CC BY
119
УДК 577.151.45:578.287
Сравнительный анализ влияния мутаций лекарственной устойчивости на активность интеграз ВИЧ-1 субтипов А и В
О. А. Шадрина1, Т. С. Зацепин2,3, Ю. Ю. Агапкина3, М. Г. Исагулянц4,5, М. Б. Готтих2,3* Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии и биоинформатики, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 73
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991, Москва, Ленинские горы,1,стр. 40
3Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3
4Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16
5Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology, Karolinska Institutet, Nobels väg 16, 17177,
Stockholm, Sweden
*E-mail: gottikh@belozersky.msu.ru
Поступила в редакцию 22.10.2014
РЕФЕРАТ Интеграция ДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в геном зараженной клетки -одна из ключевых стадий репликативного цикла этого вируса. Катализирующий ее вирусный фермент интеграза служит важной мишенью для новых противовирусных препаратов. Однако при проведении антиретрови-русной терапии в гене интегразы возникают мутации, вызывающие резистентность вируса к ингибиторам интеграции. Для оценки влияния мутаций лекарственной устойчивости на активность интегразы ВИЧ-1 субтипа А штамма FSU-A, доминирующего на территории России, получены и охарактеризованы препараты консенсусной интегразы этого субтипа вируса, содержащие первичные мутации лекарственной устойчивости G118R и Q148K и вторичные компенсаторные замены E138K и G140S, и проведено их сравнение с соответствующими мутантными формами интегразы ВИЧ-1 субтипа В штамма HXB-2. Мутация Q148K практически одинаково снижала активность интеграз обоих субтипов. Ее негативный эффект частично компенсировался вторичными мутациями E138K и G140S. Первичная замена G118R по-разному влияла на активность белков субтипов А и В, компенсаторное действие вторичной замены Е138К также зависело от субтипа вируса. Сравнение устойчивости всех мутантов к известным ингибиторам переноса цепи ралте-гравиру и элвитегравиру и новому ингибитору XZ-259 из класса дигидро-1Н-изоиндолов показало, что белки обоих субтипов с мутацией Q148K малочувствительны к ралтегравиру и элвитегравиру, но достаточно эффективно ингибируются XZ-259. Замена G118R незначительно снижала эффективность ингибирования интеграз ралтегравиром и элвитегравиром и не вызывала устойчивости к XZ-259.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА ВИЧ-1 субтипа А, интеграза, ингибитор переноса цепи, мутации лекарственной устойчивости, штамм FSU-A.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека типа 1; ИН - интеграза; ИНА - интеграза субтипа А ВИЧ-1 штамма FSU-A; ИНВ - интеграза субтипа В ВИЧ-1 штамма HXB-2; RAL - ралтегравир; EVG - элвитегравир; DTG - долутегравир; IC50 - концентрация ингибитора, подавляющая активность фермента на 50%; FC - изменение величины IC50 мутантных белков по сравнению с диким типом; wt - дикий тип интегразы; ПААГ - полиакриламидный гель; DTT - дитиотреитол; EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота; ТБЕ - трис-боратный буфер с EDTA.
ВВЕДЕНИЕ
Интеграза — один из основных ферментов вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), необходимых для его репликации. Она катализирует встра-
ивание ДНК-копии геномной РНК вируса в клеточную ДНК в ходе двух последовательных реакций. Первая из них - реакция З'-процессинга - заключается в отщеплении динуклеотида GpT с З'-конца
каждой цепи вирусной ДНК. Вторая - реакция переноса цепи - представляет собой встраивание процес-сированной вирусной ДНК в ДНК инфицированной клетки.
Интеграза ВИЧ-1 не имеет гомологов в клетке и в силу этого служит привлекательной мишенью для создания ингибиторов ВИЧ-инфекции. К настоящему времени три соединения - ингибиторы переноса цепи ралтегравир (RAL), элвитегравир (EVG) и долутегравир (DTG) - допущены к терапевтическому применению в качестве компонентов анти-ретровирусной терапии. Однако под воздействием ингибиторов интеграции как у больных, так и в культуре ВИЧ-инфицированных клеток в гене интегразы возникают мутации, вызывающие резистентность к этим препаратам [1]. К ингибиторам переноса цепи первого поколения - RAL и EVG - у вируса достаточно быстро вырабатывается устойчивость, в том числе перекрестная. Одна из общих причин высокой резистентности к обоим ингибиторам - первичная мутация по остатку Q148 [2-6]. В большинстве случаев она возникает в комбинации со вторичными мутациями, среди которых наиболее часто встречаются G140S/A и E138K/A [2-7]. Как было показано в in vitro- и in vivo-исследованиях, вторичные мутации частично восстанавливают репликативную способность вируса, сниженную первичными заменами, а также могут усиливать лекарственную устойчивость [7-11].
DTG - препарат второго поколения - активен против большинства RAL- и EVG-устойчивых штаммов вируса [9, 12, 13]. Тем не менее изучение влияния DTG на изоляты ВИЧ-1, выделенные от пациентов, нечувствительных к RAL и EVG, показало, что замены Q148H/K/R в составе интегразы приводят к некоторой резистентности к DTG. При этом вторичные и третичные мутации (G140A/C/S, L74I и E138A/ K/T) дополнительно повышают эту резистентность [14, 15]. При селекции в культуре лимфоцитов штаммов ВИЧ-1, устойчивых к DTG, были отобраны варианты, содержащие целый ряд аминокислотных замен в составе интегразы: H51Y, L101I, G118R, T124A, S153F/Y, R263K [13, 16]. Однако только две из них, G118R и R263^ действительно вызывали устойчивость вируса к DTG [15, 17].
ВИЧ-1 представлен разными субтипами и реком-бинантными штаммами, среди которых территориально наиболее распространен субтип В, доминирующий на территории США, Австралии, Японии и стран Западной Европы. Мутация Q148H/R/K приводит к возникновению устойчивости к RAL и EVG у разных субтипов вируса. Мутации, ассоциированные с устойчивостью к DTG, более специфичны. Так при in vitro--селекции резистентных
штаммов ВИЧ-1 субтипов В, С и A/G общей для всех была только замена R263K; замена G118R обнаружена только у субтипов A/G и С [16]. У вируса субтипа С эта мутация найдена и при in vitro-селекции с другим ингибитором переноса цепи второго поколения - MK-2048 [18]. В этой же работе показано, что вторичной компенсаторной заменой по отношению к G118R является мутация E138K. Недавно обнаружили, что с появлением мутации G118R связана невосприимчивость к RAL у пациента, инфицированного штаммом CRF02_A/G [19]. Крайне важно, что изолят этого вируса, содержащий замену G118R в гене интегразы, оказался резистентным не только к RAL, но и к EVG и DTG [15]. Все эти данные позволяют предположить, что замена G118R наиболее характерна для не-В-субтипов ВИЧ-1, причем ее присутствие может приводить к нечувствительности пациентов ко всем ингибиторам интегразы, разрешенным к настоящему моменту для терапевтического использования.
На территории постсоветского пространства доминирует вирус субтипа А (FSU-A), интеграза которого еще недостаточно охарактеризована [20]. В частности, еще не накоплено достаточно сведений о вызываемых ингибиторами интегразы мутациях лекарственной устойчивости, характерных для штамма FSU-A. С целью выяснения влияния возможных мутаций лекарственной устойчивости на ферментативные свойства интегразы ВИЧ-1 субтипа А мы создали консенсусную интегразу штамма FSU-A, в которую методами сайт-направленного мутагенеза вводили мутации устойчивости к RAL и EVG [21, 22]. Консенсусная последовательность интегразы ВИЧ-1 штамма FSU-A (ИНА) отличается от последовательности наиболее изученной интегразы субтипа В (HXB-2) заменами 16 аминокислотных остатков, девять из которых находятся в каталитическом домене. Мы охарактеризовали каталитическую активность ИНА, а также ее вариантов, содержащих две основные комбинации мутаций, которые вызывают устойчивость к RAL и EVG: E92Q, V151I, N155H, G163R, L74M (мутант 1) и Q148K, E138K, G140S (мутант 2) [22]. Консенсусный фермент был значительно более активен, чем интеграза субтипа В (ИНВ) в реакциях З'-процессинга и переноса цепи. Введение указанных мутаций существенно повышало устойчивость ИНА к действию RAL и EVG, но при этом значительно снижало ее каталитическую активность в обеих реакциях [22].
В настоящей работе мы продолжили исследование роли мутаций лекарственной устойчивости и провели детальное сравнение влияния первичной мутации Q148K и вторичных мутаций E138K и G140S на активность интеграз штаммов FSU-A и HXB-2. Мы так-
же впервые охарактеризовали активность мутантов ИНА, содержащих первичную замену G118R и компенсирующую ее замену E138K. Введение мутации Q148K резко снижало активность ферментов обоих субтипов в обеих реакциях - З'-процессинга и переноса цепи. Это снижение несколько компенсировалось вторичными заменами E138K и G140S. Замена G118R в 5 раз уменьшала эффективность З'-процес-синга для обеих интеграз, но в реакции переноса цепи по-разному влияла на ферменты разных штаммов: активность ИНА снижалась значительно сильнее, чем ИНВ. Более того, вторичная замена E138K оказывала компенсирующий эффект только на ИНВ. Мы также сравнили устойчивость всех полученных мутантов к RAL, EVG и новому ингибитору переноса цепи XZ-259 [23]. Препарат XZ-259 достаточно эффективно ингибировал RAL- и EVG-устойчивые формы ин-тегразы, содержащие замену Q148K. Замена G118R привела к незначительному снижению чувствительности интеграз к RAL и EVG, более выраженному в случае ИНВ, и не влияла на чувствительность инте-граз к действию ингибитора XZ-259.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Ферменты
Для экспрессии рекомбинантной ИН ВИЧ-1 обоих подтипов (дикого типа и мутантных) с гистидиновой последовательностью на N-конце использовали плаз-мидный вектор pET-15b (Novagen, США). Препараты белков выделяли из клеток штамма-продуцента Rosetta (DE3) Escherichia coli и очищали без добавления детергента как описано в [24]. Генетические конструкции, кодирующие мутантные формы ИН, получали с помощью сайт-направленного мутагенеза плазмиды, кодирующей исходную интегразу, с использованием набора QuikChange II Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent Technologies, США). Все процедуры осуществляли согласно инструкциям производителя. Препараты анализировали методом электрофореза в 12% ПААГ по Лэммли с последующим окрашиванием SimplyBlueTM SafeStain (Invitrogen, США) в соответствии с инструкцией. Чистота препаратов была не менее 90%.
Олигодезоксирибонуклеотиды
Все олигодезоксирибонуклеотиды синтезировали амидофосфитным методом на автоматическом ДНК-синтезаторе ABI 3400 (Applied Biosystems, США) согласно стандартному регламенту с использованием коммерческих реагентов (Glen Research, США).
Для введения радиоактивной 32Р-метки на 5'-ко-нец олигонуклеотидов 10 пмоль олигонуклеотида инкубировали с 10 ед. акт. Т4-полинуклеотидкиназы
(Fermentas, Литва) и 50 мкКи (16 пмоль) [у-32Р]АТР (3000 Ки/ммоль) в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-НС1-буфер, pH 7.5, 10 мМ MgCl2, 5 мМ DTT, 0.1 мМ спермидин, 0.1 мМ EDTA, в течение 1 ч при 37°C. Затем киназу инактивировали добавлением 2 мкл 250 мМ водного EDTA и нагреванием до 65°C в течение 10 мин. Добавляли эквимолярное количество комплементарного олигонуклеотида и формировали дуплекс нагреванием смеси олиго-нуклеотидов до 95°C с последующим медленным охлаждением до комнатной температуры. Полученный дуплекс окончательно очищали от избытка [y-32P] АТР и солей на колонке MicroSpin G-25 Columns (Amersham Biosciences, США) согласно условиям производителя.
Определение каталитической активности ИН ВИЧ-1
В реакции З'-процессинга в качестве субстрата использовали дуплекс U5B/U5A, составленный из 21-звенных олигонуклеотидов U5B (5'-GTGTGGAAAATCTCTAGCAGT-3') и U5A (5'-ACTGCTAGAGATTTTCACAC-3') и имитирующий концевой участок и5-фрагмента длинного концевого повтора вирусной ДНК. Для анализа каталитической активности исследуемых белков 3 нМ дуплекс U5B/U5A (с 32Р-меченой и5В-цепью) инкубировали со 100 нМ интегразой в 20 мкл буфера (20 мМ HEPES, pH 7.2, 7.5 мМ MgCl2, 1 мМ DTT) при 37°С. Время инкубации варьировали от 1 до 2000 мин. Реакцию останавливали добавлением 80 мкл стоп-раствора (7 мМ EDTA, 0.3 M ацетат натрия, 10 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0.1 мг/мл гликоген). Интегразу экстрагировали смесью фенол : хлороформ : изоамиловый спирт = 25 : 24 : 1, ДНК-дуплекс осаждали этиловым спиртом (250 мкл) и анализировали электрофорезом в 20% ПААГ с 7 М мочевиной в буфере ТБЕ. Радиоавтограммы получали на сканере GE Typhoon FLA 9500, денситометрию проводили с помощью программного обеспечения ImageQuant 5.0. По соотношению интенсивностей излучения полос, соответствующих субстрату U5B и укороченному на два звена продукту реакции U5B-2, определяли эффективность З'-процессинга с использованием программы ImageQuant™ 5.0. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Gnuplot версия 4.6.
В реакции гомологичного переноса цепи в качестве субстрата и ДНК-мишени использовали ДНК-дуплекс U5B-2/U5A. Реакцию проводили в том же буфере, в котором осуществляли 3'-процессинг, используя 10 нМ дуплекс U5B-2/U5A (с 32Р-меченой цепью U5B-2) и 100 нМ интегразу, при 37°С и отбирали аликвоты через 2, 4 и 6 ч.
В реакции гетерологичного переноса цепи использовали субстрат U5B-2/U5A и 36-звенный ДНК-дуплекс (5'-ACAAAATTCCATGACAATTGTGGT-GGAATGCCACTA-3', 5'-TAGTGGCATTCCACCA-CAATTGTCATGGAATTTTGT-3') в качестве ДНК-мишени. 2 нМ субстрат U5B-2/U5A (с 32Р-меченой цепью U5B-2) сначала инкубировали в буфере для З'-процессинга со 100 нМ интегразой при 25°С в течение 30 мин, а затем добавляли 8 нМ ДНК-мишени и инкубировали в течение еще 2 ч при 37°С. Выделение и анализ продуктов реакции проводили как описано выше.
Ингибирование переноса цепи
Для изучения устойчивости ИН к ингибиторам RAL, EVG (Santa Cruz Biotechnology Inc., США) и XZ-259 (любезно предоставлен д-ром Xue Zhi Zhao из NIH, США) реакцию гомологичного переноса цепи проводили как описано выше в течение 2 ч в присутствии возрастающих концентраций ингибитора. По результатам трех независимых опытов определяли значение IC50 для каждого ингибитора. Данные по эффективности реакции аппроксимировали с помощью функции экспоненциального убывания, и вычисляли значение в точке, соответствующей 50%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
С целью проведения сравнительного анализа влияния мутаций лекарственной устойчивости на каталитическую активность интеграз штаммов FSU-A (ИНА) и HXB-2 (ИНВ) методом сайт-направленного мутагенеза были получены 14 мутантных белков, по семь для каждой из интеграз: Q148K, G140S, E138K, G118R, Q148K/E138K, Q148K/G140S и G118R/E138K. Их активность определяли в реакциях 3'-процессинга и переноса цепи с использованием синтетических ДНК-дуплексов, соответствующих концевой последовательности участка U5 длинного концевого повтора вирусной кДНК.
Влияние мутаций на каталитическую активность интеграз ИНА и ИНВ в реакции З'-процессинга
В реакции З'-процессинга в качестве субстрата использовали 21-звенный олигонуклеотидный дуплекс (U5B/U5A), структура которого соответствовала U5-концу вирусной ДНК (и5-субстрат), и условия (концентрации фермента и ДНК, состав буфера), в которых мы ранее характеризовали каталитическую активность ИНА и ИНВ [22].
Мы оценили зависимость эффективности 3'-процес-синга от времени и построили кинетические кривые накопления продукта (рис. 1). Начальные скорости реакции З'-процессинга (V0) рассчитывали из линейного отрезка кривой (первые 60 мин) (табл. 1).
Как показано нами ранее [22], ИНА активнее в реакции З'-процессинга, чем ИНВ. Все мутанты ИНА также характеризовались более высокой эффективностью накопления продуктов, чем соответствующие мутанты ИНВ (рис. 1). Однако начальные скорости реакции у мутантных форм обеих интеграз отличались незначительно (табл. 1).
Все введенные нами в состав интеграз обоих субтипов мутации снижали как скорость образования, так и эффективность накопления продуктов 3'-про-цессинга (рис. 1, табл. 1). Наиболее существенным снижение было у белков с заменой Q148К, что в случае интегразы субтипа В хорошо согласуется с ранее полученными результатами [25].
Как мы и ожидали на основании опубликованных данных [7—11, 13], замена G140S была компенсаторной для первичной мутации Q148K (рис. 1, табл. 1). Причем в случае ИНА компенсирующее действие G140S проявлялось более сильно: изменение эффективности и начальной скорости 3'-процессинга у пары ИН/1408/«148К/ИНАда41Ж оказалось выше, чем у соответствующей пары в субтипе В (рис. 1, табл. 1). Надо, однако, отметить, что компенсаторное действие G140S в отношении мутации Q148K, наблюдаемое для ИНАда48К и ИНВда48К, было не столь значительным, как в случае замены Q148H в интегразе субтипа В [8]. Очевидно, это связано с более сильным негативным влиянием на интеграционную активность исследуемой нами мутации Q148K. Различие в активности интеграз с первичными мутациями Q148K и Q148Н коррелирует с различиями в интеграционной активности несущих эти мутации вирусов [7, 10, 11].
Замена Е138К также оказывала компенсаторное влияние на активность интеграз обоих подтипов с первичной заменой Q148K (рис. 1, табл. 1). Однако оба двойных мутанта ИНАЕ138К/«148К и ИНВЕ138К/«148К были несколько менее активны, чем двойные мутанты, несущие замены G140S/Q148K. Это согласуется с уменьшением репликативной и интеграционной активности мутантных форм ВИЧ-1 субтипа В в ряду Q148K<Q148K/E138K<Q148K/G140S [7]. Интересно, что активность изученного нами ранее тройного мутанта E138K/G140S/Q148K интегразы FSU-A была несколько выше, чем у изученных здесь ферментов с двумя заменами: через 1500 мин от начала реакции эффективность 3'-процессинга для тройного мутанта достигала 30% от уровня ИНА [22], в то время как у наиболее активного двойного мутанта ИНАШ408/ чиж она не превышала 20% (табл. 1). Таким образом, компенсаторный эффект от совокупности двух мутаций E138K и G140S оказался несколько большим, чем от отдельных вторичных замен G140S или Е138^ Аналогичное наблюдение было сделано ранее для ВИЧ-1 субтипа В: добавление мутации
I
X
и
и ф
J
0
а □
1
го
Л)
н
и О X
ш ■в-■во
А
80т
70 60 50 40 3020. 10. 0
0
ИН
500
1000 1500 Время, мин
2000
■ wt
• G118R
E138K
► G140S
ч Q148K
♦ 118/138
• 138/148
* 140/148
Б
2 80 п х
X
и и
^ 60
О
р
с
гл 40 л
ИН
е ■fr ■fr О
70
50
30 20 10 0
0
500
1000 1500 Время, мин
2000
Рис. 1. Кинетические кривые накопления продукта З'-концевого процессинга, катализируемого препаратами консенсусной интегразы субтипа А штамма FSU-A (А) и интегразы субтипа В штамма НХВ-2 (Б) и их мутантными формами. Реакцию проводили при 37оС, концентрация фермента 100 нМ, концентрация и5-субстрата 3 нМ. Приведены средние значения как минимум трех независимых измерений, при которых стандартная ошибка не превышала 12%
Е138К к заменам Q148K/G140S повышало реплика-тивную способность вируса, не влияя при этом на его чувствительность к ингибиторам переноса цепи [11].
Наконец, мы обнаружили, что замена G118R вызывает резкое снижение активности обеих инте-граз - ИНА и ИНВ (рис. 1, табл. 1). Этот результат несколько противоречит данным работы [17], в которой показано, что у рекомбинантной интегразы подтипа В с заменой G118R эффективность 3'-про-цессинга снижена незначительно, а двойные мутанты G118R/E138K и G118R/H51Y обладают даже несколько большей активностью в этой реакции, чем фермент дикого типа. В наших условиях внесение вторичной замены Е138К также приводило к повышению активности как мутанта ИНАШ18Н, так и мутанта ИНВШ18Н, однако активность всех ферментов, несущих замену G118R, была существенно ниже, чем у исходных интеграз ИНА и ИНВ (рис. 1, табл. 1). Указанное противоречие может объясняться разными условиями проведения 3'-процессинга, в частности, длиной ДНК-субстрата интегразы: мы работали со стандартным 21-звенным ДНК-дуплексом, а в работе [17] был использован 32-звенный субстрат.
Таблица 1. Начальные скорости и эффективность З'-процессинга, катализируемого интегразами ИНА и ИНВ и их мутантными формами
Мутация V0, пМ/мин* Относительная эффективность реакции,%**
ИНа ИНн ИНЛ ИНн
Дикий тип 10.1 ± 0.29 6.4 ± 0.19 100 100
G118R 0.98 ± 0.074 0.79 ± 0.15 21 20
E138K 4.8 ± 0.24 4.6 ± 0.9 69 76
G118R/E138K 2.6 ± 0.37 1.4 ± 0.18 24 24
G140S 4.3 ± 0.21 4.8 ± 0.75 58 51
Q148K 0.90 ± 0.16 0.65 ± 0.35 6 13
E138K/Q148K 1.2 ± 0.31 0.7 ± 0.61 13 11
G140S/Q148K 2.62 ± 0.11 1.3 ± 0.23 25 15
'Приведены средние значения как минимум трех независимых измерений со стандартным отклонением. ''Приведена относительная эффективность реакции через 1500 мин, эффективность в случае исходной интегразы принята за 100%.
Влияние мутаций на каталитическую активность интеграз ИНА и ИНВ в реакции переноса цепи
Мы также изучили влияние выбранных мутаций на вторую реакцию, катализируемую интегразой -перенос цепи, в результате которой в условиях in vitro З'-процессированный ДНК-субстрат встраивается либо в себя самого (гомологичный перенос цепи),
либо в любую другую случайную нуклеотидную последовательность или плазмиду (гетерологичный перенос цепи). В качестве ДНК-субстрата использовали дуплекс и5В-2/и5А. При гетерологичном переносе цепи в качестве мишени был использован синтетический 36-звенный олигонуклеотидный дуплекс. Положение места встраивания субстрата не зави-
сит от последовательности ДНК-мишени, поэтому при анализе продуктов реакции детектируются продукты разной длины.
Как уже было установлено нами ранее [22], в реакции переноса цепи активность ИНА несколько выше, чем ИНВ (рис. 2). Также можно заметить разницу в профиле продуктов интеграции как при гомологичном (рис. 2А), так и при гетерологичном переносе цепи (рис. 2Б).
Наименее активными в реакции переноса цепи, как и в реакции З'-процессинга, в обоих субтипах оказались мутанты, несущие замену Q148K. Эффективность гомологичного переноса цепи у них была снижена примерно до 5% от уровня фермента дикого типа. Неожиданно к значительному снижению эффективности реакции привела замена G140S (рис. 2А,В). Этот эффект мы наблюдали у ферментов обоих субтипов, ИНАШ40 и ИНВШ40, хотя данные о негативном эффекте замены G140S на активность рекомбинантной интегразы не опубликованы, а у вируса субтипа В, содержащего эту замену, выявлено лишь незначительное снижение интеграционной и репликативной способностей [7, 8]. Несмотря на негативное влияние замены G140S, ее комбинация с мутацией Q148K приводила к увеличению эффективности реакции, и белки ИНАШ408/да48К и ИНВШ408/ Q148K были активнее, чем ИНА«148А и ИНВ«148К (рис. 2В). Некоторый компенсаторный эффект вызывала также и мутация E138K. Причем можно заметить, что у ИНА компенсаторный эффект был несколько сильнее при вторичной замене G140S, а у ИНВ -E138K (рис. 2В). Интересно, что единичная замена Е138К заметно повышала эффективность реакции для интеграз обоих субтипов (рис. 2В). В целом же, первичная мутация Q148K и ее компенсаторные замены G140S и E138K одинаково влияли на активность ИНА и ИНВ как в 3'-процессинге, так и в переносе цепи. Таким образом, различия в первичной структуре интеграз не влияют на ферментативные свойства этой группы мутантов in vitro.
Интересно, что влияние другой группы мутаций -G118R и G118R/E138K - на активность интеграз разных субтипов в реакции переноса цепи различалось. Интеграза ИНА оказалась более чувствительной к замене остатка G118, чем фермент субтипа В: у фермента ИНАШ18Н эффективность гомологичного
переноса цепи была резко снижена, а у ИНВ
сУ-
на активность мутанта ИНВ°118Н, в то время как двойной мутант ИНА°118Н/Е138К был более активен, чем несущий одиночную замену ИНА°118Н. Тем не менее эффективность реакции гомологичного переноса цепи, катализируемой ИНА°118Н/Е138К, достигала только 23% от уровня реакции, катализируемой исходной ИНА (рис. 2В).
Ранее было показано, что замена 0118И в интегра-зе субтипа В приводит к существенному (более 90%) снижению ее активности в реакции гетерологичного переноса цепи [17]. Двойная мутация 0118Н/Е138К приводила к частичному восстановлению активности, но она не достигала и 50% от уровня активности интегразы дикого типа [17]. Аналогичные эффекты наблюдались и для вируса субтипа В, содержащего указанные мутации: замена 0118И вызывала значительное падение репликативной и интеграционной способностей вируса, а добавление мутации Е138К приводило к их частичному восстановлению [18]. Проведенное нами изучение влияния замены 0118И на способность ИНА и ИНВ осуществлять гетероло-гичный перенос цепи показало, что как и при гомологичном переносе влияние этой замены на ферменты разных субтипов ВИЧ-1 различается (рис. 2Б). Введение мутации 0118И снижало активность ИНВ приблизительно на 50%, в то время как соответству-
ющий мутант ИНА
1 был практически неактивным.
щественно не изменилась (рис. 2А,В). Необходимо также отметить, что в случае ИНА мутация 0118И приводила к смене точек интеграции, и вместо большого набора продуктов, наблюдаемого для исходной ИНА, у мутанта ИНА°118Н четко выделялись только два доминирующих продукта (рис. 2А). Добавление компенсаторной мутации Е138К практически не влияло
Вторичная замена E138K оказывала компенсаторный эффект только на интегразу субтипа В: активность двойного мутанта ИНВ°118Н/Е138К была несколько выше, чем фермента с одиночной заменой ИНВЙ118Е (рис. 2Б). Эти результаты согласуются с данными работы [17], поскольку разницу в активности мутант-ных форм интегразы ИНВ можно объяснить различиями в условиях проведения реакции. Оба мутанта субтипа А, ИНа°118Е и ИНА°118Е/Е138К, имели одинаково низкую активность, хотя внесение единичной замены E138K приводило к повышению эффективности ге-терологичного переноса интегразами обоих субтипов (рис. 2Б).
Уменьшение интегрирующей способности мутанта G118R в субтипе В ранее связали со снижением способности комплекса интегразы с ДНК-субстратом связывать ДНК-мишень [17]. В результате природного полиморфизма в положении 119 ИНВ содержит Ser, а ИНА - Pro [21]. Отметим, что в ВИЧ-1 подтипа С, в лекарственно устойчивых штаммах которого чаще всего обнаруживается мутация G118R [16, 18], также присутствует Ser119. Остаток пролина увеличивает жесткость пространственной структуры ин-тегразы в районе активного центра (Asp116 входит в каталитическую триаду). Очевидно, совокупность мутации G118R с Pro119 влияет на способность инте-гразы субтипа А взаимодействовать с ДНК-мишенью
G118R
л
ИН
wt G118R Е138К 118/138 G140S Q14SK 140/148 138/148
время
Продукты реакции переноса цепи
19-мер. субстрат
ИН
wt G118R Е138К 118/138 G140S Q148K 140/148 138/148
время
Продукты реакции переноса цепи
19-мер. субстрат
*
I'ttiffttf
пшшшз
Ii
ИН
мишень интеграции
Продукты реакции переноса цепи
19-мер. субстрат
интеграции
Продукты реакции переноса цепи
ИН
+ — + + — + + — + + — + +
19-мер. субстрат
ИН
138/148 140/148 Q148K G140S 118/138 Е138К G118R wt
ИН
0 25 50 75 100 125 150 175
175 150 125 100 75 50 25 0
Относительная эффективность переноса цепи, %
Б
мишень
В
Рис. 2. Реакция переноса цепи, катализируемая мутантными формами интегразы ВИЧ-1 субтипов А и В. Продукты реакции анализировали электрофорезом в 20% ПААГ в денатурирующих условиях. Л — реакцию гомологичного переноса цепи проводили с использованием 100 нМ интегразы и 10 нМ субстрата U5B-2/U5A в течение 2, 4, 6 ч при 37°С. Б - реакцию гетерологичного переноса цепи проводили с использованием 100 нМ интегразы, 2 нМ субстрата U5B-2/U5A (преинкубация 30 мин при 25°С) и 8 нМ 36-звенной ДНК-мишени в течение 2 ч при 37°С. В - относительная эффективность гомологичного переноса цепи, катализируемого мутантными формами интеграз, эффективность реакции для ИНА и ИНВ принята за 100%. Представлены средние значения со стандартным отклонением, полученные по крайней мере из трех независимых экспериментов
Таблица 2. Ингибирование реакции гомологичного переноса цепи, катализируемой интегразами ВИЧ-1 субтипов А и В и их мутантными формами, ралтегравиром (RAL), элвитегравиром (EVG) и XZ-259
Мутация Ингибирующая активность, IC50* (нМ), и изменение IC50 мутантов по сравнению с диким типом (FC)
ИНЛ ИНн
RAL EVG XZ-259 RAL EVG XZ-259
IC50 FC IC50 FC IC50 FC IC50 FC IC50 FC IC50 FC
Дикий тип 5 ± 2 1 17 ± 5 1 40 ± 15 1 7 ± 3 1 25 ± 10 1 65 ± 10 1
G118R 12 ± 5 2.4 45 ± 10 2.6 40 ± 10 1 30 ± 10 4.3 90 ± 30 3.6 80 ± 20 1.2
E138K 7 ± 3 1.4 35 ± 5 2 50 ± 15 1.25 7 ±5 1 20 ± 8 0.8 70 ± 10 1
G118R/E138K 7 ± 3 1.4 40 ± 10 2.4 30 ± 10 0.75 25 ± 8 3.6 50 ± 15 2 80 ± 15 1.2
G140S 15 ± 5 3 300 ± 50 18 150 ± 50 3.8 35 ± 15 5 200 ± 80 8 150 ± 50 2.3
Q148K 400 ±100 80 700 ± 80 41 350 ±100 8.8 1100 ± 250 157 1000 ± 200 40 600 ± 100 9.2
E138K/Q148K 350 ± 80 70 650 ± 100 38 200 ± 50 5 500 ± 150 71 600 ± 150 24 500 ± 200 7.7
G140S/Q148K 400 ±150 80 450 ±150 26 600 ±150 15 1000 ± 200 200 850 ± 200 34 850 ± 100 13
'Результат не менее трех независимых экспериментов.
в значительно большей степени, чем сочетание G118R с Ser119. В результате ИНА, содержащая замену G118R, существенно менее активна в реакциях переноса цепи, чем соответствующий мутант ИНВ.
Влияние мутаций на чувствительность интеграз ИНА и ИНВ к ингибиторам переноса цепи
Нами изучено влияние выбранных мутаций лекарственной устойчивости на чувствительность инте-граз к трем ингибиторам переноса цепи: RAL, EVG и новому ингибитору XZ-259, производному дигидро-1Н-изоиндола, с биохимической и антивирусной активностью, сравнимой с RAL [23]. Определена концентрация ингибитора, необходимая для снижения на 50% активности интегразы (IC) в реакции гомологичного переноса цепи (табл. 2; увеличение IC50 отражает снижение чувствительности фермента к ингибитору).
Оказалось, что интегразы обоих субтипов имеют сравнимые значения IC50 в отношении RAL и EVG, однако в среднем чувствительность ИНА к обоим ингибиторам несколько выше, что коррелирует с данными, полученными нами ранее [22]. Чувствительность ИНА к новому ингибитору - XZ-259, также была несколько выше, чем ИНВ; при этом значение IC50 для ИНВ (65 нМ, табл. 2) хорошо согласуется с данными [23] (77 нМ).
При анализе влияния внесенных мутаций на чувствительность интегразы к ингибиторам удобно оперировать значениями FC, показывающими во сколько раз изменяется величина IC50 у мутантов по сравнению с диким типом или, иными словами, насколько мутантные формы более устойчивы к ингибиторам, чем исходный фермент. Анализ FC семейства белков, содержащих первичную замену
Q148K (ИН«148К, ИНЕ138К/«148К и ИН°1408/«148К), показал, что устойчивость мутантных форм интеграз обоих подтипов к EVG возрастает сравнимым образом (табл. 2). Что касается RAL, то он в 2 раза лучше ин-гибировал интегразы субтипа А с заменами Q148K и G140S/Q148K, чем соответствующие варианты ИНВ. Компенсаторная мутация Е138К практически в 2 раза снижала устойчивость ИНВда48К к RAL и EVG, не оказывая при этом заметного влияния на устойчивость мутанта ИНАда48К. Надо также отметить, что чувствительность к ингибитору XZ-259 обоих мутантов Q148K оказалась существенно выше, чем к EVG и особенно к RAL, что в случае интегра-зы субтипа В соответствует ранее полученным данным [23]. Интересно, что вторичная замена Е138К несколько повышала чувствительность мутантов ИНа«148К и ИНВд148К к XZ-259, в то время как дополнительная замена G140S снижала ее (табл. 2).
Анализ FC семейства белков с заменами G118R и G118R/E138K выявил незначительное снижение чувствительности интеграз обоих субтипов к RAL и EVG (табл. 2). При этом единичная мутация G118R несколько сильнее снижала чувствительность фермента субтипа В, чем субтипа А (табл. 2). Интересно, что компенсаторная замена Е138К уменьшала возникающую резистентность (табл. 2). Важно также отметить, что к ингибитору XZ-259 устойчивости вообще не возникало. В целом наши результаты хорошо коррелируют с опубликованными данными. Так, изо-лят ВИЧ-1 субтипа CRF02_A/G, содержащий замену G118R в гене интегразы, оказался резистентным (FC > 100) ко всем разрешенным к терапевтическому применению ингибиторам интегразы: RAL, EVG и DTG [15]. В то же время у ВИЧ-1 субтипа В (клон pNL4-3), в геном которого была введена эта мута-
ция, устойчивость к этим ингибиторам была крайне незначительной (FC = 3.1 для EVG, 8.2 для RAL и 10 для DTG) [15]. Таким образом, наша работа подтверждает неоднородность эффекта первичной мутации G118R на лекарственную устойчивость ВИЧ-1 разных субтипов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Нами проведено первое систематическое исследование ферментативных свойств вариантов консен-сусной интегразы ВИЧ-1 субтипа А штамма FSU-A, доминирующего на территории бывшего Советского Союза, с мутациями G118R и Q148K, вызывающими устойчивость вируса к ингибиторам переноса цепи. Мы показали, что чувствительность интеграз субтипа А штамма FSU-A к разрешенным к терапевтическому применению ингибиторам RAL и EVG, а также к новому ингибитору XZ-259 несколько выше, чем у фермента субтипа В. Обнаружено, что ассоциированная с устойчивостью к RAL и EVG первичная мутация Q148K вызывает резкое снижение активности интегразы субтипа А, которое частично компенсируется за счет вторичных мутаций E138K и G140S. Аналогичная зависимость наблюдалась и для инте-гразы субтипа В. В то же время первичная мутация G118R снижала интеграционную активность фермента субтипа A значительно сильнее, чем интегразы субтипа В штамма HXB-2. Это может быть связано
с природным полиморфизмом интегразы, в частности с присутствием Pro119 в ИНА вместо Ser119 в ИНВ. Можно предположить, что замена Ser119Pro, приводящая к более жесткой конформации активного центра интегразы субтипа A, обеспечивает более высокую активность этого фермента, но при этом снижает его способность адаптировать активный центр к мутации G118R. Сниженная мутациями лекарственной устойчивости активность рекомбинантной интегразы обычно соответствует пониженной репликативной способности мутантного вируса, в силу этого можно ожидать появления и закрепления лекарственно устойчивых вариантов FSU-A, несущих первичную мутацию Q148K и компенсаторные мутации E138K и/или G140S, в то время как появление и закрепление лекарственно устойчивых вариантов FSU-A с заменой G118R представляется маловероятным. •
Мы благодарим д-ра Xue Zhi Zhao (Chemical Biology Laboratory, Center for Cancer Research, Frederick National Laboratory, NIH, USA) за любезно предоставленный ингибитор XZ-259.
Работа поддержана РФФИ (гранты № 13-04-91440-НИЗ_а, 13-04-01523а, 14-04-00833_а, 14-04-32086_мол-а ) и программой развития Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (ПНР 5.13).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Quashie P.K., Mesplède T., Wainberg M.A. // Curr. Opin. Infect. Dis. 2013. V. 26. № 1. P. 43-49.
2. Malet I., Delelis O., Valantin M.A., Montes B., Soulie C., Wirden M., Tchertanov L., Peytavin G., Reynes J., Mouscadet J.-F., et al. // Antimicrob. Agents. Chemother. 2008. V. 52. № 4. P. 1351-1358.
3. Charpentier C., Karmochkine M., Laureillard D., Tisserand P., Bélec L., Weiss L., Si-Mohamed A., Piketty C. // HIV Med.
2008. V. 9. № 9. P. 765-770.
4. Cooper D.A., Steigbigel R.T., Gatell J.M., Rockstroh J.K., Katlama C., Yeni P., Lazzarin A., Clotet B., Kumar P.N., Eron J.E., BENCHMRK Study Teams, et. al. // N. Engl. J. Med. 2008. V. 359. № 4. P. 355-365.
5. Goethals O., Clayton R., van Ginderen M., Vereycken I., Wagemans E., Geluykens P., Dockx K., Strijbos R., Smits V., Vos A., et al. // J. Virol. 2008. V. 82. № 21. P. 10366-10374.
6. Stanford HIV Drug Resistance Database // http://hivdb. stanford.edu/DR/INIResiNote.html
7. Nakahara K., Wakasa-Morimoto C., Kobayashi M., Miki S., Noshi T., Seki T., Kanamori-Koyama M., Kawauchi S., Suyama A., Fujishita T., et al. // Antiviral Res. 2009. V. 81. № 2. P. 141-146.
8. Delelis O., Malet I., Na L., Tchertanov L., Calvez V., Marcelin A.G., Subra F., Deprez E., Mouscadet J.-F. // Nucl. Acids Res.
2009. V. 37. № 4. P. 1193-1201.
9. Abram M.E., Hluhanich R.M., Goodman D.D., Andreatta K.N.,
Margot N.A., Ye L., Niedziela-Majka A., Barnes T.L., Novikov N., Chen X., et al. // Antimicrob. Agents. Chemother. 2013. V. 57. № 6. P. 2654-2663.
10. Fransen S., Gupta S., Danovich R., Hazuda D., Miller M., Witmer M., Petropoulos C.J., Huang W. // J. Virol. 2009. V. 83. № 22. P. 11440-11446.
11. Goethals O., Vos A., van Ginderen M., Geluykens P., Smits V., Schols D., Hertogs K., Clayton R. // Virology. 2010. V. 402. № 2. P. 338-346.
12. Canducci F., Ceresola E.R., Boeri E., Spagnuolo V., Cossarini F., Castagna A., Lazzarin A., Clementi M. // J. Infect. Dis. 2011. V. 204. № 11. P. 1811-1815.
13. Underwood M.R., Johns B.A., Sato A., Martin J.N., Deeks S.G., Fujiwara T. // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2012. V. 61. № 3. P. 297-301.
14. Kobayashi M., Yoshinaga T., Seki T., Wakasa-Morimoto
C., Brown K.W., Ferris R., Foster S.A., Hazen R.J., Miki S., Suyama-Kagitani A., et al. // Antimicrob. Agents. Chemother.
2011. V. 55. № 2. P. 813-821.
15. Malet I., Gimferrer Arriaga L., Artese A., Costa G., Parrotta L., Alcaro S., Delelis O., Tmeizeh A., Katlama C., Valantin M.A. // J. Antimicrob. Chemother. 2014. V. 69. № 8. P. 2118-2122.
16. Quashie P.K., Mesplede T., Han Y.S., Oliveira M., Singhroy
D.N., Fujiwara T., Underwood M.R., Wainberg M.A. // J. Virol.
2012. V. 86. № 5. P. 2696-2705.
17. Quashie P.K., Mesplede T., Han Y.S., Veres T., Osman N., Hassounah S., Sloan R.D., Xu H.T., Wainberg M.A. //
Antimicrob. Agents. Chemother. 2013. V. 57. № 12. P. 62236235.
18. Bar-Magen T., Sloan R.D., Donahue D.A., Kuhl B.D., Zabeida A., Xu H., Oliveira M., Hazuda D.J., Wainberg M.A. // J. Virol. 2010. V. 84. № 18. P. 9210-9216.
19. Malet I., Fourati S., Charpentier C., Morand-Joubert L., Armenia D., Wirden M., Sayon S., Van Houtte M., Ceccherini-Silberstein F., Brun-Vézinet F., et al. // J. Antimicrob. Chemother. 2011. V. 66. № 12. P. 2827-2830.
20. Лаповок И.А., Лага В.Ю., Васильев А.В., Саламов Г.Г., Ка-зеннова Е.В., Матковский И.А., Мохний Г.А., Мельник Т.А., Бобкова М.Р. // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессия. 2012. Т. 4. № 2. С. 73-81.
21. Krotova O., Starodubova E., Petkov S., Kostic L., Agapkina
J., Hallengard D., Viklund A., Latyshev O., Gelius E., Dillenbeck T., et al. // PLoS One. 2013. V. 8. № 5. e62720.
22. Shadrina O., Krotova O., Agapkina J., Knyazhanskaya E., Korolev S., Starodubova E., Viklund A., Lukashov V., Magnani M., Medstrand P., et al. // Biochimie. 2014. V. 102. P. 92-101.
23. Métifiot M., Maddali K., Johnson B.C., Hare S., Smith S.J., Zhao X.Z., Marchand C., Burke T.R. Jr., Hughes S.H., Cherepanov P., et al. // ACS Chem. Biol. 2013. V. 8. № 1. P. 209-217.
24. Leh H., Brodin P., Bischerour J., Deprez E., Tauc P., Brochon J.C., LeCam E., Coulaud D., Auclair C., Mouscadet J.F. // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 9285-9294.
25. Marinello J., Marchand C., Mott B.T., Bain A., Thomas C.J., Pommier Y. // Biochemistry. 2009. V. 47. № 36. P. 9345-9354.
