресценции остатков Тгр (10-100 с), совпадающая с начальным накоплением продукта реакции, не приводит к изменению FRET-сигнала. Однако скорость-лимитирующая стадия диссоциации комплекса фермента с продуктом реакции вызывает медленный рост FRET-сигнала в интервале времени 100-3000 с, а также приводит к медленному накоплению продуктов реакции (рис. 6).
Интенсивность флуоресценции аРи при связывании ДНК-дуплексов, содержащих урацил (иаРи17) и F-сайт ^аРи12), изменяется разнонаправленно (рост и падение соответственно) и в разные промежутки времени ^ < 0.1 с и 0.1 с < t < 1 с соответственно). Фазу роста интенсивности флуоресценции аРи для иаРи17-субстрата, отражающую локальное плавление дуплекса при образовании первичного комплекса, невозможно зарегистрировать в случае FaPu12-лиганда, поскольку расположенный с 3'-сто-роны от F-сайта остаток аРи уже находится в менее гидрофобном окружении, чем в канонической ДНК. Однако при взаимодействии MBD4cat с FaPu12-лигандом наблюдается хорошо выраженное уменьшение интенсивности флуоресценции аРи на более поздних временах (до 1 с). Уменьшение интенсивности флуоресценции аРи, связанное с увеличением гидрофобности окружения остатка аРи, скорее всего свидетельствует о встраивании аминокислотных остатков MBD4cat (А^468 и Leu508) в дуплекс на этих временах.
ОБСУЖДЕНИЕ
Опираясь на данные рентгеноструктурного анализа [11, 12], можно предположить, что при взаимодействии MBD4cat с ДНК в начальный момент времени образуется первичный комплекс, в котором аминокислотные остатки образуют систему неспецифических контактов с рибозофосфатным остовом, позволяющую ферменту за счет тепловых движений двигаться вдоль двойной спирали в поиске поврежденного нуклеоти-да. Известно, что поиск ферментами специфических сайтов в молекуле ДНК происходит путем сочетания одномерной (Ш) и трехмерной (3D) диффузии: без диссоциации фермент-субстратного комплекса за счет «скольжения» фермента и небольших «прыжков» по цепи ДНК, и путем множественных актов диссоциации-ассоциации соответственно [21, 23]. Длина участков Ш-диффузии отличается у разных ДНК-гликозилаз. Показано, что урацил-ДНК-гликозилаза UNG между актами диссоциации способна пере-
мещаться на длину, примерно соответствующую четырем нуклеотидам [27]. У 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы hOGGl это расстояние может составлять от 60 [28] до 400 [29] нуклеотидов. ДНК-гликозилазы Fpg, Nei, Nth и hOGGl [30-32] в процессе поиска поврежденного участка в молекуле ДНК используют некоторые остатки в качестве детекторов поврежденного участка ДНК. Если в ДНК-связывающем центре фермента оказывается модифицированный нуклео-тид, то это приводит к формированию специфических контактов, выворачиванию этого нуклеотида из ДНК-дуплекса, встраиванию модифицированного основания в активный центр фермента и перемещению аминокислотных остатков-детекторов в образовавшуюся полость в ДНК-дуплексе. Такие конформационные перестройки не позволяют ферменту смещаться со специфического сайта на ДНК и заканчиваются формированием каталитически компетентного комплекса. Интересно отметить, что фермент MBD4cat, относящийся вместе с hOGG1 и Nth к структурному семейству ДНК-гликозилаз с мотивом HhH, также встраивает Arg468 и Leu508 в ДНК-дуплекс при образовании каталитического комплекса. Поэтому, эти аминокислотные остатки могут выполнять функцию детекторов в процессе поиска поврежденного нуклеотида.
Сравнение кривых кинетики флуоресценции для 12-, 17- и 28-звенных ДНК-субстратов свидетельствует о том, что с увеличением длины дуплекса происходит замедление фазы уменьшения интенсивности флуоресценции Trp, характеризующей поиск модифицированного основания в процессе скольжения или перепрыгивания MBD4cat по цепи ДНК. С использованием флуоресцентно меченных UaPu17-и FAM-U-BHQl-субстратов показано, что в первичном комплексе происходят изгибание ДНК-дуплекса и его локальное плавление. В последующий момент времени поврежденный нуклеотид выворачивается из дуплекса, и аминокислотные остатки фермента встраиваются в образовавшуюся полость. Результаты, полученные с использованием флуоресцентно меченного аналога продукта реакции FaPu12, показывают, что встраивание Arg468 и Leu508 в ДНК-дуплекс предшествует фазе роста интенсивности флуоресценции Trp. Встраивание аминокислотных остатков в ДНК обеспечивает специфическое узнавание модифицированного основания. Фаза роста интенсивности флуоресценции Trp характеризует образование каталитически-активного комплекса и во всех случаях заканчивается к 100-200 с, что совпадает с начальным скачком накопления продуктов реакции. Диссоциация комплекса фермента с продуктом реакции является скоростьлимитирующей стадией всего процесса. Наблюдаемая скорость каталитической реакции заметно увеличивается с увели-
чением длины дуплекса. Это указывает на возможное участие соседних с модифицированным основанием неповрежденных участков ДНК в формировании правильно ориентированной и активной конформа-ции MBD4cat.
Таким образом, впервые в режиме реального времени зарегистрированы конформационные переходы в ферменте MBD4 и ДНК-субстратах в ходе их взаимодействия, установлен кинетический механизм, рассчитаны константы скорости образования и распада промежуточных фермент-субстратных комплексов и определена природа взаимных кон-
формационных перестроек в процессе узнавания повреждения и его удаления.
Работа поддержана программой РАН «Молекулярная и клеточная биология» (№ 6.11), грантами РФФИ (№ 16-04-00037 О.С.Ф., № 15-04-00467 К.А.А., № 15-34-20121 Н.А.К.). За счет средств гранта РНФ № 16-14-10038 выполнен предстационарный кинетический анализ взаимодействия фермента MBD4cat с ДНК-субстратами.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Zheng G., Fu Y., He C. // Chem. Rev. 2014. V. 114. P. 4602-4620.
2. Sjolund A.B., Senejani A.G., Sweasy J.B. // Mutat. Res. 2013. V. 743-744. P. 12-25.
3. Friedberg E.C., Walker G.C., Siede W., Wood R.D., Schultz R.A., Ellenberger T. DNA Repair and Mutagenesis. Washington: ASM Press, 2006. P. 1161.
4. Barnes D.E., Lindahl T. // Annu. Rev. Genet. 2004. V. 38. P. 445-476.
5. Gros L., Saparbaev M.K., Laval J. // Oncogene. 2002. V. 21. P. 8905-8925.
6. Zhang W., Liu Z., Crombet L., Amaya M.F., Liu Y., Zhang X., Kuang W., Ma P., Niu L., Qi C. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2011. V. 412. P. 425-428.
7. Hashimoto H., Zhang X., Cheng X. // Nucl. Acids Res. 2012. V. 40. P. 8276-8284.
8. Hill P.W., Amouroux R., Hajkova P. // Genomics. 2014. V. 104. P. 324-333.
9. Turner D.P., Cortellino S., Schupp J.E., Caretti E., Loh T., Kinsella T.J., Bellacosa A. // Cancer Res. 2006. V. 66. P. 7686-7693.
10. Petronzelli F., Riccio A., Markham G.D., Seeholzer S.H., Genuardi M., Karbowski M., Yeung A.T., Matsumoto Y., Bellacosa A. // J. Cell Physiol. 2000. V. 185. P. 473-480.
11. Morera S., Grin I., Vigouroux A., Couve S., Henriot V., Saparbaev M., Ishchenko A.A. // Nucl. Acids Res. 2012. V. 40. P. 9917-9926.
12. Manvilla B.A., Maiti A., Begley M.C., Toth E.A., Drohat A.C. // J. Mol. Biol. 2012. V. 420. P. 164-175.
13. Petronzelli F., Riccio A., Markham G.D., Seeholzer S.H., Stoerker J., Genuardi M., Yeung A.T., Matsumoto Y., Bellacosa A. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 32422-32429.
14. Kuznetsova A.A., Kuznetsov N.A., Ishchenko A.A., Saparbaev M.K., Fedorova O.S. // Biochim. Biophys. Acta. 2014. V. 1840. P. 3042-3051.
15. Gill S.C., von Hippel P.H. // Anal. Biochem. 1989. V. 182. P. 319-326.
16. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Lab., 1989. P. 1626.
17. Kuzmic P. // Anal. Biochem. 1996. V. 237. P. 260-273.
18. Kuznetsov N.A., Koval V.V., Zharkov D.O., Vorobiev Y.N., Nevinsky G.A., Douglas K.T., Fedorova O.S. // Biochemistry. 2007. V. 46. P. 424-435.
19. Koval V.V., Kuznetsov N.A., Ishchenko A.A., Saparbaev M.K., Fedorova O.S. // Mutat. Res. 2010. V. 685. P. 3-10.
20. Kuznetsov N.A., Vorobjev Y.N., Krasnoperov L.N., Fedorova O.S. // Nucl. Acids Res. 2012. V. 40. P. 7384-7392.
21. Halford S.E., Szczelkun M.D. // Eur. Biophys. J. 2002. V. 31. P. 257-267.
22. Friedman J.I., Stivers J.T. // Biochemistry. 2010. V. 49. P. 4957-4967.
23. Lee A.J., Warshaw D.M., Wallace S.S. // DNA Repair (Amst.). 2014. V. 20. P. 23-31.
24. Jean J.M., Hall K.B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 37-41.
25. Rachofsky E.L., Osman R., Ross J.B.A. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 946-956.
26. Kuznetsov N.A., Kladova O.A., Kuznetsova A.A., Ishchenko A.A., Saparbaev M.K., Zharkov D.O., Fedorova O.S. // J. Biol. Chem. 2015. V. 290. P. 14338-14349.
27. Schonhoft J.D., Stivers J.T. // Nat. Chem. Biol. 2012. V. 8. P. 205-210.
28. Rowland M.M., Schonhoft J.D., McKibbin P.L., David S.S., Stivers J.T. // Nucl. Acids Res. 2014. V. 42. P. 9295-9303.
29. Blainey P.C., van Oijen A.M., Banerjee A., Verdine G.L., Xie X.S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 5752-5757.
30. Kuznetsov N.A., Bergonzo C., Campbell A.J., Li H., Mechetin G.V., de los Santos C., Grollman A.P., Fedorova O.S., Zharkov D.O., Simmerling C. // Nucl. Acids Res. 2015. V. 43. P. 272-281.
31. Nelson S.R., Dunn A.R., Kathe S.D., Warshaw D.M., Wallace S.S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014. V. 111. P. E2091-2099.
32. Kuznetsova A.A., Kuznetsov N.A., Ishchenko A.A., Saparbaev M.K., Fedorova O.S. // Biochim. Biophys. Acta. 2014. V. 1840. P. 387-395.
