Поиск ингибиторов REDD1 и оценка их влияния на рост и жизнеспособность клеток лейкозов и лимфом Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

42

МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ»

А.А. Лушникова1, Л.Ф. Морозова1, А.А. Рудакова1, С.М. Андреев2, А.В. Балбуцкий1

индукция апоптоза клеток рака Почки катионными пептидами

ФГБУ«НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва, Россия; ФГБУ«ГНЦИнститут иммунологии» ФМБА России, Москва, Россия

введение. Рак почки (РП) отличается высокой моле-кулярно-генетической и клинической гетерогенностью, что значительно ухудшает прогноз и ответ на стандартную химиотерапию. Для молекулярно направленной терапии агрессивных опухолей почки перспективны катионные пептиды (КП), взаимодействующие с многофункциональными белками нуклеолином (С23) и нуклеофозмином (В23), которые высоко экспрессированы в большинстве опухолевых клеток, но не в нормальных клетках. Рецеп-торный С23 рассматривается как основная мишень для молекул КП, обогащенных остатками Arg-Lis.

Цель исследования. Изучение механизмов избирательной цитотоксичности КП на модельной перевиваемой линии Рпоч1-КК светлоклеточного РП с ранее выявленной цитогенетической поликлональностью и мутациями в генах-супрессорах VHL и TP53.

материалы и методы. Клетки (Кл) Рпоч1-КК культивировали в полной питательной среде RPMI-1640 с 10 %-ной эмбриональной телячьей сывороткой. Цитотоксичность 5 КП с разной структурой массой 1—2 кДа изучали в стандартных МТТ-тестах и микроскопически, используя флуоресцентно меченный Су5*-КП со структурной формулой RgK4K2KAC-NH2, вносимый с интервалом 2 ч в конечных концентрациях 0,5—1 мкг/мл в микроячейки с 2-суточной культурой Кл Рпоч1-КК. Контроль — морфологически нормальные фибробласты человека линии Н1036. После 2—6 ч инкубации Кл окрашивали DAPI и Хекст 33342. Для подтверждения апоптоза использовали проточную цитофлуо-риметрию. Экспрессию генов NCL/NPM и кодируемых белков С23/В23 анализировали с помощью ОТ-ПЦР, ИГХ-окрашивания стекол с суспензией Кл Рпоч1-К и вестерн-блоттинга.

результаты. Уровни экспрессии С23/В23 в Кл Рпоч1-КК выше контроля в 7,6 и 4,2 раза соответственно, что подтверждает дифференциальную экспрессию С23/В23 в опухолевых и нормальных Кл. МТТ-тест выявил высокую цитотоксичность изученных КП с разной молекулярной структурой в концентрациях 0,5—4 мкг/мл. Выживаемость клеток в 3-суточной культуре Кл после инкубации с КП снизилась до 12,9—18,4 %, в контрольных лунках — не изменилась, и цитотоксичность КП в отношении фибробластов не выявлена. Результаты вестерн-блоттинга и ОТ-ПЦР показывают, что в основе избирательной цитотоксичности изученных КП лежит конкурентное взаимодействие молекул КП с рецептор-ными С23 и В23, высоко экспрессированными в опухолевых клетках и регулирующими ключевые клеточные процессы, в том числе апоптоз, с последующим высвобождением супрес-сора р53. После инкубации с КП в Кл Рпоч1-КК наблюдалось значительное повышение экспрессии р53 и снижение уровня свободного С23. Показано также, что в апоптоз Кл Рпоч1-КК, индуцированный КП, вовлечены каспазы 3, 8 и 9.

Заключение. На модельной перевиваемой линии Рпоч1-КК показана избирательная цитотоксичность 5 низкомолекулярных КП. В механизм апоптоза вовлечены белки С23, В23 — возможные мишени пептидов, р53 и каспазы 3, 8, 9. Эти КП перспективны для предклинического исследования.

Е.C. Лылова1, А.В. Савинкова2, Л.Р. Тилова2, Е.М. Жидкова2, В.П. Максимова2, К.А. Кузин2, О.А. Власова2, К.И. Кирсанов2, А.Ю. Портянникова2, М.Г. Якубовская2, Е.А. Лесовая2,3 поиск ингибиторов REDD1 и оЦЕнкА

их влияния на рост и жизнеспособность клеток лейкозов и лимФом

1МИТХТ, Москва, Россия;

ФГБУ«НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина»

Минздрава России, Москва, Россия;

ФГБОУВО РязГМУМинздрава России, Рязань, Россия

введение. Глюкокортикоиды (GC) часто применяются в терапии онкологических заболеваний. Однако их использование ограничено возникновением побочных эффектов и развитием резистентности. Биологические эффекты GC реализуются посредством активации глюкокортикоидного рецептора (GR), который регулирует экспрессию генов путем транс-репрессии, обусловливающей терапевтическое действие GC, и транс-активации, отвечающей за побочные эффекты. Было показано, что GR-зависимый ген REDD1 (regulated in development and DNA damage response 1) имеет большое значение в развитии побочных эффектов GC. Были отобраны потенциальные ингибиторы REDD1 — антипротозойное средство эметин и ингибитор протеинкиназы CGP-60474.

Цель исследования. Оценка эффектов потенциальных ингибиторов REDD1 эметина и CGP-60474 на рост и жизнеспособность клеток лимфомы и лейкоза.

материалы и методы. Потенциальные ингибиторы REDD1 отбирали с помощью биоинформатического анализа. Их свойства оценивали на клетках острого лимфоб-ластного лейкоза СЕМ и мантийноклеточной лимфомы Granta. Клетки обрабатывали эметином или CGP-60474, затем, спустя 6 ч после обработки веществами, глюкокор-тикоидом дексаметазоном (Dex) в течение 24—72 ч. Цито-токсический эффект определяли с помощью прямого подсчета клеток. Экспрессию REDD1 оценивали с помощью количественной ПЦР после обработки клеток ингибиторами REDD1 в течение 6 ч и последующей обработки Dex в течение 6—24 ч.

результаты. Эметин и CGP-60474 не снижали цито-токсический эффект Dex на клетки обеих линий, а при определенных дозах мы наблюдали кооперативное цитотоксиче-ское действие глюкокортикоида и тестируемых соединений. В то же время эметин и CGP-60474 подавляли базальный и GC-индуцированный уровень экспрессии REDD1.

Заключение. Эметин и CGP-60474 являются ингибиторами REDD1 и не снижают цитотоксический эффект GC. Перспективным является исследование их действия на моделях лейкозов и лимфом для оценки их влияния на развитие побочных эффектов GC.

Работа поддержана грантом РНФ № 17-75-20124.

Спецвыпуск / том 17 / 2018

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ» 43

Ю.С. Маклыгина1, Г.М. Юсубалиева2, В.М. Малинников1, О.О. Красновская1, Е.К. Белоглазкина1, И.Д. Романишкин1, Е.В. Ахлюстина3, А.В. Рябова1, Д.А. Скворцов1, А.В. Бачева1, Н.В. Зык1, А.Г. Мажуга12 3 В.П. Чехонин2, В.Б. Лощенов13 новыЕ рн-чувСГвительныЕ Производные спектрально-флуоресцентный метод тиомочЕвины как диагностические идентификации и цитостатические препараты оПУХолЬАССоЦиировАнныХ макрофагов Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, ФГБУН ИОФ РАН, Москва, Россия; Москва, Россия; 2ФГБУ«НМИЦпсихиатрии и наркологии им. В.П. Сербского» 2НИТУ«МИСиС», Москва, Россия; Минздрава России, Москва, Россия; 3РХТУ им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 3Национальный исследовательский ядерный университет введение. В развитых странах по количеству смертель-«МИФИ», Москва, Россия ных исходов злокачественные новообразования в настоя-введение. Различие в метаболических процессах в клет- щее время занимают 2-е место. В последние десятилетия ках, которыми непосредственно связывается фотосенси- было разработано множество химиотерапевтических аген-билизатор (ФС), позволяет спектрально-флуоресцентными тов различных классов: комплексные соединения платины, методами по различию времени жизни флуоресценции ФС производные тетрациклина, аналоги нуклеотидов и другие. судить о степени его взаимодействия с клеточными ком- Применяемые на настоящий момент в клинической пра-понентами и идентифицировать тем самым тип клеток. ктике цитостатические препараты являются эффективны-Цель исследования. Выделить среди микроокружения ми средствами химиотерапии злокачественных новообра-опухоли опухольассоциированные макрофаги, которые зований, при этом, однако, обладают рядом серьезных являются привлекательными мишенями, в целях успеш- недостатков: неоптимальным фармакокинетическим про-ного использования потенциала нормальной иммунной филем, низкой селективностью по отношению к опухоле-системы для терапии. вым клеткам, высокой общей токсичностью. В связи материалы и методы. Для исследования кинетики фо- с этим ведется активная работа по созданию систем адрес-толюминесценции ФС был использован измерительный ной доставки цитотоксических препаратов в клетки злока-комплекс, основанный на стрик-камере с пикосекундным чественных новообразований. Таковыми являются проле-временным разрешением (15 пс) Hamamatsu C10627—13, карства — неактивные в среде организма производные сопряженный с полупроводниковым лазером Hamamatsu лекарственного препарата, под действием метаболических с длительностью импульса 67 пс и с длиной волны 633 нм. процессов переходящие в активную форму. Известно, Серия экспериментов была проведена на половозрелых что злокачественные новообразования обладают рядом самках крыс c массой тела 200 ± 10 г, у которых моделиро- особенностей. Так, межклеточное пространство опухоле-вали мультиформную глиобластому путем имплантации. вой ткани имеет рН = 6,2—7,0, в то время как в здоровых В качестве ФС в работе использовали 5-АЛК индуциро- тканях рН = 7,2—7,4. В связи с этим логичным шагом яв-ванный Пп IX в концентрации 100 мг/кг. ляется создание рН-чувствительных пролекарств на осно- результаты. В результате методом время-разрешенной ве известных химиотерапевтических агентов. спектроскопии было установлено 3 компоненты времени Цель исследования. Синтез рН-чувствительных диаг-жизни флуоресценции Пп IX в условиях in vivo с характер- ностических и терапевтических агентов на основе тиомо-ными средними значениями 6, 1 и 0,2 нс. Каждая из полу- чевины, а также изучение их биологической активности. ченных компонент времени жизни флуоресценции харак- материалы и методы. Структура синтезированных про-теризуются захватом ФС определенным типом клеток, изводных тиомочевины установлена методами спектроско-что связано с различием в их метаболизме и фагоцитозе. пии ЯМР 'Н, масс-спектрометрии высокого разрешения. Заключение. Таким образом, в перспективе при одноз- Спектры флуоресценции зарегистрированы с помощью начной идентификации различных типов клеток по вре- прибора Varian Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer. мени жизни флуоресценции ФС, в том числе опухольас- результаты. В ходе работы был синтезирован ряд про-социированных макрофагов, планируется проведение изводных тиомочевины, способных к циклизации в слабоцелевой фотодинамической терапии, направленной на кислой среде. Одно из них представляло собой FRET-пару разрушение опухольассоциированного микроокружения, с Xex = 350 нм A,fl = 518 нм, распадающуюся в кислой среде защищающего клетки опухоли от нормального иммунного с изменением спектра флуоресценции. Методом флуори-ответа. метрии была подтверждена гипотеза о способности сте-Работа выполнена в ИОФ РАН в соответствии рически нагруженных производных тиомочевины к цик-с госзаданием П. 11. Тема № 01200953447Биомедицинская лизации в кислой среде, а также исследована кинетика физика (рук. В.Б. Лощенов). данного процесса. Были также получены ковалентные конъюгаты доксорубицина и паклитаксела с молекулой-предшественником антиконвульсивного препарата альбу-тоина, способные в кислой среде опухолевых клеток высвобождать оба терапевтических агента. Заключение. В результате работы были получены новые рН-чувствительные диагностические и терапевтические агенты на основе способных к циклизации производных тиомочевины. Данные соединения показали высокую

Спецвыпуск / том 17 / 2018 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ