CC BY
51
УДК 577.15:544.3
Термодинамика конформационных переходов АР-эндонуклеазы человека APE1 при взаимодействии с ДНК
А. Д. Мирошникова1, А. А. Кузнецова1, Н. А. Кузнецов1,2*, О. С. Федорова1,2* 1Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 8
2Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2 *E-mail: [email protected], [email protected] Поступила в редакцию 01.07.2015 Принята к печати 12.11.2015
РЕФЕРАТ Одной из актуальных задач в изучении репарации ДНК остается выяснение механизма ферментативного процесса с участием эндонуклеазы APE1, который обеспечивает высокоточное узнавание апуриновых/апиримидиновых (АР) сайтов в ДНК и эффективный гидролиз 5'-фосфодиэфирной связи, играя тем самым важную роль в обеспечении стабильного функционирования ДНК и жизнедеятельности клетки. В настоящей работе проведен термодинамический анализ взаимодействия APE1 с ДНК-субстратом, содержащим аналог АР-сайта, у которого отсутствует OH-группа в положении С1' 2'-дезоксирибозы (F-сайт). Методом «остановленного потока» с регистрацией изменений интенсивности флуоресценции белка при разных температурах проведен анализ кинетики образования фермент-субстратных комплексов, каталитической стадии и диссоциации комплекса фермента с продуктом реакции. Рассчитаны изменения стандартной свободной энергии Гиббса, энтальпии и энтропии последовательных стадий ферментативного процесса, а также образования переходного состояния в каталитической стадии. Полученные данные позволили предположить, что на первой стадии процесса происходят образование контактов между ДНК-связывающим центром фермента и ДНК-субстратом, встраивание остатков Arg177 и Met270 в большую и малую бороздки ДНК соответственно и вытеснение из бороздок «кристаллической» воды. На второй стадии происходят выворачивание F-сайта в активный центр фермента и образование специфических контактов с 2'-дезоксирибозой и 5'-фосфатной группой. Показано, что основной вклад в термодинамические параметры процесса диссоциации комплекса фермент-продукт вносят неспецифические взаимодействия между ДНК-связывающим центром и рибозофосфатным остовом ДНК-дуплекса.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА апуриновый/апиримидиновый сайт, АР-эндонуклеаза человека, кинетический механизм, предстационарная кинетика, термодинамика.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АР-сайт - апуриновый/апиримидиновый сайт; APE1 - АР-эндонуклеаза человека; ЭРО - эксцизионная репарация оснований; F-сайт - остаток (2К,3£)-2-(гидроксиметил)-3-гидрокситетрагидрофурана.
ВВЕДЕНИЕ
Одними из наиболее часто встречающихся повреждений ДНК являются апуриновые/апиримидино-вые сайты (АР-сайты) [1, 2], которые образуются в ДНК при спонтанном или катализируемом ДНК-гликозилазами гидролизе ^гликозидных связей [3]. Ежедневно в каждой клетке организма человека может возникать до 10 000 АР-сайтов. Высокая мутагенность АР-сайтов связана как с отсутствием кодирующего азотистого основания, так и с их повышенной способностью вызывать одноцепочечные разрывы рибозофосфатного остова ДНК.
Ключевой фермент системы эксцизионной репарации оснований (ЭРО) - апуриновая/апиримиди-
новая эндонуклеаза человека АРЕ1 - отвечает за поиск и инициирование процесса удаления АР-сайтов из ДНК [4, 5]. Основной физиологической функцией фермента является гидролиз фосфодиэфирной связи в ДНК с 5'-стороны от АР-сайта, в результате чего происходит разрыв рибозофосфатного остова с образованием фрагментов цепи, содержащих 3'-гидрок-сильную группу и 2'-дезоксирибозо-5'-фосфат [6, 7].
Анализ кристаллических структур свободного фермента АРЕ1 [8-10] и его ковалентных комплексов с ДНК [11-13] показал, что для осуществления катализа в комплексе АРЕ1-ДНК образуются контакты, которые приводят к выворачиванию АР-сайта из двойной спирали. На рис. 1 представлена
Lys276
1^п222, Щ— ^п226,
\Trp280
Asn229
^!и96, 1УГ171, Asn174, Asp210, Asn212, Asp308, His309
[ТуМ28, ^^156, 1^181
Lys78
Ala74
Arg73, С!у127
Рис. 1. Схема контактов, образующихся в фермент-субстратном комплексе APE1 с ДНК, содержащей F-сайт (PDB ID 1DE8 [11])
схема контактов в фермент-субстратном комплексе АРЕ1 с ДНК, содержащей F-сайт, у которого отсутствует ОН-группа в положении С1' дезоксирибозы (PDB ГО ГОЕ8). Видно, что аминокислотные остатки фермента взаимодействуют преимущественно с одной цепью дуплекса, как правило, с образованием водородных связей и электростатических контактов между фосфатными группами ДНК и боковыми радикалами аминокислот, а также с амидными группами пептидных связей белка. Активный центр фермента образован остатками Asp308, His309, Glu96, Asp210, Туг171, Asn212 и Asn174. Стабилизация внеспираль-ной конформации АР-сайта осуществляется остатками Ме1270 и Arg177. Ме1270 встраивается в малую бороздку ДНК, тем самым вытесняя основание, расположенное напротив АР-сайта. Остаток А^177 встраивается со стороны большой бороздки ДНК и образует водородную связь с фосфатной группой, расположенной с 3'-стороны от АР-сайта. В фермент-субстратном комплексе, находящемся в каталитически компетентном состоянии, остаток фосфата, расположенный с 5'-стороны от АР-сайта, координирован остатками Asn174, Asn212 и His309. Каталитическая реакция начинается с нуклеофильной атаки молекулы воды, координированной прямо или опосредованно через ион Mg2+ остатком Asp210 [11, 13], по 5'-фосфатной группе.
Ранее методом «остановленного потока» с регистрацией изменения интенсивности флуоресценции остатков триптофана [14, 15], входящих в состав фермента, и 2-аминопурина [16], расположенного с 3'- или 5'-стороны от АР-сайта, был установлен кинетический механизм взаимодействия АРЕ1 с ДНК-субстратами (схема). В качестве субстратов использовали ДНК-дуплексы, содержащие натив-ный АР-сайт или его аналог ^-сайт) без ОН-группы в положении С1' дезоксирибозы. Показано, что взаимодействие АРЕ1 с субстратами включает, как минимум, две стадии связывания ДНК и узнавания АР-сайта, которые приводят к образованию каталитически компетентного комплекса. В этом комплексе происходит необратимая стадия каталитического гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи АР-сайта. Последняя стадия кинетического механизма характеризует равновесный процесс диссоциации комплекса фермента с продуктом реакции.
Схема. Кинетический механизм взаимодействия АРЕ1 с ДНК-субстратом
К
Е + 8:
дат
к.
Е-?:
,
где Е - фермент, S - субстрат, и (E•S)2 - ком-
плексы фермента с субстратом, Р - продукт превращения субстрата, Е-Р - комплекс фермента с продуктом, к. и к . - константы скорости прямых и обратных реакций равновесных стадий, кса1 - константа скорости каталитической стадии, Кр - равновесная константа диссоциации комплекса Е-Р.
Следует отметить, что согласно рентгеноструктур-ным данным связывание ДНК приводит лишь к незначительным структурным перестройкам АРЕ1 (рис. 2). Сравнение структуры свободного АРЕ1 (PDB ГО 4LND) и комплекса АРЕ1 с ДНК, содержащей F-сайт (PDB ГО ГОЕ8), показывает, что один из семи остатков триптофана молекулы фермента, Тгр280, расположен в ДНК-связывающем центре фермента и образует водородную связь с фосфатной группой ДНК. Таким образом, наблюдаемые изменения флуоресценции Тгр, скорее всего, характеризуют конфор-мационные изменения фермента в области Тгр280.
Цель нашей работы состояла в определении термодинамических параметров конформационных перестроек АРЕ1 при специфическом узнавании поврежденного участка ДНК и осуществлении каталитической стадии ферментативной реакции в условиях эксцизионной репарации оснований с использованием кинетических данных ферментативного процесса, полученных для различных температур. Использованный подход позволил определить термодинамические параметры стадий образования каталитически активной формы фермента, включая
Рис. 2. Сравнение структуры свободного АРЕ1 (розовый, PDB Ю 4LND) и комплекса АРЕ1 с ДНК, содержащей F-сайт (фиолетовый, PDB ID 1DE8)
промежуточный фермент-субстратный комплекс, в отличие от данных [17], полученных ранее для неактивной формы АРЕ1.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Олигодезоксирибонуклеотиды
Олигонуклеотиды очищали с помощью ВЭЖХ на ионообменной колонке (PRP-X500 Hamilton Company 3.9 х 300 mm particle size 12-30 ^m) и последующей обращенно-фазовой хроматографии (Nucleoprep 100-20 C18 10 х 250 mm, Macherey-Nagel, Германия). Чистоту олигонуклеотидов проверяли с помощью денатурирующего электрофореза в 20% полиакри-ламидном геле (ПААГ). Концентрацию олигонукле-отидов измеряли по оптической плотности растворов на длине волны 260 нм в электронных спектрах поглощения и рассчитывали по закону Бугера-Ламберта-Бера, исходя из коэффициентов молярной экстинкции, определенных в приближении метода «ближайших соседей» [18]. ДНК-субстрат фермента APE1 (F-субстрат) представлял собой 17-звенный дуплекс, состоящий из дезоксирибоолигонуклеоти-дов
5'-TCTCTCTCFCCTTCCTT-3' и 3-AGAGAGAGGGGAAGGAA-5'.
Фермент APE1
Фермент АРЕ1 был выделен из линии клеток Escherichia coli Rosetta 2, трансформированных плазмидой pET11a, несущей ген AP-эндонуклеазы человека. Культуру клеток E. coli Rosetta 2 выращивали в среде LB (1 л), содержащей 50 мкг/мл ампициллина, при температуре 37°С до оптической плотности 0.6-0.7 при длине волны 600 нм. После этого температуру понижали до 20°С и индуцировали транскрипцию добавлением изопропил-ß-D-тиогалактопиранозида до 0.2 мМ. После индукции культуру клеток инкубировали в течение 16 ч. Затем клетки осаждали центрифугированием (10 мин, 12000 об/мин) и готовили суспензию клеток в 30 мл буферного раствора I (20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.8), содержащего 40 мМ NaCl. Клетки лизировали при помощи френч-пресса. Все последующие процедуры проводили при 4°С. Лизат клеток центрифугировали (40 мин при 30 000 об/мин), супернатант наносили на колонку I (Q-Sepharose Fast Flow, Amersham Biosciences, Швеция) и промывали буферным раствором I (20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.8), содержащим 40 мМ NaCl. Фракции, содержащие белок APE1, собирали и наносили на колонку II (HiTrap-Heparin™, Amersham Biosciences, Швеция). Хроматографию проводили в буферном растворе I и линейном градиенте 40 ^ 600 мМ NaCl, оптическую плотность раствора регистрировали на длине волны 280 нм. Степень чистоты белка APE1 определяли с помощью гель-электрофореза. Фракции, содержащие белок APE1, диализовали в буфере 20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.5, 1 мМ EDTA, 1 мМ дитиотреит, 250 мМ NaCl, 50% глицерин и хранили при -20°С. Концентрацию фермента рассчитывали из значений оптической плотности белка на длине волны 280 нм и коэффициента молярной экстинкции 56818 М-1см-1 [19].
Кинетические исследования методом «остановленного потока»
Кинетические кривые флуоресценции регистрировали с использованием спектрометра остановленной струи SX.20 (Applied Photophysics, Великобритания). Длина волны возбуждения флуоресценции составляла 290 нм. Флуоресценцию регистрировали на длинах волн более 320 нм (Schott filter WG 320). Поскольку молекула АРЕ1 содержит семь остатков Trp и 11 остатков Tyr, то в использованных условиях регистрации интенсивность флуоресценции белка более чем на 90% определялась остатками Trp. «Мертвое» время прибора составляло 1.1 мс, максимальное время регистрации сигнала равно 200 с. Все экспе-
рименты выполняли в буферном растворе, соответствующем условиям ЭРО: 50 мМ трис-HCl, pH 7.5, 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреит, 7% глицерин при 10-37°С. Каждую кинетическую кривую усредняли, как минимум, по трем экспериментальным кривым.
Анализ степени гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи в АР-сайте
Для получения зависимостей степени гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи в АР-сайте от времени смешивали растворы фермента и меченного 32P субстрата. Метку вводили по 5'-концу F-содержащего олигонуклеотида с помощью Т4-полинуклеотидкиназы («СибЭнзим», Новосибирск) и [y-32P]ATP («Биосан», Новосибирск) согласно [20, 21]. Далее из реакционной смеси отбирали аликво-ты объемом 2 мкл, которые помещали в предварительно подготовленные пробирки, содержащие 3 мкл раствора 7 М мочевины, 0.1% бромфенолового синего и 0.1% ксиленцианола FF. Электрофорез в ПААГ проводили при напряжении 50 В/см. Гель радиоав-тографировали на рентгеновскую пленку Agfa CP-BU New (Agfa-Geveart, Бельгия) в течение 12-60 ч при -20°С.
Анализ кинетических кривых
Для расчета констант скорости конформационных переходов получали набор кинетических кривых для разных концентраций субстрата при разных температурах. Регистрацию проводили в условиях, близких к «одному обороту фермента», т.е. при концентрациях фермента и субстрата одного порядка. Для определения минимальной кинетической схемы, описывающей взаимодействие фермента с субстратом, и расчета констант скорости всех элементарных стадий данной схемы использовали программу DynaFit (BioKin, США) [22]. Количественную обработку результатов экспериментов проводили путем оптимизации значений параметров, входящих в кинетические схемы, как описано ранее [23-25].
Используя полученные значения констант скорости отдельных стадий, рассчитывали константы равновесия (К) этих стадий (k./к ., где i - номер стадии) при разных температурах. Стандартные термодинамические параметры i-й равновесной стадии определяли с помощью уравнения Вант-Гоффа (1) [26, 27]
ln(K) = -AG./RT = -AH./RT + AS/R.
(1)
Зависимости 1п(К.) от 1/Т имели линейный вид. Анализ температурной зависимости константы скорости химической реакции k по уравнению
Эйринга (2) позволил рассчитать стандартную энтальпию активации (^Н*) и стандартную энтропию активации переходного состояния [26]
Ь(кса1/Т) = Ь(к,А) + (ЛЗ°,*/К) - ИН^/ИТ), (2)
где кв и h — постоянные Больцмана и Планка соответственно, И - газовая постоянная, Т - абсолютная температура в градусах Кельвина.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для уточнения природы процессов, происходящих на последовательных стадиях узнавания F-сайта в ДНК-субстрате, катализа и диссоциации комплекса фермента с продуктом, был выполнен постадийный термодинамический анализ взаимодействия АРЕ1 с F-субстратом. Методом «остановленного потока» с регистрацией интенсивности флуоресценции остатков Тгр в АРЕ1 получены кинетические кривые, характеризующие взаимодействие АРЕ1 с 17-звенным F-субстратом в условиях одного оборота фермента при температуре от 10 до 37°С (рис. 3). Видно, что взаимодействие АРЕ1 с F-субстратом приводит к многофазным изменениям интенсивности флуоресценции Тгр. Согласно полученным ранее данным [14, 15], уменьшение интенсивности флуоресценции на начальном участке кинетических кривых характеризует образование каталитически компетентного комплекса. Каталитическая стадия процесса, приводящая к образованию продуктов и последующей диссоциации комплекса фермент-продукт, сопровождается увеличением интенсивности флуоресценции Тгр на более поздних временах (начиная примерно от 1 с). Как видно из кинетических кривых (рис. 4), обе фазы изменения интенсивности флуоресценции зависят от температуры.
Анализ кинетических кривых изменения интенсивности флуоресценции белка показал, что минимальный кинетический механизм взаимодействия АРЕ1 с ДНК-субстратом, содержащим в качестве повреждения F-сайт, включает двухстадийное равновесное связывание, необратимое образование комплекса фермент-продукт и равновесную диссоциацию этого комплекса, который, как и ранее [1416], описывается схемой.
Константы скорости прямых и обратных реакций, характеризующие взаимодействие АРЕ1 с ДНК-субстратом при разных температурах, рассчитывали методом нелинейной регрессии, включающим численное интегрирование дифференциальных уравнений, соответствующих схеме, как описано ранее [28, 29]. Используя полученные константы скорости, определяли константы равновесия К и ^ (табл. 1).
л
Т = 10°С [АРЕ1] = 1.0 мкМ ^-субстрат], мкМ Б Т = 15°С [АРЕ1] :
1.0 мкМ ^-субстрат], мкМ
0.5
В Т = 20°С [АРЕ1]
3.0-
Время, с : 1.0 мкМ
[F-субстрат], мкМ Г Т = 25°С [АРЕ1] :
1 10 Время, с
1.0 мкМ ^-субстрат], мкМ
Д
0.5 * 2.4"
1.0 е
£ 2 3-
1.5 ь о
2.0 т с £1
о н 2.2-
2.5 в и
и и
с н е ц 1 2 1-
т н ц
X с е
а 2.0-
о
у
л
«*1.9-
Т = 30°С [АРЕ1] :
Время, с 1.0 мкМ
^-субстрат], мкМ
Е Т = 37°С [АРЕ1] :
1 10 Время, с
1.0 мкМ ^-субстрат], мкМ
Время, с
1 10 Время, с
Рис. 3. Экспериментальные кинетические кривые, характеризующие конформационные изменения АРЕ1 при взаимодействии с F-субстратом при 10°С (А), 15°С (Б), 20°С (В), 25°С (Г), 30°С (Д) и 37°С (Е), и расчетные кривые, полученные путем обработки данных согласно схеме. [АРЕ1] = 1.0 мкМ, концентрация F-субстрата варьирует в диапазоне от 0.5 до 2.5 мкМ
Таблица 1. Константы скорости отдельных стадий взаимодействия АРЕ1 с F-субстратом в условиях ЭРО и константы диссоциации комплекса фермент-продукт
^^\Температура Константа 10°С 15°С 20°С 25°С 30°С 37°С
k1, М-1с-1 (5.1 ± 2.1) х 106 (16.0 ± 3.4) х 106 (46.0 ± 12.0) х 106 (100 ± 12) х 106 (190 ± 32) х 106 (520 ± 20) х 106
к, с-1 3.3 ± 0.4 7.3 ± 3.6 12.0 ± 5.1 11.0 ± 2.5 19.0 ± 5.2 47.0 ± 13.0
KM 0.65 х 10-6 0.47 х 10-6 0.26 х 10-6 0.11 х 10-6 0.10 х 10-6 0.09 х 10-6
к2, с-1 4.2 ± 2.6 3.7 ± 1.2 8.2 ± 3.9 8.8 ± 4.4 15.0 ± 1.8 24.0 ± 9.0
к-2, с-1 5.7 ± 1.9 5.5 ± 2.9 19.0 ± 3.7 27.0 ± 4.2 40.0 ± 6.6 93.0 ± 17.4
K2 1.27 0.51 0.68 0.81 0.79 0.52
с-1 1.4 ± 0.6 2.0 ± 0.7 2.5 ± 1.2 4.6 ± 2.2 6.6 ± 2.2 9.2 ± 1.0
K , M p' (13.5 ± 3.9) х 10-6 (10.6 ± 1.9) х 10-6 (7.2 ± 1.8) х 10-6 (6.6 ± 2.3) х 10-6 (6.9 ± 1.2) х 10-6 (4.2 ± 0.6) х 10-6
*Константы равновесия для стадий связывания рассчитаны по формуле К. = к/к.. Таблица 2. Термодинамические параметры взаимодействия АРЕ1 с F-субстратом
~ -—________ Параметр Стадия (номер) ——_____ AG°i 298, ккал/моль AH°i, ккал/моль A5°i, кал/(моль х К)
Первичное связывание ДНК (1) -9.2 14.3 ± 2.2 79.0 ± 7.6
Специфическое узнавание F-сайта (2) 0.5 -6.8 ± 1.2 -24.6 ± 4.0
1=2 Суммарное значение параметров для стадий связывания ^ г=1 -8.7 7.5 ± 3.4 54.4 ± 11.7
Переходное состояние каталитической стадии (3) 16.6 12.2 ± 0.8 -14.8 ± 2.8
Образование комплекса фермент-продукт (4) -7.0 6.8 ± 1.0 46.6 ± 3.5
Как показано на рис. 5, зависимости 1п(К.) и 1п(к /Т) от 1/Т имеют линейный вид, что позволяет рассчитать термодинамические параметры равновесных стадий по уравнению Вант-Гоффа (1) и параметры переходного состояния каталитической стадии по уравнению Эйринга (2) (табл. 2).
Согласно полученным данным, образование первичного фермент-субстратного комплекса (первая стадия в схеме) характеризуется положительным значением стандартной энтальпии (14.3 ккал/моль) и положительным значением энтропии (79.0 кал/(моль х К)). Известно, что увеличение энтропии при взаимодействии ДНК-связывающих белков с ДНК, как правило, обусловлено двумя факторами: десольватацией полярных групп в области контакта белок-ДНК [30] и вытеснением высокоупо-рядоченных «кристаллических» молекул воды из бороздок ДНК [31]. Можно предположить, что на этой стадии происходит образование связей между аминокислотными остатками ДНК-связывающего центра и ДНК-дуплексом. Среди них можно отметить взаимодействие между фосфатными группами ДНК-дуплекса с 5'- и 3'-стороны от F-сайта и остатками А^73, А1а74, Lys78, Тгр280, Asn222, Asn226 и Asn229 (рис. 1). Кроме того, в этот момент времени, вероятно, происходят встраивание остатка А^177 в ДНК-
[APE1] = 1.0 мкМ [F-субстрат] = 2.0 мкМ
0.01 0.1 1 10 100 Время, с
Рис. 4. Изменения интенсивности флуоресценции Trp в процессе взаимодействия APE1 и F-субстрата при различных температурах. [APE1] = 1.0 мкМ, [ДНК] = 2.0 мкМ
дуплекс со стороны большой бороздки и образование водородной связи с фосфатной группой, расположенной с З'-стороны от F-сайта. Остаток Ме1270 встраивается в ДНК-дуплекс со стороны малой бороздки и также может вытеснять «кристаллическую» воду.
л
(ES)! (E-P)
-3.5-
--1-
3.20 3.25 3.30 3.35 3.40 3.45 3.50 3.55 1/ГХ103, K-1
Рис. 5. Зависимости ln(K.) (А) и ln(k ,/Т) (Б) от 1/Т
-г-1--т-г---т-г---I--г--т-г-|-г--т-т-т-,
3.20 3.25 3.30 3.35 3.40 3.45 3.50 3.55
1/ГХ103, K-
Б
Ранее, на примере ДНК-гликозилаз Fpg E. coli [28] и hOGGl человека [29], принадлежащих к разным структурным классам и, как следствие, образующих с ДНК отличающиеся по своей природе контакты, было показано, что стадии образования фермент-субстратного комплекса и его изомеризации в каталитически компетентное состояние характеризуются значительным ростом энтропии, также, по-видимому, вызванному десольватацией взаимодействующих поверхностей белка и ДНК.
Вторая стадия взаимодействия APE1 c F-субстратом, представляющая собой специфическую перегруппировку комплекса (E-S)p характеризуется отрицательным значением изменения как энтальпии (ДН°2 = -6.8 ккал/моль), так и энтропии (-24.6 кал/(мольХК)). Отрицательное значение ДН°2 свидетельствует о стабилизации комплекса при образовании новых, энергетически выгодных связей между взаимодействующими атомами, а отрицательное значение ДS°2 - об увеличении его жесткости, т.е. об уменьшении внутренних степеней свободы. Эта стадия, по-видимому, включает процесс выворачивания F-сайта в активный центр фермента и стабилизации этого состояния с помощью остатков Arg177 и Met270, которые встраиваются в большую и малую бороздки ДНК соответственно. Кроме того, в этот момент происходит, вероятно, образование связей между фосфатной группой, расположенной в 5'-направ-лении от F-сайта (рис. 1), остатками Asn174, Asn212 и His309 и ионом Mg2+, расположенными в активном центре фермента.
Для третьей, каталитической, стадии были рассчитаны значения энтальпии (ДН") и энтропии (Д£*) активации процесса образования переходного комплек-
са. Полученное значение энтальпии активации равно 12.2 ккал/моль. Необходимо отметить, что это значение относится к стадии гидролиза фосфодиэфирной связи ферментом АРЕ1 и лежит в диапазоне величин 6.0-18.6 ккал/моль, полученных ранее для каталитических стадий реакций разрыва М-гликозидной связи и Р-элиминирования фосфатных групп, осуществляемых ДНК-гликозилазами Fpg и hOGG1 [28, 29].
Термодинамические параметры образования комплексов АРЕ1 с АР-содержащей ДНК были определены ранее методом SPR, т.е. в гетерофазных условиях, для каталитически неактивной формы фермента в отсутствие ионов Mg2+ [17]. Использованный же нами подход [28, 29] позволяет получать термодинамические данные для процессов, протекающих в водном растворе, т.е. в гомофазных условиях, с участием каталитически активных форм ферментов, в том числе короткоживущих фермент-субстратных промежуточных комплексов.
Интересно отметить, что термодинамические параметры стадии образования комплекса фермента с продуктом реакции коррелируют с параметрами образования первичного комплекса. Как и первая стадия, этот процесс характеризуется положительными значениями изменений стандартных значений энтальпии и энтропии (6.8 ккал/моль и 46.6 кал/(мольХК) соответственно). Это свидетельствует о том, что основной вклад в термодинамические параметры этой стадии вносят те же взаимодействия, которые происходят на первой стадии связывания АРЕ1 с ДНК-субстратом - неспецифические контакты между ДНК-связывающим центром и рибозофосфатным остовом ДНК-дуплекса. Однако комплекс фермента с продуктом Е-Р можно
считать истинным неспецифическим комплексом, тогда как образование первичного комплекса (E-S)1 в случае короткого ДНК-субстрата включает некоторые элементы специфического узнавания F-сайта. Поэтому образование комплекса (E-S)1 по сравнению с комплексом E-Р энергетически более выгодно (AAG°298 = -2.2 ккал/моль, AAH° = 7.5 ккал/моль, ДД£° = 32.4 кал/(мольХК)).
Таким образом, нами получены термодинамические параметры конформационных перестроек фермента АРЕ1 в процессе специфического узнавания поврежденного участка ДНК и осуществления ка-
талитической стадии, которые позволили сделать вывод о молекулярной природе отдельных стадий кинетического механизма, описывающего функционирование фермента. •
Работа поддержана ФАНО, грантом РАН 6.11 по программе «Молекулярная и клеточная биология», грантом ведущих научных школ НШ-7564.2016.4, грантами РФФИ № 16-0400037, 15-34-20121 и 15-04-00467. Часть работы, включающая анализ экспериментальных данных, поддержана грантом РНФ № 14-14-00063.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Lindahl T. // Nature. 1993. V. 362. P. 709-715.
2. Wilson III D.M., Barsky D. // Mutat. Res. 2001. V. 485. P. 283-307.
3. Friedberg E.C., Walker G.C., Siede W., Wood R.D., Schultz R.A., Ellenberger T. DNA Repair and Mutagenesis. Washington: ASM Press, 2006.
4. Mol C.D., Parikh S.S., Putnam C.D., Lo T.P., Tainer J.A. // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1999. V. 28. P. 101-128.
5. David S.S., Williams S.D. // Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 12211261.
6. Demple B., Sung J.-S. // DNA Repair (Amst.). 2005. V. 4. P. 1442-1449.
7. Dyrkheeva N.S., Khodyreva S.N., Lavrik O.I. // Mol. Biol. (Mosk.). 2007. V. 41. P. 450-466.
8. Gorman M.A., Morera S., Rothwell D.G., de La Fortelle E., Mol
C.D., Tainer J.A., Hickson I.D., Freemont P.S. // EMBO J. 1997. V. 16. P. 6548-6558.
9. Beernink P.T., Segelke B.W., Hadi M.Z., Erzberger J.P., Wilson
D.M., 3rd, Rupp B. // J. Mol. Biol. 2001. V. 307. P. 1023-1034.
10. Manvilla B.A., Pozharski E., Toth E.A., Drohat A.C. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2013. V. 69. P. 2555-2562.
11. Mol C.D., Izumi T., Mitra S., Tainer J.A. // Nature. 2000. V. 403. P. 451-456.
12. Mol C.D., Hosfield D.J., Tainer J.A. // Mutat. Res. 2000. V. 460. P. 211-229.
13. Tsutakawa S.E., Shin D.S., Mol C.D., Izumi T., Arvai A.S., Mantha A.K., Szczesny B., Ivanov I.N., Hosfield D.J., Maiti B., et al. // J. Biol. Chem. 2013. V. 288. P. 8445-8455.
14. Timofeyeva N.A., Koval V.V., Knorre D.G., Zharkov D.O., Saparbaev M.K., Ishchenko A.A., Fedorova O.S. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2009. V. 26. P. 637-652.
15. Kanazhevskaya L.Y., Koval V.V., Zharkov D.O., Strauss P.R., Fedorova O.S. // Biochemistry. 2010. V. 49. P. 6451-6461.
16. Kanazhevskaya L.Y., Koval V.V., Vorobjev Y.N., Fedorova
O.S. // Biochemistry. 2012. V. 51. P. 1306-1321.
17. Adhikari S., Uren A., Roy R. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 1334-1339.
18. Fasman G.D. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 3ed. Cleveland: CRC Press, 1975.
19. Gill S.C., von Hippel P.H. // Anal. Biochem. 1989. V. 182. P. 319-326.
20. Kuznetsov N.A., Koval V.V., Zharkov D.O., Fedorova O.S. // DNA Repair (Amst.). 2012. V. 11. P. 884-891.
21. Kuznetsov N.A., Zharkov D.O., Koval V.V., Buckle M., Fedorova O.S. // Biochemistry. 2009. V. 48. P. 11335-11343.
22. Kuzmic P. // Anal. Biochem. 1996. V. 237. P. 260-273.
23. Kuznetsov N.A., Koval V.V., Nevinsky G.A., Douglas K.T., Zharkov D.O., Fedorova O.S. // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. P. 1029-1038.
24. Kuznetsov N.A., Koval V.V., Zharkov D.O., Vorobiev Y.N., Nevinsky G.A., Douglas K.T., Fedorova O.S. // Biochemistry. 2007. V. 46. P. 424-435.
25. Koval V.V., Kuznetsov N.A., Ishchenko A.A., Saparbaev M.K., Fedorova O.S. // Mutat. Res. 2010. V. 685. P. 3-10.
26. Atkins P., Paula J., Atkins' Physical Chemistry. 8th Edition. N.Y.: Oxford Univ. Press, 2006.
27. Ragone R., Colonna G., Ambrosone L. // J. Phys. Chem. 1995. V. 99. P. 13050-13050.
28. Kuznetsov N.A., Vorobjev Y.N., Krasnoperov L.N., Fedorova O.S. // Nucl. Acids Res. 2012. V. 40. P. 7384-7392.
29. Kuznetsov N.A., Kuznetsova A.A., Vorobjev Y.N., Krasnoperov L.N., Fedorova O.S. // PLoS One. 2014. V. 9. P. e98495.
30. Jen-Jacobson L., Engler L.E., Jacobson L.A. // Structure. 2000. V. 8. P. 1015-1023.
31. Privalov P.L., Dragan A.I., Crane-Robinson C. // Nucl. Acids Res. 2011. V. 39. P. 2483-2491.
