CC BY
24
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro Ha^OHaibHoro ymBepcurery BeTepHHapHoi' MegnuUHH Ta 6i0TexH0iroriH iMem C.3. f^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies
doi: 10.15421/nvlvet8003
ISSN 2519-268X print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
УДК 637.127.576
Пiдбiр умов для препаративного електрофорезу протеУшв сироватки молока у нативних умовах
В.Г. Юкало, КС. Дацишин biotech@tu.edu.te.ua
Тернопшъсъкий нацiональний mехнiчний утверситет iменi 1вана Пулюя, вул. Руська, 56, м. Тернотлъ, 46001, Укра'ша
Протеши сироватки молока е попередниками быъше сотт бгоактивних пептидгв. Ц пептиди можуть утворюватися в процесг травлення у шлунково-кишковому трактг, а також за дп протеаз молочнокислих бактерш г молокозгорталъних препаратгв. Серед них знайдено тггбтори ангготензин-перетворювалъного ензиму, пептиди з оптдною та бактерицидною дгею, жуномодуляторш та гтохолестеролемгчш пептиди, пептиди, яю впливаютъ на моторику кишечника, апетит та тшг. Бгоактивш пептиди з протешгв сироватки молока становлятъ значний ттерес для створення функцгоналъних продуктгв або продуктгв з профтактичними властивостями. Створення таких продуктгв передбачае видтення бюактив-них пептидгв певноI бюлоггчно! ди. Враховуючи специфгку !х розмгщення у первиннш структург доцтъним е використання для Их отримання гомогенних протешгв-попередниюв з сироватки молока. Одним з методгв для одностадшного роздтення протешгв сироватки молока е диск-електрофорез в нативнш системг ПААГ для лужних г нейтралъних протешгв. Метою даноI роботи було встановити параметри препаративного варганту диск-електрофорезу для видтення гомогенних проте'1-шв сироватки молока. Дослгдження проводили на модифгкованому апаратг Стадгера. Протеши сироватки молока видтяли осадженням казе'тгв в ¡зоелектричнш точцг. Осад казетгв вгддгляли центрифугуванням. Для ¡дентифжацп протешгв сироватки молока використовували гомогенш фракцН а-лакталъбумту(а-ЬЛ) г в-лактоглобулту(в-ЬО), ят отримували шляхом повторноI гелъ-фыътраци на сефадекЫ 0-100фпе). Гомогентстъ г фракцшний склад протетв сироватки молока визнача-ли аналтичним диск-електрофорезом у пластинах полгакриламгдного гелю. Концентрацж протешгв у зразках визначали спектрофотометрично (спектрофотометр СФ-46) при довжинг хвилг X = 280 нм.
Отриман резулътати доводятъ доцыъшстъ використання пластинок ПААГ для препаративного фракщонування про-тешгв сироватки молока. Встановлено допустиму тривалгстъ г умови ¡дентифжацп протетових фракцш. Показано, що вихгд протешгв у складг гомогенних фракцш становитъ 69,2%. При цъому стввгдношення мгж кыъюстю отриманих фракцш (в-ЬО, а-ЬЛ, ББЛ г 1О) близъке до Их розподыу у сироватц молока.
Ключовi слова: протеши сироватки молока, видыення протетових фракцш, препаративний електрофорез.
Подбор условий для препаративного электрофореза протеинов сыворотки
молока в нативных условиях
В.Г. Юкало, К.С. Дацишин biotech@tu.edu.te.ua
Тернополъский националъный технический университет имени Ивана Пулюя, ул. Русская, 56, г. Тернополъ, 46001, Украина
Протеины сыворотки молока являются предшественниками более сотни биоактивных пептидов. Эти пептиды могут образовыватъся в процессе пищеварения в желудочно-кишечном тракте, а также под действием протеаз молочнокислых бактерий и молокосвертывающих препаратов. Среди них обнаружены ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, пептиды с опиоидным и бактерицидным действием, иммуномодулирующие и гипохолестеролемические пептиды, пептиды, которые влияют на моторику кишечника, аппетит и др. Биоактивные пептиды из протеинов сыворотки молока
Citation:
Yukalo, V.G., Datsyshyn, K.Ye. (2017). Selection of conditions for preparative electrophoresis of milk whey proteins in native conditions. Scientific Messenger LNUVMB, 19(80), 13-17.
представляют значительный интерес для создания функциональных продуктов или продуктов с профилактическими свойствами. Создание таких продуктов предусматривает выделение биоактивных пептидов определенного биологического действия. Учитывая специфику их размещения в первичной структуре, целесообразным является использование для их получения гомогенных протеинов-предшественников из сыворотки молока. Одним из методов для одностадийного разделения белков сыворотки молока является диск-электрофорез в нативной системе ПААГ для щелочных и нейтральных протеинов. Целью данной работы было установить параметры препаративного варианта диск-электрофореза для выделения гомогенных протеинов сыворотки молока. Исследования проводились на модифицированном аппарате Стадиера. Протеины сыворотки молока выделяли осаждением казеина в изоэлектрической точке. Осадок казеина отделяли центрифугированием. Для идентификации протеинов сыворотки молока использовали гомогенные фракции а-лактальбумин (a-LA) и лактоглобулина ф-LG), которые получали путем повторной гель-фильтрации на сефадексе G-100 (fine). Гомогенность и фракционный состав протеинов сыворотки молока определяли аналитическим диск-электрофорезом в пластинах полиак-риламидного геля. Концентрацию протеинов в образцах определяли спектрофотометрически (спектрофотометр СФ-46) при длине волны X = 280 нм.
Полученные результаты доказывают целесообразность использования пластин ПААГ для препаративного фракционирования белков сыворотки молока. Установлено допустимую продолжительность и условия идентификации белковых фракций. Показано, что выход протеинов в составе гомогенных фракций составляет 69,2%. При этом соотношение между количеством полученных фракций ф-LG, a-LA, BSA и IG) близко к их распределению в сыворотке молока.
Ключевые слова: протеины сыворотки молока, выделения протеиновых фракций, препаративный электрофорез.
Selection of conditions for preparative electrophoresis of milk whey proteins
in native conditions
V.G. Yukalo, K.Ye. Datsyshyn biotech@tu.edu.te.ua
Ternopil National Technical University Ivan Pul'uj, Ruska Str., 56, Ternopil, 46001, Ukraine
Milk whey proteins are precursors of more than a hundred bioactive peptides. These peptides may be formed in the digestive process in the gastrointestinal tract, as well as under the influence of lactic acid bacteria proteases and milk-clotting preparations. Among them, inhibitors of angiotensin-converting enzyme, opioid and bactericidal peptides, immunomodulatory and hypocholester-olemic peptides, peptides that have an effect on intestinal motility, appetite, and others have been found. Bioactive peptides from whey proteins are of considerable interest for the production offunctional products or products with prophylactic properties. The creation of such products includes the obtaining of bioactive peptides of define biological action. Taking into account the specifics of their placement in the primary structure, it is advisable to use homogeneous protein precursors from milk whey to obtain them. One of the methods for one-stage separation of whey proteins is disc-electrophoresis in the native PAGE system for alkaline and neutral proteins. The purpose of this work was to determine the parameters of the preparative variant of disc-electrophoresis for the selection of homogeneous whey proteins. The research was performed on a modified apparatus of Stadier type. Proteins of milk whey were isolated by the precipitation of caseins at an isoelectric point. The precipitate of caseins was separated by centrifugation. Homogenous a-lactalbumin (a-LA) and fi-lactoglobulin ф-LG) fractions were used to identify milk whey proteins, which were obtained by double gel-filtration on Sephadex G-100 (fine). Homogeneity and fractional composition of milk serum proteins were determined by analytical dis^electrophoresis in plates of polyacrylamide gel. The concentration of proteins in the samples was determined spectrophotometrically (spectrophotometer SF-46) at a wavelength X = 280 nm.
The obtained results prove the feasibility of using PAGE plates for the preparative fractionation of serum milk proteins. The allowable duration and conditions for identification of protein fractions are established. It was shown that the yield of proteins in the composition of homogeneous fractions was 69.2%. In this case, the correlation between the number of obtained fractions ф-LG, aLA, BSA and IG) is close to their distribution in milk serum.
Key words: Serum proteins of milk, separation offractions, preparative electrophoresis.
Вступ
Протеши сироватки молока виконують низку важ-ливих бюлопчних функцш. Це в першу чергу забез-печення оргашзму у постнатальний перюд амшокис-лотами, а також транспортування жирних кислот, ретинолу, участь у синтез! лактози у молочнш залоз^ транспортування юшв кальцш, 1мунний захист, ан-тимжробна та антиоксидантна д1я (Fox et al, 2015). В останш десятилитя було вщкрито бшьше сотш бюак-тивних пептщцв, яш можуть утворюватись в результат! протеолггичного розщеплення протегнш сироватки молока (Park, 2009). Ц пептиди також здатш впли-вати на функцп ф1зюлопчних систем оргашзму. За видами бюлопчно! ди серед них знайдено шпбгтори ангютензин-перетворювального ензиму, пептиди з
опювдною та бактерицидною д1ею, 1мшомодуляторш та гшохолестеролем1чш пептиди, а також пептиди, що впливають на моторику кишечника. Так пептиди становлять значний штерес як природш шгред1енти для створення функцюнальних харчових продукпв або продукпв з профшактичними властивостями. Створення таких продукпв пов'язане з необхццлстю виробництва бюактивних пептид1в з певною бюлопч-ною д1ею. У зв'язку з цим, необхщно враховувати певну специфшу розмщення бюактивних пептид1в у первиннш структур! проте!шв-попередник1в з сироватки молока (Yukalo et al, 2009). Тому для отримання функцюнальних пептидних шгред1енпв певно! бюлопчно! ди доцльним е використання окремих гомо-генних проте!шв. На сьогодшшнш день доступш i ефективш методи отримання проте!шв-попереднишв
з сироватки молока у промислових масштабах ввдсу-тн1. 1снуюч1 е або складними, багатостадшними i дорогими або в шшому випадку не можуть забезпечити достатньо високий стутнь гомогенностi протешових фракцiй.
Одним з методiв, який мiг би забезпечити ефекти-вне одностадiйне роздшення протешв сироватки молока, е електрофорез. Ранiше в нашiй лабораторй' було встановлено, що найбiльш оптимальною для цього е анодна система диск-електрофорезу в натив-них умовах. Для ii устшного використання необхвдно провести дослвдження впливу параметрiв електрофо-ретично! системи на ефектившсть препаративного роздiлення протегнш сироватки молока (Yukalo, 2014).
Мета роботи. Встановлення параметрiв прове-дення препаративного диск-електрофорезу протешв для видiлення гомогенних протешв сироватки молока
Матерiал i методи досл1джень
В роботi було використано свгже молоко кислотш-стю 17-19 °Т. Молоко знежирювали центрифугуван-ням на центрифузi ОПН-8 (5000 об/хв. протягом 15 хвилин). Протеши сироватки молока видели осадженням казегнш в iзоелектричнiй точцi. Осад казегнш вiддiляли центрифугуванням (3000 об/хв. протягом 10 хв). Процедуру повторювали двiчi. Протеши сироватки молока очищали ввд низькомолекуля-рних компонентiв гель-фшьтращею на колонцi з се-фадексом G-25 (medium) зрiвноваженим вiдповiдним електрофоретичним буфером.
Для вдентифшаци протешв сироватки молока ви-користовували гомогеннi фракцп a-лактальбумiну (а-LA) i ß-лaктоглобулiну (ß-LG), яш отримували шляхом повторно! гель-фшьтраци на сефaдексi G-100 (fine).
Гомогеншсть i фрaкцiйний склад протегнш сироватки молока визначали аналтгичним диск-електрофорезом у пластинах полiaкрилaмiдного гелю (ПААГ) (Yukalo, 2014). Електрофореграми фарбували 7% оцтовою кислотою. Для фарбування використо-вували барвники: кумaсi голубий (aнaлiтичний варь ант електрофорезу) i амвдочорний 10В (препаратив-ний вaрiaнт електрофорезу). Кiлькiсну обробку елект-рофореграм проводили денситометрiею з використан-ням функцп зчитування грaфiчних зображень imread (Yukalo et al, 2007).
Концентрацш протешв у зразках визначали спек-трофотометрично (спектрофотометр СФ-46) при дов-жшн хвилi X = 280 нм. При цьому використовували коефщент поглинання (d/%) для протешв сироватки
молока - 12,3. Для приготування буферних розчинiв, а також проведення хромaтогрaфiчних i електрофоре-тичних дослiджень використовували реактиви фiрми «Reanal» (Угорщина), «Sigmar» (США), «Pharmacia» (Швеция), а також реактиви вичизняного виробництва («хч» i «осч»).
Математично-статистичний aнaлiз виходу проте!-нових фрaкцiй проводили з використанням програми Microsoft Office Excel 2003.
Результати та 1х обговорення
Для проведення аналгшчного електрофорезу протешв молока використовують системи однорiдного або диск-електрофорезу. Ранше нами було встановлено, що для препаративного роздшення цих проте!-шв найбiльш ефективним е диск-електрофорез в на-тивнш системi ПААГ для лужних i нейтральних протешв (Yukalo et а1, 2009). Його можна проводити в пластинках або стовпчиках ПААГ. На рис. 1 показан результати аналогичного диск-електрофорезу проте!-нiв сироватки молока отримаш цими двома способами. Як видно на електрофореграмах така система дозволяе ефективно роздшити i iдентифiкувати такi важливi фракцп, як P-LG , a-LA, протеозо-пептонну фракцш (PPF) i iмуноглобулiни Необхiдно ввд-значити, що електрофорез у стовпчиках ПААГ дозво-ляе бiльш чгтко роздiлити P-LG на двi фракцп А i В (рис. 1(2)). Проте для препаративного видшення б№ш зручним е електрофорез у пластинах ПААГ. Особливо це стосуеться стадп щентифшацп фракцiй i !х екстракци. Тому за основу для препаративного варiанту було взято електрофорез у пластинках ПААГ. Ввдпрацювання процеав видiлення протешв сироватки проводили в апарап типу Стадiера (Oster-шаа 1981).
y-g]
PPF
BSA а-1 а
ß-LG
у-«"
и.
А-
PPP-" -j
BSA - -
ct-la P-'si =
Ж
2
1
Рис. 1. Електрофореграма проте\шв сироватки молока (амалггичмий вар1ам | ) у пластинках (1) або стовпчиках (2) ПААГ
Перш за все нами було встановлено допустиму тривалють дифузного розмивання проте1нових сму-жок у ПААГ до !х фшсацп. Це необхвдно для того, щоб провести iдентифiкaцiю проте1нових фракцш. Вона складаеться з таких тривалих оперaцiй як фарбування крайшх полосок гелю i 1'х штенсивне вщми-вання. Все це становить вiд 30 до 60 хвилин. Необхвд-но вiдзнaчити, що для вдентифшаци проте1нових фрaкцiй у даному випадку можна використовувати не лише кумас голубий, але i амвдошварц 10 В. Врахо-вуючи велику концентрацш проте1ну, ефективнiсть амвдошварцу 10 В достатня для надшно1 щентифшацп фрaкцiй. В цей же час полоска ПААГ забарвлена ним швидше ввдмиваеться. Для встановлення допустимо1 тривалосл дифузного розмивання проте1нових сму-жок нами було проведено вiзуaлiзaцiю пластинок ПААГ тсля препаративного диск-електрофорезу через рiзнi пром1жки часу (до 2 годин) без фшсацп
проте!шв. На рис. 2 показано пластинку ПААГ тсля двох годин експозици без ф1ксаци. Отримат результата сввдчать про те, що за такий перюд в гел1 не в1д-буваеться помггного розмивання проте!нових фракцш.
Рис. 2. Вигляд пластинки ПААГ з протеТнами сироватки молока (препаративний диск-електрофорез) шсля двох годин витримки без фшсацп
1
Для проведення препаративного електрофорезу протегнш сироватки молока нами було збшьшено об'ем електрофоретично! камери типового апарату Стад1ера, що дозволило в 7-9 раз1в збшьшити шль-к1сть протешу у вз1рш для фракщонування. Для пере-в1рки, як таш змши можуть вплинути на ефектившсть роздшення, було проведено чотири препаративш електрофорези. Одну пластинку заф1ксували 1 зафар-бували для оцшки ефективносп роздшення з допомо-гою денситометри. Три шш1 пластинки використали для екстракци 1 оцшки виходу загального протешу 1 його фракцш. Заф1ксовану пластинку ПААГ тсля препаративного електрофорезу 1 И денситограму показано на рис. 3.
Оцшка виходу загального протешу сироватки молока 1 окремих його фракцш представлена в таблиц 1. Отримат результата сввдчать, що зб1льшення шлько-сп протешу у вз1рш взятому для фракщонування у модиф1кованому апарап призводить до незначного зменшення виходу загального протешу тсля екстракци.
Х2
BSA a-LA
250
200
150
100
50
100
200
300
400
500
600
700
Рис. 3. Електрофореграма (1) i денситограма (2) протеТшв сироватки молока шсля змши розмпрш елект-рофоретичноТ камери для препаративного диск-електрофорезу
2
0
0
Таблиця 1
Вихвд протеТшв сироватки молока за результатами трьох препаративних електрофорезiв_
Етап визначення виходу протешв тсля елект- Кiлькiсть екстрагованих протеiнiв кожно! фракци (мг) за результатами трьох електрофорезiв Кiлькiсть протешу в трьох взiрцяx для фракщ-
рофорезу P-LG a-LA BSA IG онування
0,769 0,115 0,051 0,148
Е280 0,801 0,127 0,068 0,139 9,7
0,832 0,121 0,060 0,163
8,0 0,56 0,77 1,09
Юльюсть проте!ну (мг)* 8,3 8,7 0,62 0,59 1,03 0,91 1,02 1,19 47,4
Середнш вихвд проте!-н1в кожно! фракци 8,3 ± 0,2 0,590 ± 0,017 0,90 ± 0,07 1,10 ± 0,05
(М ± m, n = 3)
Всього екстраговано
протешш пiсля трьох електрофорезш 32,78 мг 47,4 мг
Загальний вихвд проте!-н1в 69,2% 100%
* В кожному екстракт i у вз1рцях для фракщонування
Цей вихвд за результатами трьох електрофорезiв становить 69,2%. До модифшацп вiн становив бiльше 70%. Сшввщношення мш к1льк1стю отриманих фракцш (P-LG, a-LA, BSA i IG) ввдповвдае !х нормальному розподшу у сироватцi молока.
Висновки
Отриманi результата доводять доцiльнiсть використання пластинок ПААГ для препаративного фракщонування протеИшв сироватки молока. При цьому дифузiя проте!нових фракцiй в гелi несуттево впливае на ефективнiсть роздшення при витримуванш гелю без фшсаци до 2 годин, що цшком достатньо для щен-тифшацд фракцш. Вихщ протешш при модифшацп електрофоретично! камери апарату Стадiера i збшь-шеннi кiлькостi взiрця (в 7-9 разiв) за результатами трьох електрофорезiв становить 69,2%. До модифша-ци вiн досягав бiльше 70%.
Бiблiографiчнi посилання
Fox, P., Uniacke-Lowe, T., McSweeney, P., O'Mahony,
J. (2015). Dairy Chemistry and Biochemistry. Park, Y.W. (2009). Bioactive components in milk and dairy products. Wiley - Blackwell.
Yukalo, A.V., Datsyshyn, K.Ye., Yukalo V.G. (2013). Bioaktyvni peptydy proteiniv syrovatky moloka koriv (Bos taurus). Biotekhnolohiia Akta. 6, 49-61 (in Ukrainian).
Yukalo, A., Yukalo, V., Shynkaryk, M. (2009). Electrophoresis separation of the Milk Protein. Proceedings of the International Conference on Bio and Food Elec-trotechnologies, 227-231.
Yukalo, A.V. (2014). New approach for isolation of individual caseins from cow milk by the preparative electrophoresis. Advances in Biological Chemistry. 4(6), 382-387.
Yukalo, V. G., Yavorskyy, B.I., Storozh, L.A., Solovodzinska, I.Y. (2007). Kilkisnyi elektroforetych-nyi analiz bilkiv kazeinovoho kompleksu . Biolohiia tvaryn. 9(1-2), 295-298 (in Ukrainian).
Osterman, L.A. (1981). Metody issledovaniya belkov i nukleinovykh kislot: Elektroforez i ultratsentrifugiro-vaniye (prakticheskoye posobiye). M.: Nauka (in Russian).
Received 1.09.2017 Received in revised form 28.09.2017 Accepted 29.09.2017
