Индукция апоптоза клеток рака почки катионными пептидами Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

42

МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ»

А.А. Лушникова1, Л.Ф. Морозова1, А.А. Рудакова1, С.М. Андреев2, А.В. Балбуцкий1

индукция апоптоза клеток рака Почки катионными пептидами

ФГБУ«НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва, Россия; ФГБУ«ГНЦИнститут иммунологии» ФМБА России, Москва, Россия

введение. Рак почки (РП) отличается высокой моле-кулярно-генетической и клинической гетерогенностью, что значительно ухудшает прогноз и ответ на стандартную химиотерапию. Для молекулярно направленной терапии агрессивных опухолей почки перспективны катионные пептиды (КП), взаимодействующие с многофункциональными белками нуклеолином (С23) и нуклеофозмином (В23), которые высоко экспрессированы в большинстве опухолевых клеток, но не в нормальных клетках. Рецеп-торный С23 рассматривается как основная мишень для молекул КП, обогащенных остатками Arg-Lis.

Цель исследования. Изучение механизмов избирательной цитотоксичности КП на модельной перевиваемой линии Рпоч1-КК светлоклеточного РП с ранее выявленной цитогенетической поликлональностью и мутациями в генах-супрессорах VHL и TP53.

материалы и методы. Клетки (Кл) Рпоч1-КК культивировали в полной питательной среде RPMI-1640 с 10 %-ной эмбриональной телячьей сывороткой. Цитотоксичность 5 КП с разной структурой массой 1—2 кДа изучали в стандартных МТТ-тестах и микроскопически, используя флуоресцентно меченный Су5*-КП со структурной формулой RgK4K2KAC-NH2, вносимый с интервалом 2 ч в конечных концентрациях 0,5—1 мкг/мл в микроячейки с 2-суточной культурой Кл Рпоч1-КК. Контроль — морфологически нормальные фибробласты человека линии Н1036. После 2—6 ч инкубации Кл окрашивали DAPI и Хекст 33342. Для подтверждения апоптоза использовали проточную цитофлуо-риметрию. Экспрессию генов NCL/NPM и кодируемых белков С23/В23 анализировали с помощью ОТ-ПЦР, ИГХ-окрашивания стекол с суспензией Кл Рпоч1-К и вестерн-блоттинга.

результаты. Уровни экспрессии С23/В23 в Кл Рпоч1-КК выше контроля в 7,6 и 4,2 раза соответственно, что подтверждает дифференциальную экспрессию С23/В23 в опухолевых и нормальных Кл. МТТ-тест выявил высокую цитотоксичность изученных КП с разной молекулярной структурой в концентрациях 0,5—4 мкг/мл. Выживаемость клеток в 3-суточной культуре Кл после инкубации с КП снизилась до 12,9—18,4 %, в контрольных лунках — не изменилась, и цитотоксичность КП в отношении фибробластов не выявлена. Результаты вестерн-блоттинга и ОТ-ПЦР показывают, что в основе избирательной цитотоксичности изученных КП лежит конкурентное взаимодействие молекул КП с рецептор-ными С23 и В23, высоко экспрессированными в опухолевых клетках и регулирующими ключевые клеточные процессы, в том числе апоптоз, с последующим высвобождением супрес-сора р53. После инкубации с КП в Кл Рпоч1-КК наблюдалось значительное повышение экспрессии р53 и снижение уровня свободного С23. Показано также, что в апоптоз Кл Рпоч1-КК, индуцированный КП, вовлечены каспазы 3, 8 и 9.

Заключение. На модельной перевиваемой линии Рпоч1-КК показана избирательная цитотоксичность 5 низкомолекулярных КП. В механизм апоптоза вовлечены белки С23, В23 — возможные мишени пептидов, р53 и каспазы 3, 8, 9. Эти КП перспективны для предклинического исследования.

Е.C. Лылова1, А.В. Савинкова2, Л.Р. Тилова2, Е.М. Жидкова2, В.П. Максимова2, К.А. Кузин2, О.А. Власова2, К.И. Кирсанов2, А.Ю. Портянникова2, М.Г. Якубовская2, Е.А. Лесовая2,3 поиск ингибиторов REDD1 и оЦЕнкА

их влияния на рост и жизнеспособность клеток лейкозов и лимФом

1МИТХТ, Москва, Россия;

ФГБУ«НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина»

Минздрава России, Москва, Россия;

ФГБОУВО РязГМУМинздрава России, Рязань, Россия

введение. Глюкокортикоиды (GC) часто применяются в терапии онкологических заболеваний. Однако их использование ограничено возникновением побочных эффектов и развитием резистентности. Биологические эффекты GC реализуются посредством активации глюкокортикоидного рецептора (GR), который регулирует экспрессию генов путем транс-репрессии, обусловливающей терапевтическое действие GC, и транс-активации, отвечающей за побочные эффекты. Было показано, что GR-зависимый ген REDD1 (regulated in development and DNA damage response 1) имеет большое значение в развитии побочных эффектов GC. Были отобраны потенциальные ингибиторы REDD1 — антипротозойное средство эметин и ингибитор протеинкиназы CGP-60474.

Цель исследования. Оценка эффектов потенциальных ингибиторов REDD1 эметина и CGP-60474 на рост и жизнеспособность клеток лимфомы и лейкоза.

материалы и методы. Потенциальные ингибиторы REDD1 отбирали с помощью биоинформатического анализа. Их свойства оценивали на клетках острого лимфоб-ластного лейкоза СЕМ и мантийноклеточной лимфомы Granta. Клетки обрабатывали эметином или CGP-60474, затем, спустя 6 ч после обработки веществами, глюкокор-тикоидом дексаметазоном (Dex) в течение 24—72 ч. Цито-токсический эффект определяли с помощью прямого подсчета клеток. Экспрессию REDD1 оценивали с помощью количественной ПЦР после обработки клеток ингибиторами REDD1 в течение 6 ч и последующей обработки Dex в течение 6—24 ч.

результаты. Эметин и CGP-60474 не снижали цито-токсический эффект Dex на клетки обеих линий, а при определенных дозах мы наблюдали кооперативное цитотоксиче-ское действие глюкокортикоида и тестируемых соединений. В то же время эметин и CGP-60474 подавляли базальный и GC-индуцированный уровень экспрессии REDD1.

Заключение. Эметин и CGP-60474 являются ингибиторами REDD1 и не снижают цитотоксический эффект GC. Перспективным является исследование их действия на моделях лейкозов и лимфом для оценки их влияния на развитие побочных эффектов GC.

Работа поддержана грантом РНФ № 17-75-20124.

Спецвыпуск / том 17 / 2018

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ