CC BY
30
УДК 579.66:547.94
Л. Х. Халимова (к.т.н., доц.), А. И. Мубараков (асп.), Н. В. Анкудинова (студ.), Н. И. Петухова (к.биол.н., доц.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Поиск клеточных катализаторов для энантиоселективных биотрансформаций с участием азотсодержащих органических соединений
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, е-mail: [email protected]
L. Kh. Khalimova, A. I. Mubarakov, N. V. Ankudinova, N. I. Petukhova, V. V. Zorin
Search of cell catalysts for enantioselective biotransformation of nitrogen-containing organic compounds
Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str, 450062, Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
Исследованы процессы аминолиза сложных эфиров (глицидилметакрилата и додецил-4-аце-тата) циклогексиламином в изооктане, а также реакция ацилирования 2-аминобутана различными донорами ацильных групп (винил-ацетатом, этилацетатом, бутилацетатом) в гексане и изооктане в присутствии обработанных ацетоном клеток микроорганизмов. Найдены биокатализаторы, конвертирующие субстраты с кинетикой, характерной для высокоэнантиоселек-тивных процессов кинетического разделения рацемических соединений.
Ключевые слова: аминолиз; липазы; микроорганизмы; парциальное ацилирование; энантио-селективный биокатализ.
The aminolysis of esters (glycidyl methacrylate and dodecyl-4-acetate) by cyclohexylamine in isooctane was searched as well as the reaction of acylation of 2-aminobutane by different donors of acyl groups (acetate, ethyl acetate, butyl acetate) in hexane and isooctane in the presence of acetone-treated microbial cells. Biocatalysts, which convert substrates with the kinetics typical to a highly enantioselective processes of kinetic resolution of racemic compounds, were found.
Key words: aminolysis; lipase; microorganisms; enantioselective biocatalysis; partial acylation.
Энантиоселективные биокаталитические процессы с применением липаз, эстераз и клеток микроорганизмов широко используются для кинетического разделения рацемических смесей хиральных спиртов, кислот, сложных эфиров и позволяют получать высокочистые синтоны практически важных соединений 1-3.
Биотрансформация азотсодержащих органических соединений является новым перспективным направлением в энантиоселективном синтезе синтонов лекарственных препаратов и средств защиты растений с помощью липоли-тических ферментов. В частности, липазы микроорганизмов могут эффективно осуществлять парциальное ацилирование рацемических аминов и энантиоселективный аминолиз раце-
Дата поступления 10.10.10
мических смесей сложных эфиров. При этом в процессах аминолиза липазы могут проявлять более высокую селективность, чем в альтернативных процессах кинетического разделения сложных эфиров (гидролизе или алко-голизе)4-8.
Ранее нами на основе клеток бактерий были разработаны биокатализаторы, способные осуществлять энантиоселективный гидролиз emop-бутилацетата (Bacillus sp. 77-1) и ацилирование гептанола-2 (Pseudomonas spp. 59-3, 77-33, 77-47, Bacillus sp. 77-1) с высокой селективностью и практически количественным выходом 9'10. В настоящей работе изучена возможность использования этих биокатализаторов в процессах аминолиза рацемических
Н2О
СНзСООН
Н ОАс
O
\ + Н2О
клет ки микроорганизмов
буфер-ацетон (20%)
клет ки микроорганизмов
изооктан
O
O
OH + HO-
смесей сложных эфиров (додецил-4-ацетата и глицидилметакрилата) циклогексиламином и парциального ацилирования рацемического 2-аминобутана винилацетатом.
Установлено, что глицидилметакрилат и додецил-4-ацетат гидролизуются в присутствии данных биокатализаторов практически полностью, т. е. неселективно, а реакции алко-голиза этих эфиров бутанолом в изооктане не протекают (табл. 1).
В отличие от этих реакций при аминолизе додецил-4-ацетата циклогексиламином было обнаружено, что все исследуемые биокатализаторы конвертируют субстрат, внесенный в реакционную смесь в концентрации 5 г/л, на 21—36 % за 48 ч (табл. 1). При этом наиболее активный катализатор Bacillus sp. 77-1 при более низкой концентрации субстрата (2.5 г/л) конвертировал додецил-4-ацетат на 48%.
Обнаружено, что данный биокатализатор способен также осуществлять аминолиз глици-дилметакрилата циклогексиламином в изоок-тане, так же конвертируя субстрат на 50% независимо от начальной концентрации субстрата, что указывает на наличие у него энантиосе-лективных свойств (табл. 1).
Кинетика превращения эфиров (начальная концентрация — 5 г/л) в процессах ами-нолиза в присутствии клеток Bacillus sp. 77-1 имеет вид, характерный для высокоэнантиосе-лективных процессов кинетического разделения рацемических органических соединений (рис. 1). Установлено, что глицидилметакри-лат подвергается аминолизу значительно быстрее, чем додецил-4-ацетат. Конверсия этого эфира достигает 50%-го уровня в течение 20 ч.
Таблица 1
Конверсия додецил-4-ацетата и глицидилметакрилата в процессах гидролиза, алкоголиза и аминолиза в присутствии клеточных биокатализаторов
Процесс Субстрат, г/л Конверсия,%
77-1 77-33 77-47 59-3
гидролиз додецил-4-ацетата* 5 100 100 83.2 100
гидролиз глицидилметакрилата* 5 100 100 100 100
алкоголиз додецил-4-ацетата бутанолом** 5 0 0 0 0
алкоголиз глицидилметакрилата бутанолом** 5 0 0 0 0
аминолиз додецил-4-ацетата циклогексиламином*** 2.5 48 - - -
5 36 23 30 21
аминолиз глицидилметакрилата циклогексиламином*** 2.5 50 - - -
5 51 - - -
* гидролиз осуществляли в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 20% ацетона, 5 г/л субстрата (додеканил-4-ацетата или глицидилметакрилата), 50 г/л биокатализатора, ¿=30 оС в течение 24 ч; ** алкоголиз проводили в изооктане, содержащем 5 г/л субстрата (додеканил-4-ацетата или глицидилметакрилата), 10 г/л бутанола, 50 г/л биокатализатора, Ь= 30 оС в течение 48 ч; *** аминолиз осуществляли в изооктане, содержащем 5 г/л субстрата (додеканил-4-ацетат или глицидилметакрилат), 6 г/л циклогексиламина, 50 г/л биокатализатора, Ь=30 оС в течение 48 ч.
^ ^NH2
^—NHAc
Н ОАс
O
NH2
клет ки микроорганизмов изооктан
клет ки микроорганизмов
ОН
изооктан
O
NH
O
HO
+
+
60 50 £ 40 I 30
И X
И 20 10 0
- глицидилметакрилат
- додецил-4-ацетат
20
40 60 Время, ч
100
Рис. 1. Изменение степени превращения глицидил-метакрилата и додецил-4-ацетата в процессах ами-нолиза циклогексиламином в изооктане в присутствии клеток Bacillus sp. 77-1 во времени (эфир — 5 г/л, циклогексиламин — 6 г/л, биокатализатор — 50 г/л, t=30 °С)
Кинетика, типичная для высокостереосе-лективных процессов, проявляется также в случае биокатализаторов, полученных на основе штаммов Pseudomonas spp. 59-3 и 77-33 в процессе ацилирования 2-аминобутана винил-ацетатом в изооктане (рис. 2). Клетки бактерий Bacillus sp. 77-1, так же, как и Pseudomonas sp. 77-47, оказались неэффективными, так как конвертировали субстрат только на 27—30 %, после чего реакция останавливалась, вероятно, из-за ингибирования катализатора.
NH2
OAc
NHAc
Обнаружено, что при использовании в качестве донора ацильной группы этилацета-та наблюдается резкое снижение конверсии 2-аминобутана, а в случае бутилацетата реакция не протекает. Замена растворителя (изоок-
тана) на гексан практически не оказывает влияния на активность исследуемых биокатализаторов.
Исследование зависимости глубины превращения 2-аминобутана в присутствии клеток Pseudomonas sp. 77-33 и 59-3 от его начальной концентрации показало, что его конверсия не зависит от количества вносимого в реакционную смесь субстрата (табл. 2).
Таблица 2
Конверсия ацилирования 2-аминобутана винилацетатом в изооктане при различных начальных концентрациях субстрата (S0)
Штаммы Конверсия, %
So = 5 г/л So = 10 г/л So = 15 г/л
Pseudomonas sp. 59-3 50 49 50
Pseudomonas sp. 77-33 51 48 51
Условия реакции: t=30 °С; 2-аминобутан — 515 г/л; винилацетат — 10 г/л; биокатализатор -15 г/л); 28 ч.
<Й 40 -
-Pseudomonas sp. 77-47 -Pseudomonas sp. 77-33 - Bacillus sp. 77-1 -Pseudomonas sp. 59-3
0 5 10 15 20 25 30
Время, ч
Рис. 2. Кинетика ацилирования 2-аминобутана винилацетатом в изооктане (t=30 оС; биокатализатор — 15 г/м; 2-аминобутан — 10 г/л; винилацетат — 10 г/л)
Таким образом, в результате исследования найдены биокатализаторы (клетки бактерий Bacillus sp. 77-1, Pseudomonas sp. 59-3 и 77-33), перспективные для разработки методов
0
60
■О 50
к 10
0
кинетического разделения рацематов доде-канил-4-ацетата, глицидилметакрилата и 2-аминобутана с целью получения практически важных синтонов лекарственных веществ, жидких кристаллов, препаратов для агрохимии 5-12.
Экспериментальная часть
Спектры ЯМР *Н и С записывали в CDCl3 на приборе Bruker АМ-300 (рабочая частота 300 и 75.47 МГц соответственно), внутренний стандарт — ТМС. Масс-спектраль-ный анализ полученных соединений проводили на на хроматографе «Hewlett Packard 5890 Series II plus» с масс-селективным детектором «НР 5972». Использовали капиллярную колонку ULTRA-2 (5% фенилметилсиликона, длина 50м). Анализ проводили в режиме программирования температуры от 50 до 250 оС со скоростью 10 оС/мин; газ-носитель — гелий.
Микроорганизмы выращивали при 30 оС на агаризованном сусле (3 Б) в чашках Петри в течение 24—72 ч. Выращенную биомассу микроорганизмов, предварительно отмытую фосфатным буфером, трижды обрабатывали ацетоном (1:3 (об/об)): перемешивали, выдерживали 15 мин и отцентрифугировали при 6000 об/мин в течение 10 мин. Полученные обезвоженные клетки микроорганизмов высушивали при комнатной температуре.
Гидролиз додеканил-4-ацетата и глици-дилметакрилата осуществяли при 30 оС в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 20% ацетона, 5 г/л субстрата и 50 г/л биокатализатора при постоянном перемешивании в течение 24 ч.
Алкоголиз додеканил-4-ацетата и глици-дилметакрилата проводили при 30 оС в изоок-тане, содержащем 5 г/л субстрата, 10 г/л бу-танола, 50 г/л биокатализатора, при постоянном перемешивании в течение 48 ч.
Аминолиз додеканил-4-ацетата и глици-дилметакрилата выполняли при 30 оС в изоок-тане, содержащем 2.5 или 5 г/л субстрата, 6 г/л, циклогексиламина, 50 г/л биокатализатора при постоянном перемешивании в течение 48 ч.
Ацилирование 2-аминобутана осуществляли при 30 оС в органическом растворителе (гексане или изооктане), содержащем 5.0— 15.0 г/л субстрата, 10 г/л ацилирующего агента (винилацетата, этилацетата или бутилацета-та), 15 г/л биокатализатора при перемешивании (180 об./мин) в течение 28 ч.
Концентрацию субстрата определяли в предварительно осветленных центрифугированием (15 мин при 6000 об./мин) пробах методом ГЖХ на хроматографе ЛХМ-8МД с пламенно-ионизационным детектором. Режим анализа: колонка — 3000 х 3 мм 5% SE-30 на хроматоне N-AW, расход газа-носителя (азота) — 30—37 мл/мин, расход водорода — 30 мл/мин, расход воздуха — 300 мл/мин, температура колонки — 80—140 °С, температура испарителя — 150—200 оС.
Масс-спектр продукта ацилирования 2-аминобутана соответствует спектру N-emop-бутилацетамида в библиотеке масс-спектров «NBS75K» NIST. Спектральные характеристики образующегося 4-додеканола (спектры ЯМР 1H и ЯМР 13С) соответствуют описанным
13 ^
ранее .
Глицидол, спектр ЯМР 13С ( в СЭС^, 8, м.д.): 44.3 (СН2), 52.8 (СН), 62.8 (СН2).
Литература
1. Зорин В. В., Петухова Н. И., Халимова Л. Х. // Панорама современной химии России. Современный органический синтез.— М.: Химия, 2003.- С. 439.
2. Зорин В. В., Петухова Н. И. // Панорама современной химии. Успехи органического катализа и химии гетероциклов.- М.: Химия, 2006 г.- С. 280.
3. Faber K. Biotransformation in Organic Chemistry. Springer, Berlin, 2000.- 218 p.
4. Gonzalez-Sabin J., Gotor V., Rebolledo F. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2002.- V. 13.-P. 1315.
5. Goswami A., Guo Z., Parker W.L., Patel R.N. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2005.- V. 16.-P. 1715.
6. Levy L.M., de Gonzalo G., Gotor V. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2004.- V.15.-P. 2051.
7. Pilissao C., da Graca Nascimento M. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2006.- V.17.-P. 428.
8. Oliver Torre, Gotor-Fernandez V. and Gotor V. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2006.- V. 17.-P. 860.
9. Коновалов А. А., Петухова Н. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2000.- Т. 7, №5.- С. 49.
10. Мубараков А. И., Петухова Н. И., Гареев В. М., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2000.- Т.7, №5.- С. 37.
11. Патент 01275541. Япония. 1988.
12. Kasai N., Suzuki T., Furukawa Y. // J. Mol. Catal. B: Enzym.- 1998.- V. 4.- P. 237.
13. Петухова Н. И., Шахмаев Р. Н., Халимова Л. Х., Загидуллин А. А., Сунагатуллина А. Ш., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2009.- Т. 16, №4.-С. 77.
