CC BY
35
Н.И. Петухова, Л.Х. Халимова, Л.Я. Калимуллина, В.В. Зорин
Исследование кинетики трансформации глицидилового эфира метакриловой кислоты микроорганизмами в двухфазной системе*
Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел.: (3472) 43-19-35; е-mail: bio@rusoil.net
Найдены почвенные микроорганизмы, осуществляющие трансформацию глицидилового эфира метакриловой кислоты с раскрытием оксира-нового кольца в двухфазной системе (фосфатный буфер — изооктан, 1:1). При использовании в качестве биокатализатора биомассы микроорганизмов, полученной на среде с эпихлоргидрином как индуктором эпоксидгид-ролазы, выявлены 4 штамма, конвертирующие рацемический глицидилметакрилат с кинетикой, характерной для высокоэнантиоселектив-ных процессов кинетического разделения. Показано, что на кинетику трансформации эфира оказывает природа индуктора эпоксидгидролазы. Ключевые слова: энантиоселективный биокатализ, эпоксиды, биотрансформация, микроорганизмы, эпоксидгидролаза
Оптически активные эпоксиды и вици-нальные диолы являются синтонами важнейших биологически активных веществ (лекарственных средств, антибиотиков, средств защиты растений и др.), используются для получения новых материалов. Перспективным подходом к получению высокочистых оптически активных эпоксидов является процесс кинетического разделения их рацемических смесей, катализируемый эпоксидгидролазами микроорганизмов 1-5.
Ранее нами были разработаны эффективные методы получения высокочистых энантио-меров эпихлоргидрина и 3-хлор-1,2-пропанди-ола путем кинетического расщепления рацемического эпоксида при использовании в качестве биокатализаторов бактерий Pseudomonas sp. 31-1, Pseudomonas sp. 28-12 и Rhodococcus sp. 18-19, способных ассимилировать эти хло-рорганические соединения 6-9. Показана также возможность использования ряда эпихлор-гидрин ассимилирующих штаммов для гидролиза глицидилового эфира метакриловой кислоты. При этом было обнаружено, что большинство из этих штаммов, выращенных
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 05-03-97915_агидель_а)
на среде с эпихлоргидрином как индуктором эпоксидгидролазы, гидролизуют рацемический эфир полностью. У многих штаммов, конвертирующих субстрат примерно на 50%, обнаружена эстеразная активность, гидролизующая эфирную связь в субстрате и продукте целевой трансформации. К сожалению, способность гидролизовать эфирную связь проявили и штаммы (Pseudomonas sp. 31-3, Rhodococcus sp. 18-19 и Pseudomonas sp. 2812), продуцирующие высокоселективные эпоксидгидролазы. Остальные штаммы (1543, 18-10, 18-25, 20-20 и 20-24), осуществляли гидролиз глицидилового эфира метакриловой кислоты недостаточно селективно.
O
OH
OH
O
O
Дата поступления 20.02.06
Низкая селективность клеток микроорганизмов в процессе гидролиза эпоксидов может быть обусловлена функционированием нескольких изоферментов, проявляющих эпок-сидгидролазную активность, отличающиеся энантиоселективностью с противоположной направленностью 10.
Недавно было показано, что энантиосе-лективность гидролиза эпоксидов с помощью клеточных катализаторов может быть существенно увеличена при использовании двухфазных систем вода — неполярный органичес-11
кий растворитель .
Позитивное действие органического растворителя может быть связано с уменьшением активности изофермента, снижающего селективность процесса. Кроме того, можно полагать, что в присутствии органического растворителя может снижаться скорость неферментативного гидролиза оксиранового кольца, также приводящего к снижению оптической чистоты продукта биотрансформации. Однако, нельзя исключать, что органические растворители могут быть токсичны и для целе-
вых эпоксидгидролаз, и могут снижать селективность трансформации.
Вместе с тем, реализация процесса в присутствии органической фазы может способствовать не только возрастанию селективности процесса, но и увеличению его продуктивности 11, поскольку в двухфазных системах может существенно возрастать скорость трансформации липофильных соединений 12.
В связи с этим в настоящей работе была исследована трансформация глицидилового эфира метакриловой кислоты клетками микроорганизмов в двойной системе буфер — изооктан (1:1). Объектами исследования служила группа эпихлоргидрин ассимилирующих микроорганизмов, в которую входили штаммы, трансформирующие эфир на 45—100 %, не обладающие эстеразной активностью. В качестве биокатализатора использовали биомассу микроорганизмов, выращенную на панкреатическом гидролизате рыбной муки, содержащем 0.5—1 г/л эпихлоргидрина как потенциального индуктора эпоксидгидролазы.
В результате исследования были обнаружены 14 штаммов, активно гидролизующие эпоксидную группу эфира в двухфазной системе (табл.). Штаммы 18-10, 15-43 и 20-24, для которых ранее в буфере была показана конверсия субстрата около 50%, в двухфазной системе работали очень медленно.
Таблица
Конверсия глицидилового эфира метакриловой кислоты в двухфазной системе буфер -изооктан (1:1) микроорганизмами Условия реакции: 0.05 М фосфатный буфер (рН 7.0) - 1.0 мл, изооктан - 1.0 мл, субстрат -2.0 г/л, биомасса - 2.0 - 3.0 мг(асв)/мл, температура - 30 оС
Штаммы Конверсия, %
4 ч 6 ч
15-4 100 -
28-22 100 -
28-9 100 -
18-22 100 -
41-4 100 -
18-16 100 -
50-20 100 -
30-6 86 100
30-5 78 94
20-14 49 63
18-25 41 53
18-31 47 50
20-18 38 43
20-20 42 48
Потенциально селективные свойства в исследуемых условиях обнаружили только штаммы 18-25, 18-31, 20-18 и 20-20 (конверсия около 50%). Большинство же штаммов транс-
формировало эпоксид полностью, что указывает на отсутствие селективных свойств у данных биокатализаторов (табл.).
Однако, известно, что эпоксидгидролазы могут обладать не только селективными свойствами, но и региоспецифичностью. Это позволяет в ряде случаев с помощью микроорганизмов осуществлять энантиоконвергентный гидролиз эпоксидов, в процессе которого один из энантиомеров рацемического субстрата превращается в оптически активный диол с сохранением конфигурации, а второй энантиомер эпоксида трансформируется в тот же продукт с инверсией конфигурации 13. В этом случае также имеет место 100% конверсия субстрата.
Энантиоконвергентные свойства обнаружены у бактерий актиномицетной линии (представителей родов Rhodococcus, Streptomyces, Mycobacterium). Так, трансформацией рацемических триалкилоксиранов клетками Rhodococcus ruber (ранее идентифицированы как Nocardia sp.) или Streptomyces lavendulae получены в качестве единственного продукта гидролиза (Ю-вицинальные диолы высокой оптической чистоты (83—97 % ее) 14. На основе покоящихся клеток Rhodococcus ruber или Mycobacterium paraffinicum разработан новый каскадный метод энантиоконвер-гентного гидролиза (±)-2,3-дизамещенных цис-хлоралкилэпоксидов, завершающийся самопроизвольной внутримолекулярной гетероциклизацией хлоралкилдиолов с образованием
1,2-эпокси-3-оксигептана и 2-бутил-3-окситет-рагидрофурана 15. Этот же подход был успешно использован в хемо-энзиматическом синтезе стереоизомеров питиола — агрегационного феромона жука-короеда из рацемического сул-катола 16. Инкубацией (3К5,6Б)-6-бром-2-ме-тил-2-гептеноксида, с клетками бактерий получен (2К,5И)-питиол, с чистотой 65% de, которая после последующей хроматографической очистки может быть доведена до 98%.
Исследование основных таксономических свойств штаммов показало, что штаммы 28-22, 28-9, 18-22 и 41-4 относятся к группе актиномицетной линии. Это позволяет также рассматривать их как возможные катализаторы для получения оптически активных диолов.
Кроме того, на примере штаммов 15-4 и 18-22 было показано, что на скорость трансформации глицидилового эфира метакриловой кислоты существенное влияние оказывает природа эпоксида, используемого в качестве индуктора синтеза эпоксидгидролазы на стадии выращивания биомассы. Было обнаружено, что биомасса микроорганизмов, выращен-
ная в присутствии эпихлоргидрина, более активно трансформирует глицидиловый эфир метакриловой кислоты по сравнению с биомассой, полученной на среде с самим эфиром (рис.).
Время, час
15-4 эхг 15-4 эф
18-22 эф 18-22 эхг
Рис. Трансформация глицидилового эфира метакриловой кислоты биомассой штаммов 18-22 и 15-4, выращенной в присутствии эфира (эф) или эпихлоргидрина (эхг). Условия реакции: 0.05М фосфатный буфер (рН 7.0) — 1.0 мл, изооктан — 1.0 мл, субстрат — 2.0 г/л, биомасса — 3.0 мг(асв)/мл, температура — 30 °С
При этом в случае биомассы штамма 1822, полученной на среде с эфиром, характер изменения конверсии субстрата в процессе трансформации соответствует энантиоселек-тивному процессу. Это позволяет предполагать, что в отсутствии эпихлоргидрина у данного микроорганизма продуцируется энантио-селективная эпоксидгидролаза.
Экспериментальная часть
Микроорганизмы выращивали в течение 2 сут. при 30 оС на плотной питательной среде на основе панкреатического гидролизата рыбной муки, содержащей 0.5—1.0 г/л эпихлоргидрина в качестве индуктора.
Клетки поздней логарифмической фазы роста собирали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин и трижды промывали 0.05 М фосфатным буфером рН 7.0 от остатков среды.
Трансформацию эпоксидов покоящимися клетками микроорганизмов осуществляли в двойной системе: 0.05 М фосфатный буфер (рН 7.0) — изооктан (1:1), при постоянном перемешивании при температуре 30 оС. Концентрация биомассы исследуемых штаммов находилась на уровне 2 — 3 мг(асв)/мл. Исходная концентрация субстрата (эпоксида) составляла — 2.0 г/л.
Концентрацию биомассы микроорганизмов оценивали измерением мутности клеточных суспензий на спектрофотометре «Specol-221» с нефелометрической приставкой при l = 520 нм.
Концентрацию глицидилового эфира метакриловой кислоты и продуктов его трансформации в реакционной смеси определяли после удаления клеток центрифугированием методом ГЖХ на хроматографе ЛХМ 8МД (пламенно-ионизационный детектор, колонка длиной 3 м с неподвижной фазой IXR (10%) на носителе Chromaton N-AW, газ-носитель — азот.
Идентификацию продуктов трансформации исследуемых соединений осуществляли методами хроматомасс-спектрометрии на хроматографе «Hewlett Paccard 5890 Series II plus» с масс-селективным детектором «HP 5972».
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Литература
Faber K. Biotransformations in Organic Chemistry.— Berlin: Springer, 1997.
Archelas A., Furstoss R. // TIBTECH.— 1998.— V. 16.- P. 108.
Weijers C.A.G.M., de Bont J.A.M. // J. Mol. Catal.- 1999.- V. 6.- P. 199.
Orru R.V.A., Faber K. // Curr. Opin. Chem. Biol.- 1999.- V. 3.- P. 16.
Archelas A., Furstoss R. // Curr. Opin. Chem. Biol.- 2001.- V. 5.- P. 112.
Zorin V.V., Petukhova N.I. / Book of Abstracts of 9th Meeting on Stereochemystry.- Prague, 2001.- P. 215.
Петухова Н.И., Халимова Л.Х., Зорин В.В. / В кн.: Перспективные процессы и продукты малотоннажной химии.- Уфа: изд-во «Реактив», 1999.- C. 131.
Петухова Н.И., Халимова Л.Х., Митрофанов Д.В., Гареев В.М., Зорин В.В. // Баш. хим. ж.- 2000.- T. 7.- C. 43.
Халимова Л.Х. / Дис. канд. техн. наук.-УГНТУ.- Уфа, 2000.
Nakamura T., Nagasawa T., Yu F., Watanabe I., Yamada H. // Appl. Environ. Microbiol.-1994.- V.60.- P. 4630.
J-H. /
V. 36.-
Gong P-F, Xu Technol.- 2005.
Enzyme Microbial P. 252.
Angelova B., Schmauder H.-P.//J. Biotechnol.-1999.- V. 67.- P. 13.
Strauss U.T., Felfer U., Faber K.// Tetrahedron:Asymmetry.— 1999.— V. 10.—P.— 107.
14. Steinreiber A., Mayer S.F., Saf R., Faber K. // Tetrahedron: Asymmetry.—2001.—V. 12.—P. 1519.
15. Mayer S.F., Steinreiber A., Orru R.V.A., Faber K. //Tetrahedron: Asymmetry.—2001.—V. 12.— P. 41.
16. Steinreiber A., Edegger K., Mayer S.F., K. Faber
// Tetrahedron: Asymmetry.— 2001.—V.—12.— P. 2067.
