CC BY
30
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.151.45:578.287
Консенсусная интеграза нового генетического варианта CRF63_02A1 ВИЧ-1
Ю. Ю. Агапкина1,2, М. А. Пустоварова1,2, С. П. Королев1,2, Д. П. Зырянова3, В. В. Ивлев3, А. В. Тотменин3, Н. М. Гашникова3, М. Б. Готтих1,2*
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991, Москва, Ленинские горы 1, стр. 3
2Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы 1, стр. 40
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора,
630559, Кольцово Новосибирской обл.
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 12.10.2018
Принята к печати 21.01.2019
РЕФЕРАТ Высокая генетическая изменчивость вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) приводит к постоянному появлению новых генетических вариантов, к числу которых относится рекомбинантный вирус CRF63_02A1, широко распространенный на территории Сибирского федерального округа России. Нами изучена интеграза CRF63_02A1 ВИЧ-1, катализирующая встраивание вирусной ДНК в геном инфицированной клетки. Проведен дизайн консенсусной последовательности, получен препарат рекомбинантной ин-тегразы и охарактеризована ее ДНК-связывающая и каталитическая активность. Стабильность комплекса интегразы CRF63_02A1 с ДНК-субстратом такая же, как у комплексов интеграз подтипов А и В, однако скорость его образования существенно выше. Более высокими оказались скорости и эффективности реакций, катализируемых этой интегразой: З'-процессинга и переноса цепи. Это может быть связано с характерными для интегразы CRF63_02A1 аминокислотными заменами в N-концевом домене, играющем важную роль в мультимеризации фермента и его связывании с ДНК-субстратом. Установлено также, что мутации лекарственной устойчивости Q148K/G140S и G118R/E138K существенно снижают каталитическую активность интегразы CRF63_02A1 и ее чувствительность к ингибитору интеграции ралтегравиру. При этом наиболее сильное снижение чувствительности обеспечивает двойная мутация Q148K/G140S.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА вирус иммунодефицита человека, генетический вариант CRF63_02A1, интеграза, ингибитор переноса цепи, мутации лекарственной устойчивости.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека типа 1; ИН - интеграза; ИН_CRF - консенсусная интеграза генетического варианта CRF63_02A1 ВИЧ-1; ИН_А - консенсусная интеграза подтипа А ВИЧ-1 штамма FSU-A; ИН_В - интеграза подтипа В ВИЧ-1 штамма HXB-2; CRF - циркулирующие рекомбинантные формы ВИЧ-1; URF - уникальные рекомбинантные формы ВИЧ-1; IC50 - концентрация ингибитора, подавляющая активность фермента на 50%; FC - изменение величины IC50 мутантных белков по сравнению с диким типом; ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; ДСН -додецилсульфат натрия; ПААГ - полиакриламидный гель; DTT - дитиотреитол.
ВВЕДЕНИЕ
Вирус иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) обладает высокой генетической изменчивостью, что приводит к существованию различных его подтипов, циркулирующих рекомбинантных форм (СRF) и уникальных рекомбинантных форм (URF) [1]. Широкое разнообразие генетических вариантов ВИЧ-1 формируется за счет высокой скорости
репликации, склонности к рекомбинации и ошибок в работе обратной транскриптазы [2-4]. Различные подтипы ВИЧ-1 имеют определенное географическое распределение. На территории бывшего СССР преобладает подтип А [5, 6], но присутствуют и различные СRF [7-9]. С 2010-2012 гг. на территориях страны с наибольшими темпами развития эпидемии - Кемеровской, Новосибирской, Томской обла-
стей, Алтайского края - доминирует генетический вариант CRF63_02A1 [10-12], который из-за своего быстрого распространения нуждается в углубленном изучении.
Важным этапом исследования новой формы вируса является характеристика его ферментов, один из которых - интеграза (ИН), катализирует встраивание вирусной ДНК в геном зараженной клетки [13]. В клинической практике используют три ингибитора ИН: ралтегравир, элвитегравир и долутегравир [14], к которым, однако, развивается устойчивость вируса [15, 16]. Известно, что как мутации лекарственной устойчивости, так и механизмы их возникновения у вирусов разных подтипов могут различаться [1722]. В этой связи актуально изучение влияния естественного полиморфизма ИН на ее свойства.
В настоящей работе охарактеризована ИН генетического варианта CRF63_02A1 ВИЧ-1 ^^CRF) и проведено ее сравнение с ИН ВИЧ-1 подтипа А (ИН_А), также широко распространенного на территории России. Работа включает изучение влияния структурных различий между ферментами на их ДНК-связывающую и каталитическую активность. Изучено также влияние мутаций устойчивости к применяемым на практике ингибиторам интеграции на каталитическую и ДНК-связывающую активности ИН_CRF, а также на ее чувствительность к ингибитору ралтегравиру.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Дизайн консенсусной последовательности M^CRF
Подтип ВИЧ-1 определяли с использованием филогенетического, рекомбинационного анализа как описано ранее [10, 11, 23]. Консенсусная последовательность ИН создана с использованием программного обеспечения BioEdit (Ibis Biosciences, США).
РНК ВИЧ-1 выделяли с использованием набора РеалБест ДельтаМаг ВГВ/ВГС/ВИЧ (АО «Вектор-Бест», Россия) из 250 мкл двух клинических образцов плазмы крови пациентов, инфицированных вирусом, у которого ген ИН имеет максимальное сходство с рассчитанной консенсусной нуклеотидной последовательностью гена ИН_CRF. Кодирующие ИН фрагменты ДНК размером 878 п.н., дополненные сайтами рестрикции для последующего клонирования, получали с помощью ОТ-ПЦР, используя коммерческий набор LongRange 2Step RT-PCR (Qiagen, США).
Получение вектора для экспрессии ИН_CRF
Фрагменты ДНК, кодирующие ИН_CRF, встраивали в плазмиду pCR_2.1Topo с использованием коммерческого набора TOPO® TA Cloning® Kit
(pCR™2.1-TOPO®, Thermo Fisher Scientific Inc., США). Плазмидную ДНК из плазмид pCR_2.1Topo_ ИН, по 30 мкг для каждого образца ВИЧ-1, выделяли с помощью коммерческого набора Plasmid Purification Mini Kit (Qiagen, США). По результатам секвенирования гена ИН выбрана плазмида pCR_2.1Topo_ИН_CRF*, содержащая последовательность ИН, отличающуюся от консенсусной двумя аминокислотными заменами, для субклонирования в экспрессирующий вектор pET_15b, в структуру которого включен гистидиновый таг (His-tag) (Novagen, США).
Вектор pET_15b_ИН_CRF с консенсусной последовательностью ИН_CRF получали, последовательно вводя мутации, приводящие к аминокислотным заменам I32V и I259V в вектор pET-15b_ИН_CRF*. Конструкции, кодирующие ИН с заменами Q148K/G140S и G118R/E138K, получали сайт-направленным мутагенезом плазми-ды pET_15b_ИН_CRF с использованием набора QuikChange II Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent Technologies, США).
Плазмида pET_15b, содержащая ген консенсусной ИН_А, любезно предоставлена М.Г. Беликовой-Исагулянц (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, Россия).
Получение рекомбинантных белков
Препараты белков ИН_А и ИН_CRF с консен-сусными последовательностями и с мутациями Q148K/G140S и G118R/E138K выделяли из клеток штамма-продуцента Rosetta (DE3) Escherichia coli и очищали согласно [24, 25]. Белки анализировали методом электрофореза в 12% ПААГ по Лэммли с последующим окрашиванием SimplyBlueTM SafeStain (Invitrogen, США).
Олигодезоксирибонуклеотиды
Олигодезоксирибонуклеотиды U5B (5'-GTGTGGA-AAATCTCTAGCAGT-3'), U5B с остатком флу-оресцеина на 5'-конце (5'-Fl-U5B), U5B-2 (5'-GTGTGGAAAATCTCTAGCA-3') и U5A (5'-ACTGCTAGAGATTTTCCACAC-3'), формирующие ДНК-субстраты ИН, и все праймеры («ДНК-синтез», Россия).
Радиоактивную 32Р-метку вводили на 5'-конец олигонуклеотидов U5B и U5B-2 и формировали ДНК-субстраты ИН как описано в [25].
Анализ ДНК-связывающей активности интегразы
Изучение скорости связывания ИН с ДНК-субстратом методом поляризации флуоресценции проводили на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian, США) по методике [26]. Дуплекс 5'-Fl-
U5B/U5A (10 нМ) смешивали с 100 нМ ИН в 200 мкл буфера А (20 мМ HEPES (pH 7.2), 10 мМ DTT, 7.5 мМ MgCl2) и измеряли значения поляризации флуоресценции флуоресцеина (X = 492 нм, к = 520 нм) через определенные промежутки времени при 25°С. Строили кривую зависимости изменения поляризации флуоресценции от времени и определяли константу скорости связывания (k ) ИН с субстратом согласно уравнению [IN/DNA] = [DNA]0 х (1 - e-kon>t) [27].
Определение Kd комплекса ИН с субстратом проводили методом DRaCALA (Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay) [28]. Дуплекс 5'-32P-U5B/U5A (5 нМ) инкубировали с ИН в концентрации от 0 до 500 нМ в 10 мкл буфера А в течение 20 мин при 25°С. По 5 мкл смеси наносили на нитро-целлюлозную мембрану Amersham™ HybondTM-ECL. Мембрану визуализировали на приборе Typhoon FLA 9500 PhosphorImager (Molecular Dynamics, США).
Определение каталитической активности интегразы
Для реакции З'-концевого процессинга 5 нМ дуплекс 5'-32P-U5B/U5A инкубировали со 100 нМ ИН в буфере А как описано в [25]. ДНК осаждали и анализировали электрофорезом в 20% денатурирующем ПААГ. Гель визуализировали на приборе Typhoon FLA 9500 PhosphorImager (Molecular Dynamics, США). По соотношению интенсивностей излучения полос, соответствующих U5B и U5B-2, определяли эффективность процессинга с использованием программы Quantity One 4.6.6. (Bio-Rad Laboratories, США).
При анализе кинетики накопления продуктов З'-процессинга реакционную смесь инкубировали при 37°С от 5 мин до 7 ч, строили графики зависимости эффективности реакции от времени, определяли начальную скорость реакции по углу наклона начального участка кривой (~60 мин).
Зависимость эффективности З'-процессинга от концентрации субстрата определяли, варьируя концентрацию ДНК (0; 2.5; 4; 10; 20; 50; 100 нМ). Строили графики зависимости эффективности реакции от концентрации субстрата, определяли максимальную скорость реакции (V ) и константу Михаэлиса (KM).
Для реакции переноса цепи 10 нМ ДНК-дуплекс [5'-32P]-U5B-2/U5A инкубировали со 100 нМ ИН в буфере А в течение 2 и 4 ч при 37°С. Выделение и анализ продуктов реакции проводили как описано выше.
Ингибирование переноса цепи
Реакцию переноса цепи проводили как описано выше в течение 2 ч в присутствии возрастающих
концентраций ингибитора (ралтегравир, Santa Cruz Biotechnology Inc., США). По результатам трех независимых экспериментов определяли значение IC.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Дизайн консенсусной последовательности MH_CRF и получение белка
Последовательности гена ИН получены из 324 образцов ВИЧ-1, выделенных на территориях Сибирского (250) и Уральского (74) федеральных округов России от ВИЧ-инфицированных, не получавших антире-тровирусную терапию. Филогенетический анализ показал, что выборка вирусных последовательностей, включенных в исследование, содержала генетические варианты подтипов А (24.3%) и В (3.3%), а также рекомбинантные формы CRF63_02A1 (55.3%) и различные URF, образованные в результате вторичной рекомбинации вирусов CRF63_02A1 и подтипа А (6.7%).
Проведено множественное выравнивание идентифицированных нуклеотидных последовательностей ИН_CRF, трансляция, построение аминокислотной консенсусной последовательности и ее выравнивание с последовательностями ИН подтипов А и В (рис. 1). Обнаружены мутации, характерные для этого ге-новарианта вируса: E11D (в 93.8% случаев), K14R (81.3%), S24N (100%) и M50I (75%). Замена L74I, специфичная для ИН_А, найдена лишь в 4% случаев ИН_CRF.
Среди исследованных последовательностей ВИЧ-1 отобран вариант, последовательность ИН у которого максимально близка к консенсусной ИН_CRF ВИЧ-1. Наработка целевого фрагмента ДНК ИН_CRF и последовательные клонирования позволили получить экспрессирующий вектор pET-^b^H^^RF*, введение замен I32V и I259V в который привело к получению вектора pET-^b^M^^RF с консенсусной последовательностью ИН. На его основе получены конструкции, содержащие мутации лекарственной устойчивости, - G118R/E138K и Q148K/G140S. Полученные векторы использовались для прокарио-тической экспрессии белков с последующей очисткой на Ni-NTA-агарозе. Степень чистоты полученных препаратов ИН не менее 90% (рис. 2).
Характеристика ДНК-связывающей активности MH_CRF
Ретровирусные интегразы в процессе функционирования связываются с концами вирусной ДНК, а затем взаимодействуют с клеточной ДНК, причем последнее взаимодействие не является специфичным к последовательности [29]. Рекомбинантная ИН ВИЧ-1 обычно имеет одинаковое сродство к ДНК-дуплексам
ИН_CRF63_02A1
ИН_А
ИН В
ИН_CRF63_02A1
ИН_А
ИН_В
ИН_CRF63_02A1
ИН_А
ИН_В
ИН_CRF63_02A1
ИН_А
ИН_В
ИН_CRF63_02A1
ИН_А
ИН_В
FLDGIDKAQE FLEGIDKAQE FLDGIDKAQE
HGQVDCSPGI HGQVDCSPGI HGQVDCSPGI
11 14
DHERYHSNWR EHEKYHSNWK EHEKYHSNWR N
WQLDCTHLEG WQLDCTHLEG WQLDCTHLEG
i] 3 119
CRF63_02A1 LLKLAGRWPV KVVHTDN G PN
А LLKLAGRWPV KVVHTDN G PN
В LLKLAGRWPV KTVHTDN G SN
24 32
AMANDFNLPP IVAKEIVASC AMASDFNLPP IVAKEIVASC AMASDFNLPP VVAKEIVASC концевой домен
72
KIILVAVHVA SGYIEAEVIP KVIIVAVHVA SGYIEAEVIP KVILVAVHVA SGYIEAEVIP
138 н
FTSSAVKAAC WWANIQQÍ:ElG FTSSAVKAAC WWAMIQQEFG FTSTTVKAAC WWAGIKQEínG
DKCQLKGEAI DKCQLKGEAM DKCQLKGEAM
AETGQETAYF
AETGQETAYF AETGQETAYF
0 148
IPYNPQS IPYNPQS IPYNPQS
QGV QGV QGV
VESMNKELKK IIGQVRDQAE HLKTAVQMAV FIHNFKRKGG IGGYSAGERI VESMNKELKK IIGQVREQAE HLKTAVQMAV FIHHFKRKGG IGGYSAGERI IESMNKELKK IIGQVRDQAE HLKTAVQMAV FIHNFKRKGG IGGYSAGERI
IDIIATDIQT IDIIATDIQT VDIIATDIQT
259
IQDNNDIKVV IQDNNDIKVV IQDNSDIKVV
KELQKQITKI QHFRVYYRDS RDPIWKGPAK LLWKGEGAVV KELQKQIIKI QHFRVYYRDS RDPIWKGPAK LLWKGEGAVV KELQKQITKI QNFRVYYRDS RDPVWKGPAK LLWKGEGAVV
PRRKAKIIRD YGKQMAGDDC VASRQDED PRRKAKIIRD YGKQMAGDDC VASRQDED PRRKAKIIRD YGKQMAGDDC VASRQDED
Рис. 1. Аминокислотные последовательности ИН_CRF, ИН_А и ИН_В. Аминокислотные остатки, характерные для ИН_CRF, выделены жирным шрифтом и подчеркнуты, для других подтипов подчеркнуты; прямоугольниками показаны аминокислоты, мутации которых приводят к появлению лекарственной устойчивости вируса, красным цветом - аминокислоты каталитического домена
разной структуры [30]. Мы оценивали способность ИН_CRF связывать 21-звенный ДНК-субстрат, представляющий собой концевую последовательность участка U5 LTR вирусной ДНК. Параллельно проводили эксперименты с ИН_А.
Стабильность комплексов определяли методом DRaCALA (Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay) [28], ранее успешно использованным для характеристики комплексов ИН_В с ДНК [31]. Значения Kd комплексов ИН/ДНК оказались сравнимыми в случае ИН_CRF и ИН_А (рис. 3A и табл. 1), а также ИН_В [32].
Кинетику связывания ИН с субстратом изучали с помощью метода поляризации флуоресценции. В качестве ДНК-субстрата использовали флуоресцентно меченный дуплекс 5'-Fl-U5B/U5A. Скорость связывания ДНК у ИН_CRF оказалась выше, чем у ИН_А, константы скорости связывания (к ) у них различались в 2.8 раза (рис. 3Б и табл. 1). При этом константа скорости связывания k для ИН_А (0.24 мин-1) близка к значению, полученному ранее для ИН_В (0.18 мин-1) [27].
Последовательности ИН подтипов А и В ВИЧ-1 отличаются 16 аминокислотными остатками, из которых 11 находятся в каталитическом, два - в С-концевом и три - в N-концевом домене, причем последние три замены синонимичные: D3E, R20K, V31I (рис. 1). ИН_CRF отличается от ИН_А
MW, кДа
250
170
130 mm
100 mm
70 mm
55 —
35 mm
25 mm
15
Рис. 2. Разделение препаратов консенсусной ИН_CRF и ее мутантных форм G118R/E138K и Q148K/G140S электрофорезом в ДСН-ПААГ по Лэммли. 1 - ИН_CRF; 2 - ИН_А; 3 - ИН_CRF ^1^/Е138К); 4 - ИН_CRF ^148К^140Б); MW - маркер молекулярных масс
и ИН_В 4 уникальными аминокислотными заменами Е1Ш, K14R, S24N и М501 в ^концевом домене (рис. 1). Учитывая, что скорости связывания ДНК-субстрата с ИН_А и ИН_В сравнимы, а с ИН_CRF существенно различаются, можно предположить,
2
3
4
[ИН], нМ
Время, мин
Рис. 3. Сравнение ДНК-связывающих активностей ИН_CRF и ИН_А. Приведены средние значения как минимум трех независимых измерений, при которых стандартное отклонение не превышало 15%. А - зависимость концентрации комплекса ИН/ДНК-субстрат от концентрации ИН. Б — кинетика изменения поляризации флуоресценции ДНК-субстрата при связывании сИН CRFиИН А
что на эту скорость влияет главным образом структура N-концевого домена ИН. Этот домен определяет мультимерное состояние ИН, важное для ее каталитической активности [33], и участвует в связывании ИН с ДНК-субстратом (вирусной ДНК) [3436]. В структуре ИН_CRF в первую очередь обращают на себя внимание замены S24N и M50I. Наличие амидной группы в Asn и разветвленной цепи Ile может влиять на межсубъединичные взаимодействия при образовании каталитически активного состояния ИН. Помимо этого, К14 непосредственно контактирует с вирусной ДНК и играет важную роль в процессе мультимеризации ИН [35, 37]. В ИН_CRF в положении 14 вместо Lys находится Arg. Хотя обе эти аминокислоты положительно заряжены, остаток Arg более объемный, менее гидрофобный и обладает более высоким pKa, чем Lys [38, 39]. Для Arg также характерна делокализация положительного заряда
Таблица 1. ДНК-связывающая и каталитическая активности ИН CRFиИН А
Характеристика ИН_А
Kd, нМ d' 23±6 25±7
k , мин-1* on' 0.69±0.09 0.24±0.02
Относительная эффективность З'-процессинга, %** 100 71
V0 (З'-процессинг), пмоль/мин* 19.3±2.1 9.8±2.3
V , пМ/мин* max' ' 26±1 16±1
Km, нМ* 2.6±0.3 4.6±0.8
Vmax/KMXl0^ мин-1* 10±1 3.5±0.6
Относительная эффективность переноса цепи, %** 100 77
V0 (перенос цепи), пмоль/мин* 11.4±3.2 6.5±2.8
Примечание. Приведены средние значения как минимум трех независимых измерений со стандартным отклонением. *Р < 0.05.
"Эффективность реакции через 300 мин относительно эффективности реакции для консенсусной ИН_CRF, принятой за 100%.
по гуанидиновой группировке и возможность образования множественных водородных связей в разных направлениях [40, 41], что может способствовать связыванию ДНК-субстрата.
Таким образом, аминокислотные замены, в силу природного полиморфизма присущие ИН_CRF, не сказываются на стабильности ее комплекса с ДНК-субстратом, но при этом существенно влияют на скорость его образования.
Характеристика каталитической активности ИН_CRF
В процессе репликации вируса ИН осуществляет две последовательные реакции: З'-концевой процессинг, при котором происходит отщепление динуклеотида GT с З'-концов вирусной ДНК, и перенос цепи, который заключается во встраивании процессированной вирусной ДНК в клеточную ДНК. Обе эти реакции можно имитировать in vitro по стандартным методикам [25]. Для проведения реакции З'-процессинга в качестве аналога вирусной ДНК использован стандартный дуплекс [5'-32P]-U5B/U5A, радиоактивно меченный по 5'-концу процессируемой цепи U5B, которая в результате реакции превращалась в продукт, укороченный на два нуклеотида. В реакции переноса цепи в качестве и субстрата, и мишени использовался дуплекс [5'-32P]-U5B-2/U5A, в котором
ь
т
с а
о г
н в н и
и с
т с
к е
е ц
ф ф о р п
-3'
40
20
Л
— ИН_CRF63_02A1 -ИН А
100 200 300 Время, мин
400
Рис. 4. Зависимость эффективности реакции 3'-про-цессинга, катализируемой ИН_СкР и ИН_А, от времени. Приведены средние значения как минимум трех независимых измерений, при которых стандартное отклонение не превышало 15%
ИН_CRF63_02A1 ИН_А
I-
200
т
300
1
400
Время, мин
- ИН ИН С1*Р63 02А1 ИН А
300 360 мин мин
300 360 мин мин
0
0
Б
цепь и5В уже была укорочена на два нуклеотида (и5В-2).
Изучение кинетики З'-процессинга показало, что ИН_CRF эффективнее и быстрее процессирует свой субстрат, чем ИН_А (рис. 4, табл. 1). С целью более детального выяснения причин увеличения эффективности реакции были определены кинетические параметры реакции З'-процессинга: Км и
Оказалось, что Км для ИН_CRF в 1.8 раза ниже, а V в 1.6 раза выше, чем для ИН_А (табл. 1). Следовательно, для ИН_CRF характерна более высокая скорость З'-процессинга, но достигается она при более низких значениях концентрации субстрата. Соответственно параметр каталитической эффективности ^^/К^) для ИН_CRF оказался почти втрое выше, чем для ИН_А (табл. 1). Мы полагаем, что столь высокая активность ИН_CRF не может объясняться только более высокой скоростью связывания субстрата (рис. 3), тем более что константы диссоциации комплексов с ДНК у обоих ферментов практически одинаковы. Как уже упоминалось ранее, ^концевой домен ИН отвечает за ее мультимерное состояние, которое изменяется при связывании ИН с ДНК-субстратом [42, 43], в результате чего формируется каталитически активный фермент-субстратный комплекс. Возможно, присутствующие в ^концевом домене ИН_CRF аминокислотные замены способствуют образованию такого комплекса, стимулируя тем самым более эффективное протекание реакции.
При изучении реакции переноса цепи определяли эффективность и скорость реакции, а также характер образуемых продуктов, отражающий место встраивания субстрата в ДНК-мишень.
Рис. 5. Характеристика реакции переноса цепи, катализируемой ИН_СкР и ИН_А. Л - кинетика реакции переноса цепи. Приведены средние значения как минимум трех независимых измерений, при которых стандартное отклонение не превышало 15%. Б - продукты реакции переноса цепи в случае ИН_СкР и ИН_А (электрофоретический анализ продуктов реакции через 300 и 360 мин)
Эффективность и скорость переноса цепи вновь оказались выше у ИН_CRF, а характер продуктов был одинаковым (рис. 5). ИН_А и ИН_В различались характером продуктов переноса цепи [25]. Разные профили продуктов этой реакции могут наблюдаться, если по-разному формируется комплекс ИН с ДНК-мишенью, в которую происходит встраивание субстрата. В связывании ДНК-мишени участвуют каталитический и особенно С-концевой домены ИН [36], которые у ИН_А и ИН_CRF имеют близкую структуру и существенно отличаются от ИН_В (рис. 1). Таким образом, в комплексе с ИН_CRF ДНК-мишень располагается аналогичным с ИН_А образом, но отличается от расположения в комплексе ДНК с ИН_В.
ТОМ 11 № 1 (40) 2019 | АСТА ЫАТиИАЕ | 19
Таблица 2. ДНК-связывающая и каталитическая активности, а также устойчивость к ралтегравиру ИН_CRF, ИН_А, их мутантных форм Q148K/G140S, G118R/E138K
Характеристика ИН CRF ИН А
консенсус Q148K/ G140S G118R/ E138K Консенсус Q148K/ G140S* G118R/ E138K
К нМ 2З±6 28±9 25±5 25±7 н.о. н.о.
У0 (З'-процессинг), пмоль/мин 19.З±2.1 2.7±0.4 5.6±1.2 9.8±2.З 2.6±0.1 2.6±0.4
Относительная эффективность З'-процессинга, % 100 22 З1 100 25 24
Относительная эффективность переноса цепи, % 100 27 22 100 20 2З
Ралтегравир 1С50, нМ 7±2 500±50 50±З 5±2 400±150 7±З
FC 1 71 7 1 80 1.4
Примечание. Приведены средние значения как минимум трех независимых измерений со стандартным отклонением. н.о. - значения не определялись. * По данным [25].
Влияние мутаций лекарственной устойчивости на активность ИН_CRF и ее чувствительность к ралтегравиру
Данные о мутациях, обеспечивающих его лекарственную устойчивость, изучаемого нами генетического варианта вируса отсутствуют, поэтому мы ввели в состав ИН мутации устойчивости к применяемым сегодня ингибиторам интеграции, известным для других подтипов ВИЧ-1. В качестве мутаций устойчивости к ралтегравиру и элвитегравиру были выбраны первичная мутация Q148K и компенсаторная к ней вторичная G140S [44, 45]. В случае до-лутегравира выбраны мутации G118R и Е138К [46, 47]. Получены варианты ИН_CRF, содержащие двойные замены Q148K/G140S и G118R/E138K (рис. 2), и исследована эффективность связывания ДНК-субстрата и зависимость эффективности З'-конце-вого процессинга от концентрации ИН и времени. Оказалось, что введенные мутации не влияли на стабильность фермент-субстратного комплекса, но существенно снижали каталитическую активность ферментов (табл. 2). При этом в случае ИН_CRF с заменами Q148K/G140S потеря активности была более существенной, чем у фермента с заменами G118R/E138K. Начальная скорость З'-процессинга для мутантных ИН снижалась в 7.1 и 3.4 раза соответственно по сравнению с исходным ферментом. Ранее было показано снижение каталитической активности ИН_А в реакции З'-процессинга при введении мутаций Q148K/G140S и G118R/E138K, однако оно было одинаковым для обеих пар мутаций (в З.8 раза) [25].
Замены Q148K/G140S и G118R/E138K существенно снижали и эффективность реакции переноса цепи, катализируемой ИН_CRF (табл. 2), как и в случае ИН_А [25]. Снижение было несколько сильнее в слу-
чае пары мутаций G118R/E138K, чем Q148K/G140S: в 4.6 и З.7 раза соответственно. Интересно, что в случае ИН_В замены G118R/E138K крайне незначительно влияли на эффективность переноса цепи [25]. Сильный отрицательный эффект этих мутаций в случае как ИН_CRF, так и ИН_А, связан, очевидно, с природным полиморфизмом S119P (рис. 1), приводящим к более жесткой конформации активного центра и сниженной способности обеих интеграз адаптироваться к мутации G118R. Возможно, именно жесткая конформация активного центра ограничивает способность ИН_CRF и ИН_А, несущих замены G118R/E138K, связывать ДНК-мишень, что выражается в резком уменьшении количества продуктов переноса цепи для мутантов G118R/E138K (рис. 6 и [25]). Мутации Q148K/G140S не вызывают изменений в характере продуктов этой реакции по сравнению с исходной ИН (рис. 6).
Мы также изучили чувствительность ИН_CRF и ее мутантов Q148K/G140S и G118R/E138K к ин-гибированию ралтегравиром, который применяется в терапии ВИЧ-инфицированных в Российской Федерации. Обнаружено, что ИН_CRF эффективно ингибируется ралтегравиром (табл. 2), значение 1С50 близко к значениям, полученным ранее для ИН_А и ИН_В [25]. Введение мутаций устойчивости Q148K/G140S, обнаруженных у других подтипов вируса, приводило к возникновению устойчивости и ИН_CRF. Мы наблюдали 70-кратное увеличение значения 1С , что согласуется с полученными ранее данными для ИН_А [25]. Мутации G118R/E138K также снижали чувствительность ИН_CRF к ралтегравиру, однако не так значительно ^С=7, табл. 2). Следует отметить, что в случае ИН_А с мутациями G118R/E138K практически не наблюдалось снижения чувствительности к ралтегравиру [25].
12 3 4
Рис. 6. Электрофоретический анализ продуктов реакции переноса цепи, катализируемой ИН_СкР (дорожка 2) и ее мутантами G118R/E138K (дорожка 3) и Q148K/G140S (дорожка 4) (время реакции 300 мин). Дорожка 1 - контроль без добавления ИН. Над гелем указана эффективность реакции
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данной работе впервые выделена и охарактеризована рекомбинантная ИН ВИЧ-1 нового генетического варианта CRF63_02A1, стремительно распространяющегося на территории Сибири. Установлено,
что ИН_CRF быстрее и эффективнее, чем ИН подтипа А, катализирует реакции З'-процессинга и переноса цепи. Очевидно, высокие скорости обеих реакций обеспечиваются как более быстрым связыванием ДНК-субстрата, так и более высокой каталитической эффективностью, характерными для ИН_CRF. По-видимому, все эти изменения объясняются аминокислотными заменами Е1Ш, K14R и S24N, М501, расположенными в ^концевом домене ИН_CRF, который играет важную роль в мультимеризации фермента и связывании вирусной ДНК. При этом из-за отсутствия значимых различий в каталитических и С-концевых доменах ИН_CRF и ИН_А набор продуктов переноса цепи, характеризующий способ позиционирования ДНК-мишени в активном центре фермент-субстратного комплекса, у этих ферментов не меняется.
Полученные результаты позволяют предположить, что устойчивость генетического варианта ВИЧ-1 CRF63_02A1 к применяемому ингибитору интеграции ралтегравиру в первую очередь может развиваться по пути возникновения мутаций Q148K/G140S, как это описано для других подтипов [48]. Введение этих мутаций в состав ИН_CRF привело к 70-кратному росту устойчивости к действию ингибитора по сравнению с исходным ферментом. Мутации G118R/E138K увеличивали устойчивость ИН_CRF к ралтегравиру всего в 7 раз. •
Работа поддержана Российским научным фондом (грант № 16-15-10238).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Foley B., Leitner T., Apetrei C., Hahn B., Mizrachi I., Mullins J., Rambaut A., Wolinsky S., Korber B. Theoretical Biology and Biophysics Group. Los Alamos: Los Alamos National Laboratory, 2013. https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/ HIV/CRFs/CRFs.html
2. Onafuwa-Nuga A., Telesnitsky A. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2009. V. 73. № 3. P. 451-480.
3. Li G., Piampongsant S., Faria N.R., Voet A., Pineda-Peña A.C., Khouri R., Lemey P., Vandamme A.M., Theys K. // Retrovirol-ogy. 2015. V. 12. P. 18.
4. Hemelaar J. // Trends Mol. Med. 2012. V. 18. № 3. Р. 182-192.
5. Diez-Fuertes F., Cabello M., Thompson M.M. // Infect. Genet. Evol. 2015. V. 33. P. 197-205.
6. Foley B.T., Leitner T., Paraskevis D., Peeters M. // Infect. Genet. Evol. 2016. V. 46. P. 150-158.
7. Bobkova M. // AIDS Rev. 2013. V. 15. № 4. Р. 204-212.
8. Baryshev P.B., Bogachev V.V., Gashnikova N.M. // Russia Arch. Virol. 2012. V. 157. № 12. P. 2335-2341.
9. Baryshev P.B., Bogachev V.V., Gashnikova N.M. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2014. V. 30. № 6. P. 592-597.
10. Gashnikova N.M., Bogachev V.V., Baryshev P.B., Totmenin A.V., Gashnikova M.P., Kazachinskaya A.G., Ismailova T.N.,
Stepanova S.A., Chernov A.S., Mikheev V.N. // Russia AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2015. V. 31. № 4. P. 456-460.
11. Gashnikova N.M., Zyryanova D.P., Astakhova E.M., Ivlev V.V., Gashnikova M.P., Moskaleva N.V., Aikin S.S., Bulatova T.N., Pustylnikov S.V., Bocharov E.F., Totmenin A.V. // Arch. Virol. 2017. V. 162. № 2. P. 379-390.
12. Kazennova E., Laga V., Lapovok I., Glushchenko N., Neshu-maev D., Vasilyev A., Bobkova M. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2014. V. 30. № 8. P. 742-752.
13. Krishnan L., Engelman A. // J. Biol. Chem. 2012. V. 287. № 49. P. 40858-40866.
14. Lennox J.L. // Curr. Opin. HIV AIDS. 2012. V. 7. № 5. P. 409-414.
15. Quashie P.K., Mesplede T., Wainberg M.A. // Curr. Opin Infect. Dis. 2013. V. 26. № 1. P. 43-49.
16. Anstett K., Brenner B., Mesplede T., Wainberg M.A. // Ret-rovirology. 2017. V. 14. № 1. P. 36.
17. Maiga I., Malet I., Soulie C., Derache A., Koita V., Amellal B., Tchertanov L., Delelis O., Morand-Joubert L., Mouscadet J.F., et al. // Antivir. Ther. 2009. V. 14. № 1. P. 123-129.
18. Brenner B.G., Lowe M., Moisi D., Hardy I., Gagnon S., Cha-rest H., Baril J.G., Wainberg M.A., Roger M. // J. Med. Virol. 2011. V. 83. № 5. P. 751-759.
19. Bar-Magen T., Donahue D.A., McDonough E.I., Kuhl B.D., Faltenbacher V.H., Xu H., Michaud V., Sloan R.D., Wainberg M.A. // AIDS. 2010. V. 24. № 14. P. 2171-2179.
20. Quashie P.K., Oliviera M., Veres T., Osman N., Han Y.S., Has-sounah S., Lie Y., Huang W., Mesplede T., Wainberg M.A. // J. Virol. 2015. V. 89. № 6. P. 3163-3175.
21. Depatureaux A., Mesplede T., Quashie P., Oliveira M., Moisi D., Brenner B., Wainberg M. // J. Int. AIDS Soc. 2014. V. 17. № 4. P. 19738.
22. Depatureaux A., Mesplede T., Quashie P., Oliveira M., Moisi D., Plantier J.C., Brenner B., Wainberg M.A. // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2015. V. 70. № 1. P. 9-15.
23. Gashnikova N.M., Astakhova E.M., Gashnikova M.P., Bocha-rov E.F., Petrova S.V., Pun'ko O.A., Popkov A.V., Totmenin A.V. // Biomed. Res. Int. 2016. V. 2016. Article ID 2496280.
24. Leh H., Brodin P., Bischerour J., Deprez E., Tauc P., Brochon J.C., LeCam E., Coulaud D., Auclair C., Mouscadet J.F. // Biochemistry. 2000. V. 39. № 31. P. 9285-9294.
25. Шадрина О.А., Зацепин Т.С., Агапкина Ю.Ю., Исагулянц М.Г., Готтих М.Б. // Acta Naturae. 2015. V. 7. № 1. P. 43-52.
26. Deprez E., Barbe S., Kolaski M., Leh H., Zouhiri F., Auclair C., Brochon J.C., Le Bret M., Mouscadet J.F. // Mol. Pharmacol. 2004. V. 65. № 1. P. 85-98.
27. Smolov M., Gottikh M., Tashlitskii V., Korolev
S., Demidyuk I., Brochon J.C., Mouscadet J.F., Deprez E. // FEBS J. 2006. V. 273. № 6. P. 1137-1151.
28. Donaldson G.P., Roelofs K.G., Luo Y., Sintim H.O., Lee V.T. // Nucl. Acids Res. 2012. V. 40. № 7. е48.
29. Khan E., Mack J.P., Katz R.A., Kulkosky J., Skalka A.M. // Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. № 4. P. 851-860.
30. Agapkina J., Smolov M., Barbe S., Zubin E., Zatsepin T., Deprez E., Le Bret M., Mouscadet J.-F., Gottikh M. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 17. P. 11530-11540.
31. Agapkina J., Yanvarev D., Anisenko A., Korolev S., Vep-säläinen J., Kochetkov S., Gottikh M. // Eur. J. Med. Chem. 2014. V. 73. P. 73-82.
32. Shadrina O., Krotova O., Agapkina J., Knyazhanskaya E., Korolev S., Starodubova E., Viklund A., Lukashov V., Magnani M., Medstrand P., et al. // Biochimie. 2014. V. 102. P. 92-101.
33. Zheng R., Jenkins T.M., Craigie R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. № 24. P. 13659-13664.
34. Lesbats P., Engelman A.N., Cherepanov P. // Chem. Rev. 2016. V. 116. № 20. P. 12730-12757.
35. Zhao Z., McKee C.J., Kessl J.J., Santos W.L., Daigle J.E., Engelman A., Verdine G., Kvaratskhelia M. // J. Biol. Chem. 2008. V. 29. № 283. № 9. P. 5632-5641.
36. Passos D.O., Li M., Yang R., Rebensburg S.V., Ghirlando R., Jeon Y., Shkriabai N., Kvaratskhelia M., Craigie R., Lyumkis
D. // Science. 2017. V. 355. № 6320. P. 89-92.
37. McKee C.J., Kessl J.J., Shkriabai N., Dar M.J., Engelman A., Kvaratskhelia M. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. № 46. P. 31802-31812.
38. Sokalingam S., Raghunathan G., Soundrarajan N., Lee S.G. // PLoS One. 2012. V. 7. № 7. e40410.
39. Mant C.T., Kovacs J.M., Kim H.M., Pollock D.D., Hodges R.S. // Biopolymers. 2009. V. 92. № 6. P. 573-595.
40. Dougherty D.A. // J. Nutr. 2007. V. 137. P. 1504S-1508S.
41. Chan D.I., Prenner E.J., Vogel H.J. // Biochim. Biophys. Acta. 2006. V. 1758. P. 1184-1202.
42. Deprez E., Tauc P., Leh H., Mouscadet J.F., Auclair C., Hawkins M.E., Brochon J.C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. № 18. P. 10090-10095.
43. Guiot E., Carayon K., Delelis O., Simon F., Tauc P., Zubin
E., Gottikh M., Mouscadet J.F., Brochon J.C., Deprez E. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 32. P. 22707-22719.
44. Malet I., Delelis O., Valantin M.A., Montes B., Soulie C., Wirden M., Tchertanov L., Peytavin G., Reynes J., Mouscadet J.-F., et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2008. V. 52. № 4. P. 1351-1358.
45. Nakahara K., Wakasa-Morimoto C., Kobayashi M., Miki S., Noshi T., Seki T., Kanamori-Koyama M., Kawauchi S., Suyama A., Fujishita T., et al. // Antiviral Res. 2009. V. 81. № 2. P. 141-146.
46. Quashie P.K., Mesplede T., Han Y.S., Veres T., Osman N., Hassounah S., Sloan R.D., Xu H.T., Wainberg M.A. // Antimicrob. Agents Chemother. 2013. V. 57. № 12. P. 6223-6235.
47. Wainberg M.A., Han Y.S. // J. Virus Erad. 2015. V. 1. № 1. P. 13-16.
48. Malet I., Gimferrer Arriaga L., Artese A., Costa G., Parrotta L., Alcaro S., Delelis O., Tmeizeh A., Katlama C., Valantin M.A. // J. Antimicrob. Chemother. 2014. V. 69. № 8. P. 2118-2122.
