CC BY
108
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 578.242.42/.44+578.282;578.11
Скрининг потенциальных ингибиторов/блокаторов репликации ВИЧ-1 с помощью безопасной лентивирусной системы in vitro
М. М. Прокофьева1*, П. В. Спирин1, Д. В. Январев1, А. В. Иванов1, М. С. Новиков2, О. А. Степанов1, М. Б. Готтих3, С. Н. Кочетков1, B. Fehse4, C. Stocking5, В. С. Прасолов1* Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32, Россия 2Волгоградский государственный медицинский университет, 400131, Волгоград, ул. Павших Борцов, 1, Россия
3Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119899, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40, Россия
4Research Department Cell and Gene Therapy, Department for Stem Cell Transplantation University Medical Center Hamburg-Eppendorf, D-20246, Hamburg, Martinistr., 52, Germany 5Heinrich-Pette-Institute for Experimental Virology and Immunology, D-20251, Hamburg, Martinistr., 52, Germany
*E-mail: m.prokofjeva@gmail.com, prassolov45@mail.ru Поступила в редакцию 08.07.2011 г.
реферат Разработка безопасных клеточных систем, позволяющих тестировать соединения, обладающие анти-ВИЧ-активностью, весьма важна для создания новых противовирусных препаратов. Нами детально охарактеризована разработанная ранее на основе лентивирусных векторов система (Prokofjeva et. al., Antiviral Therapy, в печати) для быстрого и полностью безопасного скрининга потенциальных ингибиторов репликации ВИЧ-1. Система позволяет проводить испытания ингибиторной активности соединений, действие которых направлено как на обратную транскриптазу и интегразу ВИЧ-1 дикого типа, так и на му-тантные ферменты, соответствующие лекарственно-устойчивым формам вируса. Получены результаты тестирования ряда известных препаратов, которые хорошо согласуются с опубликованными данными, а также вновь синтезированных соединений. Применение этой системы существенно расширяет возможности доклинических испытаний анти-ВИЧ-препаратов.
ключевые слова ВИЧ, лентивирусные векторы, псевдо-ВИЧ-1-частицы, нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ингибиторы интегразы. сПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВИЧ - вирус иммунодефицита человека; ОТ - обратная транскриптаза; ВВС -вирус везикулярного стоматита; eGFP - усиленный зеленый флуоресцентный белок; АЗТ - 3'-азидо-3'-дезокситимидин; ИД50 - концентрация ингибитора, при которой на 50% снижается уровень заражения.
введение
Вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), относящийся к роду лентивирусов семейства ретрови-русов, вызывает одно из широко распространенных и опасных для жизни человека заболеваний - синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), число ВИЧ-1-инфицированных к концу 2008 г. превысило 33 миллиона человек [1]. В Российской Федерации по официальным данным на 2010 г. количество инфицированных ВИЧ-1 достигло 520000
человек [2]. Следует отметить, что реальное число инфицированных может быть в 2-3 раза больше. Из прогнозов ВОЗ и неправительственных организаций следует, что даже при выполнении всех инициатив по контролю за распространением СПИДа и применению анти-ВИЧ-терапии число ВИЧ-1-инфицированных в ближайшие несколько лет может превысить 48 миллионов.
Несмотря на огромные усилия, до сих пор не создано ни одной действенной профилактической или терапевтической анти-ВИЧ-1-вакцины. Единственным
терапевтическим подходом при ВИЧ-инфекции остается использование низкомолекулярных ингибиторов разных стадий репликативного цикла вируса. К настоящему моменту создано около 30 соединений различной структуры, утвержденных в качестве лекарственных средств. Большинство из них - ингибиторы трех ферментов ВИЧ-1: обратной транскриптазы (ОТ), интегразы и протеазы, а в последние годы добавились и так называемые ингибиторы слияния - бло-каторы проникновения вируса в клетку [3]. Одновременное применение нескольких соединений разного типа в рамках высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) позволяет достигать относительно длительного и заметного снижения титра вируса в крови и, как следствие, существенно продлевать жизнь больного [4, 5]. Тем не менее использование всех этих соединений имеет несколько ограничений. Во-первых, пожизненное носительство вирусной инфекции делает необходимым многолетний прием лекарственных средств, при котором возникают новые мутантные формы вируса, устойчивые к используемым препаратам и способные распространяться в популяции. Это уже привело к тому, что в США и Европе примерно у 10% больных, никогда не принимавших антиретровирусные средства, выявляют формы вируса, невосприимчивые к одному или даже ко всем перечисленным выше классам анти-ВИЧ-1-препаратов [6]. Во-вторых, необходимость длительной терапии часто ставит на первый план возможное побочное действие противовирусных средств [7, 8]. Таким образом, поиск новых соединений, обладающих анти-ВИЧ-1-активностью, представляет крайне важную задачу современной вирусологии и медицинской химии. При этом необходимо создавать новые, относительно безопасные для больного соединения, активные в отношении как вируса дикого типа, так и его лекарственно-устойчивых форм.
Важный этап разработки новых антиретровирус-ных средств - проверка их эффективности. Большинство лабораторий, занятых поиском новых анти-ВИЧ-соединений, не имеют возможности работать непосредственно с инфекционным репликативно-компетентным вирусом. Такого рода исследования, включающие контакт персонала с природным вирусом, могут проводиться только в сертифицированных лабораториях в условиях, гарантирующих безопасность работы персонала и имеющих разрешение на работу с инфекционными материалами третьего класса опасности. В связи с этим разработка и использование безопасных клеточных систем для тестирования противовирусной активности весьма важны для создания новых лекарственных средств. Особый интерес для быстрого и полностью безопасного скрининга потенциальных ингибиторов
репликации ВИЧ-1 представляют лентивирусные векторы, функциональная эффективность которых проявляется в результате активности всех ферментов ВИЧ-1.
Векторы на основе простых и сложных ретро-вирусов уже начиная с первой половины 80-х годов прошлого столетия интенсивно использовались как мощные универсальные инструменты, в том числе для создания эффективных систем переноса, экспрессии различных генов и интерферирующих РНК в клетках человека и животных как in vitro, так и in vivo [9-13].
Лентивирусные векторы использовались в нашей и других лабораториях для создания безопасных систем скрининга ингибиторов репликации ВИЧ-1 дикого типа [14-18]. Такие системы представляют собой рекомбинантный лентивирус, несущий фрагмент генома ВИЧ-1 без областей, кодирующих белки вируса, и содержащий ген репортерного (маркерного) белка (например, зеленого флуоресцентного белка). Кроме того, в состав псевдовирусных частиц входят ферменты репликации ВИЧ-1 (обратная транскриптаза, интеграза и протеаза), что обеспечивает возможность синтеза ДНК-копии такого генома и его встраивание в геном клетки-хозяина по тому же механизму, что и у инфекционного ВИЧ-1. Существенно, что такие псевдо-ВИЧ-1-частицы могут нести, по желанию исследователей, на своей поверхности белки оболочки ВИЧ-1 или других оболочечных вирусов, например G-белок вируса везикулярного стоматита. Это дает возможность использовать определенные линии эукариотических клеток (клетки-мишени) и обеспечивать достаточно высокую эффективность их заражения. Сборка ВИЧ-1-подобных частиц в этой системе происходит согласно модифицированной процедуре, разработанной для конструирования вирусоподобных частиц на основе вируса лейкоза мышей, родственного ВИЧ-1 [19] (рис. 1). Эта процедура заключается во внесении в культивируемые клетки почки эмбриона человека (так называемые упаковывающие клетки) по отдельности плазмид, содержащих а) ген gag-pol ВИЧ-1, кодирующий структурные белки для формирования капсида вирусной частицы и ферменты ВИЧ-1; б) ген env, кодирующий глико-протеины оболочки ВИЧ-1, или ген белка оболочки иного вируса и в) провирусную ДНК, кодирующую рекомбинантный РНК-геном, в состав которого входит маркерный ген флуоресцентного белка. После внесения всех перечисленных компонентов в упаковывающие клетки в них происходит синтез вирусных белков и рекомбинантной РНК, обеспечивающих формирование ВИЧ-1-подобных частиц, выходящих в культуральную среду. Добавление таких частиц к клеткам-мишеням приводит к тому, что в этих
Интеграза
Вирусная частица !;^1^,Геномная РНК
Л
Обратная транскриптаза
Интеграция
\
Ингибиторы обратной
аражение транскриптазы
Обратная транскрипция у/
Синтез двухцепочечной ДНК (провируса) снове ^ен-омой РНК
провируса в геном клетки-хозяина
Ингибиторы
интегразы
Интегрированный провирус^ Транскрипция/сплайсинг)
Трансляция геномной и субгеномной РНК в gag, pol ИнгибиторЫ-Протеазы и env, протеолитический
процессинг Зараженная клетка
Формирование вирусной частицы
Инфекционный ВИЧ-1
Г
Маркерный ген Ц
Трансфекция
еном псевдо-ВИЧ-1-частицы, содержащий маркерный ген (провирус)
Упаковывающая клетка
Неинфекционная псевдо-ВИЧ-1-частица, содержащая маркерный ген, но не гены ВИЧ-1
Перенос невирусных, в том числе маркерных генов, но не размножение ВИЧ-1
Рис. 1. Жизненный цикл инфекционного ВИЧ-1 (А) и получение рекомбинантных псевдо-ВИЧ-1-частиц в упаковывающих клетках (Б).
клетках на рекомбинантном РНК-геноме синтезируется ДНК провируса, содержащего маркерный ген, встраивание которого в геном клетки-мишени придает ей способность флуоресцировать. Следует особо отметить, что использование плазмидных ДНК, экс-прессирующих по отдельности вирус-специфические белки, позволяет конструировать любые варианты псевдо-ВИЧ-1-частиц с одной или несколькими мутациями в любом из ферментов репликации вируса, которые соответствуют лекарственно-устойчивым штаммам ВИЧ-1.
К сожалению, в опубликованных к настоящему времени работах содержится лишь ограниченное число примеров успешного использования подобных систем для изучения антиретровирусной активности веществ различной природы, при этом универсальность описанных систем неочевидна. В связи с этим, основная цель нашей работы состояла в доказательстве адекватности предложенной клеточной системы для скрининга потенциальных анти-ВИЧ-1-препаратов. Мы проверили активность ряда
ингибиторов обратной транскриптазы и интегразы ВИЧ-1 как применяющихся в медицинской практике, так и находящихся на разных стадиях лабораторных исследований.
экспериментальная часть
Культивирование клеток
В работе использовали клетки линий HEK293 (клетки эмбриональной почки человека), SC-1 (эмбриональные фибробласты мыши), Jurkat (Т-лифобластный лейкоз человека), CEM-SS (Т-лимфобластный лейкоз человека) и Kasumi-1 (острый миелоидный лейкоз человека). Клетки линий HEK293 и SC-1 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Fetal Calf Serum, FCS), 4 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки линий Jurkat, CEM-SS и Kasumi-1 культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FCS, 4 мM L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл
Б
LTR
стрептомицина. Клетки растили при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО2.
Получение псевдо-ВИЧ-1-частиц
В качестве упаковывающих клеток, в которых происходит сборка рекомбинантных лентивирусных частиц (псевдо-ВИЧ-1-частицы), использовали клетки HEK293, которые за 12-14 ч до начала трансфекции высевали на чашки Петри диаметром 100 мм в количестве 3.0-3.5 х 106 клеток на чашку.
ДНК лентивирусного вектора, содержащего маркерный ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), вместе с плазмидами, направляющими синтез белков, необходимых для формирования псевдо-ВИЧ-1-частиц, вводили в клетки HEK293 методом Са-фосфатной трансфекции. Инфекционные псевдо-ВИЧ-1-частицы начинали собирать через 24 ч после трансфекции с интервалом 12 ч [13].
Вирус титровали на клетках HEK29, высеянных на 24-луночные планшеты за сутки до заражения. Уровень флуоресценции клеток измеряли на проточном цитофлуориметре Epics 4XL Beckman Coulter (США) через 48 ч после заражения. Титр вируса рассчитывали по формуле T = NP/V, где N - количество высеянных клеток; P - доля инфицированных клеток в популяции; V - количество добавленного суперна-танта, содержащего псевдо-ВИЧ-1-частицы; T -титр вируса. В работе использовали сборы с титрами вируса 5 Х105-5Х106.
Исследование антивирусной активности соединений
Для оценки анти-ВИЧ-1-активности к клеткам прибавляли раствор анализируемых соединений в воде или диметилсульфоксиде (ДМСО, конечная концентрация в среде не превышала 0.1%), через 2-8 ч (в зависимости от ингибитора) заражали псевдо-ВИЧ-1-частицами. Относительный уровень заражения определяли методом проточной цитофлуориметрии на приборе Epics 4XL Beckman coulter (США) через 48 ч после заражения.
результаты и обсуждение
Конструирование псевдо-ВИЧ-1-частиц и инфицирование ими различных линий эукариотических клеток
Важнейшими параметрами лентивирусной системы являются эффективность трансдукции клеток-мишеней псевдо-ВИЧ-1-частицами и, как следствие, уровень флуоресценции полученных трансгенных клеток. Эти параметры зависят от строения псевдовирусных частиц (вида белков оболочки) и линии инфицируемых клеток-мишеней. В качестве клеток-
j- 100
ф
с *
X X
J
*
d
и
I
го а
I
ф
m
О
а
80
60
40
20
др160 G
Псевдо-ВИЧ-1/др160 (ВИЧ-1) и псевдо-ВИЧ-1/белок G (ВВС)
Рис. 2. Уровень трансдукции клеток линии Jurkat псевдо-ВИЧ-1-частицами, содержащими в качестве белка оболочки белок др160 ВИЧ-1 или белок G вируса везикулярного стоматита (ВВС).
мишеней мы использовали перевиваемые лимфо-бластные клетки крови человека Jurkat и CEM-SS (Т-лимфобластный лейкоз, содержат специфические рецепторы ВИЧ-1), Kasumi-1 (острый миелоидный лейкоз), а также фибробласты эмбриона мыши SC-1.
Нами получены и изучены два типа псевдо-ВИЧ-1-частиц, отличающихся друг от друга белками оболочки. Частицы первого типа содержат белок оболочки gp160 ^^р120 + TMgp41) ВИЧ-1; второго - белок оболочки G вируса везикулярного стоматита (ВВС). Использование частиц первого типа приводило к сравнительно невысокой эффективности трансдукции и более слабому сигналу флуоресценции (данные не приведены) от инфицированных клеток (рис. 2). В случае псевдо-ВИЧ-1-частиц, несущих белок G ВВС, доля инфицированных клеток и уровень экспрессии маркерного зеленого флуоресцентного белка (eGFP) были существенно выше (рис. 2). Кроме того, с помощью частиц, псевдотипированных белком G ВВС, при необходимости можно переносить маркерные гены в клетки широкой видовой и тканевой специфичности. Такой прием может позволить проводить поиск ингибиторов ретровирусов, поражающих и иные, чем кровь, ткани. Поэтому в большинстве опытов по изучению свойств ингибиторов обратной транскриптазы и интегразы ВИЧ-1 использовали именно псевдо-ВИЧ-1-частицы с белком G ВВС.
Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1
Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды широко используются в терапии различных вирусных заболеваний, в том числе ВИЧ-1-инфекции [3]. Механизм их действия включает превращение этих
0
л
Jurkat
0 50 100 500 1000 5000 Концентрация ингибитора, нМ
Jurkat SC-1 К^итМ CEM-SS
5000
Концентрация ингибитора, нМ
Рис. 3. Действие АЗТ на эффективность трансдукции клеток разных линий псевдо-ВИЧ-1-частицами, содержащими белок оболочки др160 (А) или белок оболочки G ВВС (Б). Показан уровень трансдукции относительно положительного контроля.
соединений в клетке в соответствующие нуклео-зидтрифосфаты, которые служат терминирующими субстратами для вирусных ДНК- и РНК-полимераз. Встраивание нуклеотидов в растущую цепь вирусной ДНК/РНК блокирует репликацию вируса и обеспечивает подавление развития инфекции. Первое и наиболее известное анти-ВИЧ-1-средство данного класса - 3'-азидо-3'-дезокситимидин (АЗТ), в нано-молярных концентрациях способный ингибировать репликацию вируса. Мы изучили противовирусную активность АЗТ в отношении псевдо-ВИЧ-1-частиц, несущих белок оболочки gp160 ВИЧ-1 или G ВВС, на своей поверхности. На рис. 3 показано, как АЗТ влияет на эффективность трансдукции клеток ВИЧ-1-подобными частицами, содержащими обратную транскриптазу, интегразу дикого типа и белок оболочки gp160 ВИЧ-1 (А) или белок G вируса везикулярного стоматита (Б). Видно, что АЗТ подавляет инфицирование эукариотических клеток псевдовирусными частицами обоих типов, хотя и в более высоких концентрациях, чем инфекционным ВИЧ-1 (таблица) [20-22]. В культуре клеток Jurkat активность препарата была выше в отношении частиц, псевдотипированных белком G ВВС. Противовирусная активность нуклеозида зависела не только от типа частиц, но и от линии клеток-мишеней. Так, максимальный эффект отмечен на фибробластах мыши SC-1, а минимальный - при использовании клеток CEM-SS. Причинами подобных различий могут быть разное внутриклеточное содержание нуклеозид- и нуклеотидкиназ [30] - ферментов, необходимых для превращения нуклеозида в соответствующий трифосфат, а также от различий в уровнях экспрессии специфических транспортеров, отвечающих за транспорт препарата в клетку или его выведение [31].
Другие известные и широко распространенные антиретровирусные средства - 2',3'-дидезокси-З'-тиоцитидин (3ТС) и 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидин ^4Т), которые, как и АЗТ, представляют собой нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 [3]. ЗТС был синтезирован в 1989 г. и одобрен для клинического применения в 1995. В настоящее время он применяется в комбинации с другими препаратами. Показана эффективность совместного применения ЗТС и АЗТ. Мы оценили противовирусную активность ЗТС на клетках линий Jurkat и СEM-SS (рис. 4). Активность препарата в нашей системе была несколько ниже, чем из-
0 100 500 1000 5000 10000 Концентрация ингибитора, нМ
Рис. 4. Действие 3ТС на эффективность трансдукции клеток линий ^гка+ и СЕМ-ББ псевдо-ВИЧ-1-частицами, содержащими белок оболочки G ВВС. Показан уровень трансдукции относительно положительного контроля.
0
Противовирусная активность исследованных соединений в отношении псевдо-ВИЧ-1-частиц, псевдотипированных белком G вируса везикулярного стоматита
Соединение Клеточная линия ИД50, мкМ
Эксперимент Лит. данные [20-29]
АЗТ Jurkat 0.1 ± 0.01 0.004-0.1
SС-1 0.08 ± 0.005
0.3 ± 0.02
СЕМ^ 0.46 ± 0.05
3ТС Jurkat 0.7 ± 0.05 0.02-0.35
СЕМ^ 0.85 ± 0.05
d4T Jurkat 7 ± 0.5 0.43-1.67
SС-1 10 ± 0.5
ddС Jurkat 7 ± 0.5 0.067-0.316
SС-1 5 ± 0.5
ddI Jurkat >20 1.79-12
SС-1 >20
Невирапин Jurkat 0.1 ± 0.005 0.0072-0.22
SС-1 0.15 ± 0.005
Kasumi-1 0.08 ± 0.005
СEM-SS 0.2 ± 0.01
Ненуклеозидный ингибитор ОТ 1 Jurkat 0.95 ± 0.05 0.13
Ненуклеозидный ингибитор ОТ 2 Jurkat 0.08 ± 0.001 0.016
Ненуклеозидный ингибитор ОТ 3 Jurkat 0.085 ± 0.001 0.018
Ралтегравир Jurkat 0.009 ± 0.0005 0.0022-0.0037
SС-1 0.006 ± 0.0005
СEM-SS 0.009 ± 0.0005
L-731,988 Jurkat 12 ± 0.1 1
SС-1 8 ± 0.1
вестно из опубликованных данных (таблица) [20, 24]. Активность других аналогов нуклеозидов, включая d4T, в нашей системе также была ниже, чем показанная на инфекционном ВИЧ-1 (таблица) [20, 21, 24].
Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1
Наиболее широко используемым ненуклеозидным блокатором репликации ВИЧ-1 - ингибитором обратной транскриптазы, является невирапин [3]. Утвержденное в качестве лекарственного средства в 1996 г., в концентрации 10-8-10-7 М это соединение способно подавлять развитие ВИЧ-1-инфекции в клетках, зараженных природным вирусом. Мы исследовали способность невирапина предотвращать трансдукцию клеток-мишеней описанными выше псевдо-ВИЧ-1-частицами. Как и АЗТ, невирапин проявлял более высокую антивирусную активность в отношении псевдовирусных частиц, несущих на своей поверхности белок G ВВС (рис. 5). Так же как и АЗТ, невирапин был наиболее эффективен в культуре фибро-бластов SC-1, а наименее - на линии CEM-SS. Особо
следует подчеркнуть, что активность невирапина в нашей системе была сопоставима с его активностью в отношении инфекционного ВИЧ-1 [21, 25].
Кроме коммерческого препарата невирапина, мы протестировали три новых ненуклеозидных ингибитора, обозначенных номерами 1, 2 и 3, синтезированных как описано в работе [27]. Эти соединения представляют собой №-замещенные урацилы, несущие бензофеноноксиэтильный (2 и 3) или бензилфе-ноксиэтильный фрагменты (1). Ранее мы показали, что эти соединения обладают высокой анти-ВИЧ-1-активностью в культуре клеток, инфицированных вирусом дикого типа [27]. Было продемонстрировано, что все три соединения способны предотвращать трансдукцию клеток SC-1 псевдо-ВИЧ-1-частицами с белком G ВВС, причем активность бензофенонсо-держащих соединений (2 и 3) существенно превышала активность бензилфеноксиэтилурацильного производного урацила (1) (рис. 6) и была сравнима с активностью невирапина. Полученные данные хорошо коррелируют с результатами изучения этих веществ в инфекционной клеточной системе (таблица).
л
с
О
о а
100 80 60 40 20 0
Jurkat
- БС-1 К^итМ
- СЕМ^
0 50 100 500 1000 5000 Концентрация ингибитора, нМ
0 50 100 500 1000 5000 Концентрация ингибитора, нМ
Рис. 5. Действие невирапина на эффективность трансдукции клеток разных линий псевдо-ВИЧ-1-частицами, содержащими белок оболочки др160 (Л) или белок оболочки G ВВС (Б). Показан уровень трансдукции относительно положительного контроля.
Ингибиторы интегразы ВИЧ-1
С целью оценки возможностей разработанной системы для скрининга ингибиторов интегразы использовали коммерческий препарат ралтегравир, разрешенный к применению в клинической практике с октября 2007 г., и известный ингибитор фермента L-731,988 [28]. Ралтегравир и L-731,988 блокируют вторую стадию интеграции - перенос цепи, препятствуя связыванию интегразы с клеточной ДНК. На рис. 7 приведена зависимость эффективности трансдукции клеток псевдо-ВИЧ-1-частицами с ин-тегразой дикого типа от концентрации ингибиторов. Видно, что активность ралтегравира примерно на три порядка выше, чем у L-731,988, что согласуется с данными, полученными в инфекционной системе [28, 32]. Снижение числа флуоресцирующих клеток в присутствии ингибиторов интегразы свидетельствует о том, что в предложенной нами псевдовирусной системе происходит полноценная интеграция синтезированной ДНК в геном клетки-мишени, а псевдо-ВИЧ-1-частицы действительно могут служить удобным инструментом для изучения противовирусной активности ингибиторов интегразы вируса.
Псевдо-ВИЧ-1-частицы, устойчивые к действию АЗТ
Поиск потенциальных ингибиторов репликации лекарственно-устойчивых штаммов ВИЧ-1 представляет собой важнейшую задачу. Однако такие работы часто ограничены не только необходимостью использования инфекционного вируса, опасного для персонала лаборатории, но и сложностью получения штаммов, нечувствительных к препаратам заданной группы. Предложенная нами система позволяет легко конструировать варианты псевдо-ВИЧ-1-частиц, несущих ферменты репликации с мутациями, определяющими устойчивость к лекарственным средствам.
Это подтверждено получением трех типов псевдо-ВИЧ-1-частиц с точечными заменами D67N, К70И, T215F и K219Q в обратной транскриптазе, наиболее характерными для штаммов ВИЧ-1, резистентных к АЗТ [33, 34]. Сравнение противовирусной активности АЗТ в отношении этих вариантов псевдовирусных частиц показало, что препарат гораздо слабее влиял на эффективность трансдукции мутантными частицами (рис. 8), причем падение ингибирующего эффекта коррелировало с увеличением числа мутаций (этот эффект наиболее ярко выражен в клетках SC-1). В то же время невирапин, ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы ВИЧ-1, сохранял свою активность в отношении всех АЗТ-устойчивых типов
100
с
о К
о р
и ц
80
60
40
20
1
— 2
3
0 50 100 500
Концентрация ингибитора, нМ
000
Рис. 6. Действие ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ-1 1, 2 и 3 на эффективность трансдукции клеток линии ^гка+ псевдо-ВИЧ-1-частицами, содержащими белок оболочки G ВВС. Показан уровень трансдукции относительно положительного контроля.
0
Рис. 7. Действие ингибиторов интегразы ВИЧ-1 ралтегравира (основной рисунок)и L-731,988 (вставка) на эффективность трансдукции клеток разных линий псевдо-ВИЧ-1-частицами, содержащими белок оболочки G ВВС. Показан уровень трансдукции относительно положительного контроля.
S? 100
о р
и ц
s d
so
6o
4o
с
о К
2o
o
Концентрация ингибитора, нМ
■ 100
so
6o
4o
2o
100
ОТ дикого типа
*-ОТ с мутациями D67N, K70R ОТ с мутациями D67N, K70R, T215F, K219Q
ОТ с мутациями T215F, K219Q
o 5 5o loo 5oo iooo 5ooo Концентрация ингибитора, нМ
so
= 6o
о ор
Ки ц
^
4o
2o
ОТ дикого типа
ОТ с мутациями D67N, K70R ОТ с мутациями D67N, K70R, T215F, K219Q ОТ с мутациями T215F, K219Q
5o ioo 5oo iooo 5ooo
Концентрация ингибитора, нМ
А
Б
o
o
o
Рис. 8. Действие АЗТ на эффективность трансдукции клеток псевдо-ВИЧ-1-частицами, содержащими белок оболочки G ВВС и обратную транскриптазу дикого типа или ее мутантные формы, на клетках линий Jurkat (А) и SC-1 (Б). Показан уровень трансдукции относительно положительного контроля.
псевдовирусных частиц (рис. 9). Это объясняется тем, что сайт связывания АЗТ удален от активного центра фермента, с которым взаимодействует трифосфат АЗТ и в котором находятся все означенные мутации. Таким образом, псевдо-ВИЧ-1-частицы действительно позволяют изучать способность веществ ингибиро-вать лекарственно-устойчивые формы вируса.
Аналоги неорганического пирофосфата
Отдельное направление подходов к терапии лекарственно-устойчивых форм ВИЧ-1 представляет поиск соединений, совместное использование которых с уже применяемыми антиретровирусными средствами приводит к восстановлению чувствитель-
ности вируса к антиретровирусным средствам. Согласно современным представлениям, устойчивость ВИЧ-1 к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы может формироваться с использованием двух альтернативных механизмов, включающих возникновение в обратной транскриптазе мутаций:
а) препятствующих взаимодействию фермента с соответствующими нуклеозидтрифосфатами (описано для 3ТС) или
б) способствующих выщеплению уже включенного терминирующего нуклеотида из ДНК в процессе реакции пирофосфоролиза, после которой синтез растущей цепи ДНК может быть продолжен (этот механизм считается основным для АЗТ) (рис. 10).
¥ О
I-Ф
80
60
о а
40
20
А
— ОТ дикого типа
ОТ с мутациями D67N, K70R ОТ с мутациями D67N, K70R, T215F,
ОТ с мутациями T215F,
5 50 100 500 1000 Концентрация ингибитора, нМ
5000
100
80
о ор
Ки ц
^
60
40
20
ОТ дикого типа
ОТ с мутациями D67N, K70R ОТ с мутациями D67N, K70R, T215F,
ОТ с мутациями T215F,
0 50 100 500 1000 Концентрация ингибитора, нМ
5000
Рис. 9. Действие невирапина на эффективность трансдукции клеток псевдо-ВИЧ-1-частицами, содержащими белок оболочки G ВВС и обратную транскриптазу дикого типа или мутантные формы, на клетках линий Jurkat (А) и SC-1 (Б). Показан уровень трансдукции относительно положительного контроля.
0
0
0
В настоящее время описан ряд соединений-миметиков неорганического пирофосфата, способных подавлять выщепление нуклеотидов при пиро-фосфоролизе [35, 36]. Один из них, фоскарнет (PFA), успешно применяется в комбинации с АЗТ [37], что подтверждает перспективность использования негидролизуемых аналогов неорганического пиро-фосфата в сочетании с нуклеозидными ингибиторами при терапии СПИДа [37].
но он
нического пирофосфата считаются производные ги-дроксиметилендифосфоновой кислоты, которые применяются в терапии костных патологий. В отличие от фоскарнета, соединения этого ряда не являются субстратами в реакции пирофосфоролиза. Тем не менее они эффективно ингибируют пирофосфоролити-ческое выщепление АЗТ из ДНК, катализируемое обратной транскриптазой ВИЧ-1 [36]. При этом следует отметить отсутствие публикаций об их активности в клеточных системах. В представленной работе для оценки адекватности предлагаемой клеточной системы и изучения веществ данного типа были испытаны фоскарнет (PFA) и аналог неорганического пирофосфата - бисфосфонат 4. Дихлорбензильное производное метилендифосфоновой кислоты 4 является наиболее активным из подобных соединений, оно способно подавлять выщепление монофосфата АЗТ, катализируемое обратной транскриптазой, в субми-кромолярном диапазоне концентраций [35]. Данные
о совместном действии азидотимидина и указанных ингибиторов пирофосфоролиза приведены на рис. 11. В этом опыте определена степень ингибирования трансдукции клеток АЗТ-устойчивыми псевдо-ВИЧ-1-частицами (несущими точечные замены D67N, К70И, T215F и K219Q в обратной транскриптазе) при добавлении АЗТ в комбинации с выбранным ингибитором пирофосфоролиза. В контрольном эксперименте определяли количество флуоресцирующих клеток в присутствии каждого из этих веществ по отдельности.
Вывод об аддитивности действия АЗТ и аналогов пирофосфата делали, сравнивая степень ингибиро-вания в присутствии двух веществ и произведение степеней ингибирования каждым из соединений (что отражает независимость их действия). Из рис. 11 видно, что фоскарнет и бисфосфонат 4 подавляли инфицирование клеток псевдовирусными частицами, а также заметно и статистически значимо усиливали действие АЗТ. Таким образом, полученные данные впервые показывают возможность восстановления чувствительности резистентных форм ВИЧ-1 к ну-клеозидным ингибиторам обратной транскриптазы в культуре клеток и свидетельствуют о перспективности аналогов неорганического пирофосфата в качестве потенциальных компонентов антиретровирус-ной терапии.
заключение
С использованием ряда линий клеток человека и мыши показано, что описанная нами система безопасного скрининга потенциальных ингибиторов репликации ВИЧ-1 позволяет проводить испытания ингибиторной активности соединений, действие которых направлено как на обратную транскриптазу и ин-
попопо1-^ От
Выщепление
Связывание
трифосфата
п
Включение Щ Связывание РР1
О ?
и
|_ С?4
я
£ £
О
100
50
т С
Комбинация АЗТ и PFA
1р=0.03!
<
+
?
I
?
+
?
5 2
Высвобождение рр|
V
^^^ Элонгация ^ Пирофосфоролиз
ПпПпПпПпГ1пПпГ1п
^ V/ V V V/ V
Рис. 10. Механизм реакции пирофосфоролиза, катализируемой обратной транскриптазой.
и
о:
и
О т т а
о
<
<
т <
<
Комбинация АЗТ и бисфосфоната 4
100
50
тегразу ВИЧ-1 дикого типа, так и на их мутантные формы, соответствующие лекарственно-устойчивым формам вируса. Важно, что используемые в этой системе псевдо-ВИЧ-1-частицы неинфекционны и по сути представляют собой вирусы одноразового действия (рекомбинантные лентивирусные векторы), содержащие полный набор вирусных ферментов, обеспечивающих синтез рекомбинантного двухце-почечного ДНК-провируса и его интеграцию в геном клеток-мишеней. После этого клеточными системами осуществляется экспрессия маркерных генов, внесенных в геном клетки, в составе рекомбинантного генома псевдо-ВИЧ-1-частиц.
Отсутствие в таком рекомбинантном геноме полного набора ВИЧ-1 гарантирует безопасность испытаний эффективности новых анти-ВИЧ-1-соединений, с одной стороны, и возможность адекватной оценки действия этих соединений на обратную транскрип-тазу и интегразу ВИЧ-1 в клетках, «зараженных» (трансдуцированных) псевдо-ВИЧ-1-частицами.
Возможность формирования псевдо-ВИЧ-1-частиц, содержащих мутантную «лекарственно-устойчивую» обратную транскриптазу и/или интегразу, позволяет
З А
З А
З А
+
?
н 0 0
З А
0 0
0 0
З А
0 0
+
?
н 0 0
З А
0 0
Рис. 11. Подавление вирусной трансдукции комбинацией АЗТ и ингибиторов пирофосфоролиза. Данные представлены как среднее значение серии из пяти экспериментов ± доверительный интервал (Р < 0.1). Значения серий «АЗТ&» получены при одновременном внесении ингибиторов в указанных в скобках концентрациях. Значения серий «АЗТ+» являются расчетной величиной, полученной произведением остаточных активностей индивидуальных ингибиторов в указанных в скобках концентрациях. р - Значение парного двух-выборочного 1^-теста Стьюдента для указанных значений.
0
0
66 | АСТА ПАТиИАЕ | ТОМ 3 № 4 (11) 2011
также проводить скрининг потенциальных ингибиторов лекарственно-устойчивых форм ВИЧ-1.
Псевдотипирование псевдо-ВИЧ-1-частицы белками оболочки ретровирусов различной природы, в том числе и белком оболочки gp160 ВИЧ-1, а также других оболочечных вирусов, существенно расширяет возможности системы скрининга, позволяя заражать клетки различных типов, и делает возможным тестирование ингибиторов проникновения вирусов в клетку. Наконец, хотя это и не рассмотрено в настоящей работе, представленная система позволяет исследовать и ингибиторы протеазы ВИЧ-1. •
Работа поддержана Программами фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Основы фундаментальных исследований нанотехнологий
и наноматериалов», госконтрактами с Минобрнауки РФ № 16.512.11.2192, 16.512.11.2193, 16.512.12.2006 и 02.740.11.0706 и грантами Российского фонда фундаментальных исследований № 09-04-01221-а, 11-04-12035-офи-м и 11-04-01365-а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. 2008 Report on the global AIDS epidemic, World Health Organization.
2. http://www.hivrussia.org/stat/2009/10.shtml
3. De Clercq E. // Int. J. Antimicrob. Agents. 2009. V. 33. № 4. P. 307-320.
4. Kuritzkes D.R., Walker B.D. // Fields Virology / Eds Knipe D.M., Howley P.M. Philadelphia: Lippinkot, Williams & Wilkins, 2007.
5. Hengge U.R., Ruzicka Т., Tyring S.K., Stuschke M., Roggendorf M., Schwartz R.A., Seeber S. // Lancet Infect. Dis. 2002. V. 2. № 5. P. 281-292.
6. Wittkop L., Gflnthard H.F., de Wolf F., Dunn D., Cozzi-Lepri A., de Luca A., Kflcherer C., Obel N., von Wyl V., Masquelier B., et al. // Lancet Infect. Dis. 2011. V. 11. № 5. P. 363-371.
7. Nunez M. // Hepatology. 2010. V. 52. № 3. P. 1143-1155.
8. Izzedine H., Harris M., Perazella M.A. // Nat. Rev. Nephrol. 2009. V. 5. № 10. P. 563-573.
9. Panyutich A.V., Prassolov V.S., Shydlovskaya E.A., Reznikov M.V., Chumakov P.M., Voitenuk N.N. // Hybridoma. 1990. V. 9. № 4. P. 401-406.
10. Prassolov V.S., Meyer J., Brandenburg G., Hannemann J., Bergemann J., Ostertag W., Stocking C. // Exp. Hematol. 2001. V. 29. № 6. P. 756-765.
11. Спирин П.В., Вильгельм А.Э., Прасолов В.С. // Молекуляр. биология. 2008. Т. 42. № 5. C. 913-926.
12. Спирин П.В., Баскаран Д., Рубцов П.М., Зенкова М.А., Власов В.В., Черноловская Е.Л., Прасолов В.С. // Acta Naturae.
2009. Т. 1. № 2(2). P. 98-103.
13. Спирин П.В., Баскаран Д., Орлова Н.Н., Рулина А.В., Ни-китенко Н.А., Черноловская Е.Л., Зенкова М.А., Власов В.В., Рубцов П.М., Чумаков П.М., и др // Молекуляр. биология.
2010. Т. 44. № 5. C. 876-888.
14. Kellam P., Larder B. // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. V. 38. № 1. P. 23-30.
15. Walter H., Schmidt B., Korn K., Vandamme A.M., Harrer Т., Uberla K. // J. Clin. Virol. 1999. V. 13. № 1-2. P. 71-80.
16. Jarmy G., Heinkelein M., Weissbrich B., Jassoy C., Rethwilm
A. // J. Med. Virol. 2001. V. 64. № 3. P. 223-231.
17. Garcia-Perez J., Sanchez-Palomino S., Perez-Olmeda M., Fernandez B., Alcami J. // J. Med. Virol. 2007. V. 79. № 2. P. 127-137.
18. Чересиз С.В., Григорьев И.В., Семенова Е.А., Пустыльняк
B.О., Власов В.В., Покровский А.Г. // ДАН. 2010. Т. 435. № 1.
C. 126-130.
19. Прасолов В.С., Чумаков П.М. Вектор pPS-1-neo для введения и экспрессии генов в культивируемых соматичежих клетках млекопитающих. Авт. свид. 1440036 от 26.06.1987 г. Заявка 4268094.
20. Rosenblum L.L., Patton G., Grigg A.R., Frater A. J., Cain
D., Erlwein O., Hill C.L., Clarke J.R., McClure M.O. // Antivir. Chem. Chemother. 2001. V. 12. № 2. P. 91-97.
21. Smith R.A., Gottlieb G.S., Miller A.D. // Retrovirology. 2010. V. 7. P. 70-81.
22. Bjerke M., Franco M., Johansson M., Balzarini J., Karlsson A. // Biochem. Pharmacol. 2008. V. 75. № 6. P. 1313-1321.
23. Perez-Bercoff D., Wurtzer S., Compain S., Benech H., Clavel F. // J. Virol. 2007. V. 81. № 9. P. 4540-4550.
24. Patick A.K., Boritzki T.J., Bloom L.A. // Antimicrob. Agents Chemother. 1997. V. 41. № 10. P. 2159-2164.
25. Grob P.M., Wu J.C., Cohen K.A., Ingraham R.H., Shih C.K., Hargrave K.D., McTague T.L., Merluzzi V.J. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1992. V. 8. № 2. P. 145-152.
26. Witvrouw M., Arranz M.E., Pannecouque C., Declercq R., Jonckheere H., Schmit J.C., Vandamme A.M., Diaz J.A., Ingate S.T., Desmyter J., et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 1998. V. 42. № 3. P. 618-623.
27. Novikov M.S., Ivanova O.N., Ivanov A.V., Ozerov A.A., Valuev-Elliston V.T., Gurskaya G.V., Kochetkov S.N., Pan-necouque C., Balzarini J., Seley-Radtke K.L. // Bioorg. Med. Chem. 2011. V. 19. № 19. P. 5794-5802.
28. Hazuda D.J., Felock P., Witmer M., Wolfe A., Stillmock K., Grobler J. A., Espeseth A., Gabryelski L., Schleif W., Blau C., et al. // Science. 2000. V. 287. № 5453. P. 646-650.
29. Paprotka T., Venkatachari N.J., Chaipan C., Burdick R., Delviks-Frankenberry K.A., Hu W.S., Pathak V.K. // J. Virol. 2010. V. 84. № 11. P. 5719-5729.
30. Gröschel B., Höver G., Doerr H.W., Cinatl J., Jr. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2001. V. 20. № 4-7. P. 487-492.
31. Paintsil E., Dutschman G.E., Hu R., Grill S.P., Wang C.J., Lam W., Li F.Y., Ghebremichael M., Northrup V., Cheng Y.C. // Antimicrob. Agents Chemother. 2011. V. 55. № 2. P. 895-903.
32. Summa V., Petrocchi A., Bonelli F., Crescenzi B., Donghi M., Ferrara M., Fiore F., Gardelli C., Gonzalez Paz O., Hazuda D.J., et al. // J. Med. Chem. 2008. V. 51. № 18. P. 5843-5855.
33. Arion D., Parniak M.A. // Drug Resist. Updat. 1999. V. 2. № 2. P. 91-95.
34. Isaguliants M.G., Belikov S.V., Starodubova E.S., Gizatullin R.Z,. Rollman E., Zuber B., Zuber A.K., Grishchenko O.I., Ryt-ting A.S., Källander C.F., et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2004. V. 20. № 2. P. 191-201.
35. Cruchaga C., Anso E., Rouzaut A., Martinez-Irujo J.J. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 38. P. 27744-27752.
36. Song Y., Chan J.M.W., Tovian Z., Secrest A., Nagy E., Krysiak K., Bergan K., Parniak M.A., Oldfield E. // Bioorg. Med. Chem. 2008. V. 16. P. 8959-8967.
37. Jacobson M.A., van der Horst C., Causey D.M., Dehlinger M., Hafner R., Mills J. // J. Infect Dis. 1991. V. 163. № 6. P. 1219-1222.
