CC BY
34
УДК 577.112.083/122.2
Юкало В.Г., д.б.н., професор, Сторож Л.А., ст. викладач, Штокало М.О., студентка © Тернотльський нацюнальний техтчний утеерситет ¡мет 1вана Пулюя,
м. Тернотль, Украгна
ВИЗНАЧЕННЯ УМОВ ОТРИМАННЯ ПРИРОДНИХ Б1ОАКТИВНИХ КАЗЕ1НОВИХ ФОСФОПЕПТИД1В
Осноенг протегни молока - казегни е попередниками багатьох бгологгчно актиених пептид1е, якг еключають быьшу частину гх переинног структури. Цг пептиди проникають е крое 'яне русло г еплиеають на р1зт системи оргашзму. Було еидглено антитромботичт та антигтертензиет пептиди, ¡муномодуляторт та антимЫробт пептиди, аготсти та антаготсти опгогдних рецептор1е, фосфопептиди. Одними з найбыьш цтних пептид1е е фосфопептиди, якг забезпечують засеоення гонге метал1е (гонге феруму, кальцгю, цинку, магтю). В дангй роботг було проеедено дослгдження еиходу фосфопептид1е при дп на казегн ргзних концентрацш панкреатину при 37оС г рН 7,9. Показано егдмгнностг у розподглг за молекулярними масами фосфопептид1е, отриманих при дп ргзних концентрацш панкреатину. Встаноелено оптимальнг концентрацп панкреатину для еидыення природних бюактиених казегноеих фосфопептид1е.
Ключовi слова: казегн, фосфопептиди, панкреатин, протеол1з.
УДК 577.112.083/122.2
Юкало В.Г., д.б.н., профессор, Сторож Л.А., ст. преподаватель, Штокало М.О., студентка Тернопольский национальный технический униеерситет имени Иеана Пулюя,
г. Тернополь, Украина
ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ПРИРОДНЫХ БИОАКТИВНЫХ КАЗЕИНОВЫХ ФОСФОПЕПТИДОВ
Осноеные протеины молока - казеины яеляются предшестеенниками многих биологически актиеных пептидое, которые еключают большую часть их переичной структуры. Эти пептиды проникают е кроеяное русло и елияют на различные системы организма. Было еыделено антитромботические и антигипертензиеные пептиды, иммуномодулирующее и антимикробные пептиды, агонисты и антагонисты опиоидных рецепторое, фосфопептиды. Одними из наиболее ценных пептидое яеляются фосфопептиды, которые обеспечиеают усеоение ионое металлое (ионы железа, цинка, кальция, магния). В данной работе было проеедено исследоеание еыхода фосфопептидое при еоздейстеии на казеин различных концентраций панкреатина при 37оС и рН 7,9. Показано различия е распределении по молекулярным массам фосфопептидое, полученных при дейстеии различных концентраций
© Юкало В.Г., Сторож Л.А., Штокало М.О., 2014
192
панкреатина. Установлены оптимальные концентрации панкреатина для выделения природных биоактивных казеиновых фосфопептидов.
Ключевые слова: казеин, фосфопептиды, панкреатин, протеолиз.
UDC 577.112.083/122.2
Yukalo V.G., Storozh L.A.,. Shtokalo M.O
Ternopil Ivan Pul 'uj National Technical University, Ternopil, Ukraine
DETECTING OF THE CONDITIONS FOR NATURAL BIOACTIVE CASOPHOSPHOPEPTIDES OBTAINING
The main milk proteins - caseins are precursors of multiple bioactive peptides that include great part of casein amino acid residues. These peptides pass through the bloodstream and affect the different systems of organism. It was obtained antithrombotic and antihypertensive peptides, immunomodulatory and antimicrobial peptides, agonists and antagonists of opiаte receptors, phosphopeptides. Phosphopeptides are very important bioactive casein peptides. They have a positive impact on the absorption of iron, calcium, zinc and magnesium ions in organism.
In current study the process of obtaining natural phosphopeptides from casein using different concentration of pancreatin (37oC, pH 7,9) was investigated. It has been shown the differences in molecular mass of phosphopeptides preparations which where obtained using different pancreatin concentrations. Optimal concentrations of pancreatin for natural casophosphopeptides obtaining have been detected.
Key words: casein, phosphopeptides, pancreatin, proteolysis.
Вступ. Ka3eiHoBi природш бюактивш фосфопептиди утворюються в процес нормального травлення в шлунково-кишковому тракт переважно за ди протеол^ичних ензимiв тдшлункового соку [1]. Основною функщею казешових фосфопептидiв е участь у процесах транспортування i засвоення юшв двохвалентних металiв, зокрема, кальцш, цинку i феруму. Тому в даний час казеlновi фосфопептиди викликають значний штерес як перспективш iнгредiенти функщональних харчових продуктв [2]. Аналiз первинно! структури казешових фосфопротеЫв (asi-CN, as2-CN, P-CN, к-CN) -попередниюв бюлопчно активних пептидiв показуе можливкть утворення велико! рiзноманiтностi фосфопептидiв в залежност вщ специфiчностi протеол^ичних ензимiв i умов проведення протеолiзу [3]. Зокрема, в нашiй лаборатори ранiше було показано, що казеlновi фосфопептиди, отриманi в результатi використання рiзних протеолiтичних препаратiв тваринного, рослинного i мiкробiологiчного походження, суттево вiдрiзняються за молекулярно-масовим розподiлом. Це може вщобразитися на 1хнш бiологiчнiй активност [4]. Реалiзуючи пiдхiд до видшення природних бiологiчно активних казешових фосфопептцщв, ми виходимо iз припущення, що фiзiологiчно найбiльш ефективними е фосфопептиди, яю утворюються в умовах, наближених до умов розщеплення казе!шв у шлунково-кишковому тракта При цьому необхщно враховувати, що крiм температури, рН середовища i складу протеаз на стутнь протеолiзу i, вiдповiдно, величину фосфопептидiв може
193
впливати концентращя субстрату i ензим-субстратне стввщношення. Для встановлення оптимальних умов утворення природних фосфопептидiв нами було проведено протеолiз при рiзних спiввiдношення казешових субстратв i панкреатину.
Мета. Встановити оптимальнi концентраци загального казешу i панкреатину для отримання природних бюактивних казешових фосфопептидiв.
Матер1али i методи. В якост субстрату використовували загальний казеш, який видшяли iз свiжого знежиреного молока подвшним переосадженням в iзоелектричнiй точщ. Iнактивацiю природних протеаз молока здшснювали шляхом шкубаци в оцтовiй кислоти при значенш рН 4,0 протягом п'яти годин.
Для протеолiзу казешових субстратiв використовували панкреатин виробництва ПрАТ «Технолог» (Украша).
Протешовий склад казешових субстратв дослiджували електрофорезом на вертикальних пластинках полiакриламiдного гелю (ПААГ). Для цього використовували лужну систему (рН 7,9), яка мктила 25 мМ трю, 27 мМ дiетилбарбiтурат, 3 мМ ЕДТА i 4,5 М сечовину [5]. Електрофореграми фжсували i проявляли загальноприйнятими методами. Електрофоретичнi буфери i гелi готували, використовуючи реактиви фiрми «Reanal» (Угорщина). Результати електрофорезу представляли у виглядi денситограм, яю отримували при використаннi програми зчитування графiчних зображень, розроблено! у системi Matlab [6].
Концентрацiю протемв у препаратах субстрату i гiдролiзатах визначали методом Лоурi або спектрофотометрично за поглинанням при довжиш хвилi 280 нм на спектрофотометрi СФ-46. При цьому використовували загальноприйнятий коефiцiент поглинання (Д\°%м) для загального казешу - 8,2.
Кiнематичну в'язкють казешових субстратiв визначали в термостатованому капшярному вiскозиметрi типу ВПЖ-2. Дiаметр капiляра вiскозиметра становив 1,77 мм. Кшематичну в'язкiсть v виражали у мм2/с.
Видiлення фосфопептидiв iз гiдролiзату проводили вiдповiдно до методики [7].
Гель-фшьтрацш отриманих препаратiв фосфопептидiв здшснювали з використанням хроматографiчноl колонки фiрми «Reanal» (Угорщина), заповнено! сефадексом G-25 (fine) фiрми «Pharmacia» (Швецiя). Концентрацш фосфопептидiв у всiх фракцiях визначали спектрофотометрично.
Bd експерименти повторювали 3-5 разiв. На графiках наведенi середш значення величин. Статистичний аналiз проводили користуючись критерiем Стьюдента (t). Статистичну обробку даних здшснювали за допомогою програми MS Excel 2003.
Результати дослщжень. Загальний казеш, який використовували у якост субстрату, видiляли iз свiжого знежиреного молока шляхом подвшного осадження в iзоелектричнiй точцi. При цьому кожен раз казеши вщмивали вiд залишкiв протеiнiв сироватки дистильованою водою. Шсля другого осадження загальний казеш диспергували в оцтовiй кислот при рН 4,7 для шактиваци
194
природних протеаз молока. Отриманий препарат висушували люфшьно i використовували для проведення протеолiзу. Склад загального казешу аналiзували методом електрофорезу в ПААГ. Результати представлеш на рис. 1. На денситограмi можна iдентифiкувати характерний розподiл протешових фракцiй казешу у вiдповiдностi до сучасно! мiжнародноl класифкаци [8].
250
200 300 400 500 600 700 800 Довжина електрофореграми, умовш одинищ
Рис. 1. Денситограма електрофоретичного роздшення загального казеУну, який використовували для протеол1зу 1 видшення фосфопептид1в
Аналiз лiтературних джерел показуе, що рiзними авторами для видiлення казешових фосфопептидiв використовувались розчини загального казешу концентрацieю вiд 5 до 13%. Проте при цьому використовували рiзнi значення температури в дiапазонi вщ 20 до 55оС в залежност вiд оптимуму ди ензимного препарату. Нами для протеолiзу були обраш фiзiологiчнi значення температури, а саме 37оС. При такiй температурi лiмiтуючим фактором у процесах протеолiзу концентрованих розчишв казешу може бути !х висока в'язкiсть [9]. Тому для встановлення максимально допустимо! концентраци казешового субстрату ми враховували залежнiсть кшематично! в'язкостi вiд концентраци казешу при 37оС. В'язкiсть визначали з використанням
195
вккозиметра ВПЖ-2, температуру в якому тдтримували за допомогою водяного термостату.
Кшематичну в'язккть розраховували за середнiми значеннями трьох вимiрювань витiкання розчину казе1ну:
V = -т-К , 9,807
де К - стала вккозиметра, 0,9303 мм2/с2; V - юнематична в'язкiсть розчину, мм2/с; т - час витжання розчину в секундах;
g - прискорення вiльного падшня у мiсцi вимiрювання, м/с2. Результати показан на рис. 2.
200 и
о
0 т ' '—I-1-1-1
1 3 5 7 9 11 13
Концентращя казешового субстрату, %
Рис. 2. Залежшсть кшематичноУ в'язкосл вщ концентрацп казеУнових субстратiв при температурi 37оС
З графiку видно, що при концентрацiях казешу бiльше 9% починаеться рiзке зростання значень кшематично! в'язкостi, що може впливати на вихщ фосфопептидiв. Для перевiрки цього ми провели дослщження виходу фосфопептидiв за однакового спiввiдношення «ензим-субстрат» в залежност вiд концентрацп казе!нових розчишв.
196
Протеолiз проводили в термостаи при температурi 37оС, значення рН тдтримували на рiвнi 7,9. Стввщношення «ензим-субстрат» було вибране 1:20. Пiсля двох годин протеолiзу вiдбирали проби для видшення фосфопептидiв. При цьому рН гiдролiзату доводили до 4,6 i осаджували нерозщепленi казе1ни центрифугуванням. Потiм до 9 мл супернатанту додавали 1 мл 10% СаС12 i 10 мл етанолу для осадження фосфопептидiв. Осад фосфопептидiв пiсля центрифугування промивали етанолом, висушували до постшно! ваги i зважували. Результати виходу фосфопептидiв (в мг з 9 мл гiдролiзату) показанi на рис. 3.
Концентрацiя казе1нового субстрату, %
Рис. 3. Залежшсть виходу фосфопептищв вщ концентрацп казеинового субстрату при постшному стввщношенш «ензим-субстрат»
З графку видно, що вихiд фосфопептидiв до досягнення концентрацп 9% зростае прямо пропорцiйно до концентрацп субстрату, а вище концентрацп 9% зростання значень виходу рiзко сповiльнюeться. Робиться висновок про доцшьтсть використання концентрацп казе1ну 9% для проведення протеолiзу при 37оС з метою видшення фосфопептидiв.
Для встановлення оптимальних значень стввщношення «ензим:субстрат», а також тривалост протеолiзу було проведено серiю протеолiзiв з рiзним спiввiдношенням «ензим:субстрат». При цьому на рiзних етапах протеолiзу вiдбирали проби для встановлення кшькосп утворених казе1нових фосфопептидiв. Протеолiзи проводили при фiзiологiчних значеннях температури i рН (37оС, рН 7,9), а також з використанням казешового субстрату концентращею 9%. Спiввiдношення «ензим:субстрат» задавали в дiапазонi вiд 1:20 до 1:260, який був встановлений на основi попереднiх дослiджень, а також
197
з врахуванням лггературних даних [1, 3, 10]. Проби вщбирали через кожних 30 хвилин починаючи з 30 хвилини вщ початку протеолiзу i до 180 хвилини включно. Фосфопептиди видшяли i визначали !х вихiд, як було описано вище. Результати визначень представлеш на рис. 4.
160 -|
0 30 60 90 120 150 180
Тривалкть протеолiзу, хвилин
Рис. 4. Залежшсть виходу фосфопептид1в при протеолiзi казеинового субстрату концентрацicю 9% за рiзних сшввщношень «ензим -субстрат»:
Д - 2:20; • - 1:60; Ж - 1:100; X - 1:140; + - 1:180; ■ - 1:220; ♦ - 1:260.
При аналiзi кривих виходу фосфопептидiв встановлено, що пiсля досягнення максимуму значення виходу починають зменшуватися при спiввiдношеннях «ензим:субстрат» вiд 1:20 до 1:100. При сшввщношеннях вiд 1:140 до 1:260 вихщ фосфопептидiв монотонно зростае, не досягаючи свого максимуму протягом всього перюду визначення. Така залежнiсть вiдрiзняeться вiд ступеню протеолiзу, який у вЫх випадках спiввiдношень «ензим:субстрат» монотонно зростае. Очевидно, це пов'язано зi змшою молекулярно! маси фосфопептидiв у процес протеолiзу. З використанням гель-фшьтраци для спiввiдношень 1:20 i 1:60 при досягненш максимуму було показано висою значення молекулярно! маси фосфопептидiв в межах вiд 1000 до 5000 Да. Через короткий промiжок часу спостер^аеться зменшення молекулярно! маси
198
пептидiв, що зумовлюе падшня виходу фосфопептидiв. При стввщношеннях вiд 1:140 до 1:260 за даними гель-фшьтраци фосфопептиди, яю за молекулярною масою (до 2000 Да) близью до природних, утворюються на остантх стадiях протеолiзу.
При стввщношеннях «ензим:субстрат» в дiапазонi вщ 1:100 до 1:140 у перюд протеолiзу вiд 90 до 120 хвилини вщ його початку досягаеться високий вихщ фосфопептидiв, основна частина з яких (бшьше 70 %) за молекулярною масою вщповщае вщомим природним казе1новим фосфопептидам [1, 3]. Пщсумовуючи отриманi результати, можна заключити, що при використаннi для протеолiзу спiввiдношень «ензим:субстрат» в дiапазонi вщ 1:100 до 1:140 при 37оС i значеннi рН 7,9 через 90 хвилин можна отримати високий вихщ казешових фосфопептцщв, якi за своею молекулярною масою подiбнi до вщомих природних бiологiчно активних фосфопептидiв.
Висновок. В результатi проведених дослщжень були встановленi оптимальнi умови для отримання природних бюлопчно активних казофосфопептидiв за ди панкреатину. Враховуючи залежтсть в'язкостi казешових розчинiв, а також виходу фосфопептидiв вiд концентрацп казешу пропонуеться для протеолiзу використовувати казеlновi субстрати концентрацiею 9%. Щодо стввщношення «ензим-субстрат», то стабiльно високий вихщ фосфопептцщв, якi за молекулярною масою вщповщають вiдомим природним фосфопептидам, досягаеться в дiапазонi спiввiдношень вiд 1:100 до 1:140. При вищих концентращя панкреатину пiсля короткого протеолiзу досягаеться максимум виходу фосфопептидiв з подальшим швидким !х розщепленням, що супроводжуеться зменшенням молекулярно! маси i виходу. При низьких концентращях панкреатину в реакцшному середовищi максимум виходу фосфопептидiв протягом всього часу протеолiзу не досягаеться, причому значна частина утворених фосфопептидiв мае порiвняно високу молекулярну масу, не властиву природним фосфопептидам.
Л1тература
1. Fitz Gerald R.J. Potential uses of caseinophosphopeptides / R.J. Fitz Gerald // Int. Dairy J. - 1998. - Vol. 8. - P. 451-457.
2. Hartmann R. Food - derived peptides with biological activity: from research to food applications / R. Hartmann, H. Meisel // Current Opinion in Biotechnology. - 2007. - V. 18. - P. 163-169.
3. Park Y.W. Bioactive components in milk and dairy products / Park Y.W. - USA: Wiley - Black Well, 2009. - 426 p.
4. Юкало В.Г. Гель-фшьтращя казешових фосфопептидiв / В.Г. Юкало, Л.А. Сторож // Науковий вкник ЛНУВМБТ iменi С.З. Гжицького. -2014. Т. 16, № 2 (59), Частина 4. - С. 225-231.
5. Юкало В.Г. Електрофоретичний аналiз бшюв казешового комплексу / В.Г. Юкало // Нау^ пращ НУХТ. - 2008. - №24. - С. 65-67.
6. Кшькюний електрофоретичний аналiз бшюв казешового комплексу / В.Г. Юкало, Б.1. Яворський, Сторож Л.А. [та ш] // Бюлопя тварин. - 2007. - Т.9, №1-2. - С. 295-298.
199
7. Yukalo V. Isolation of phosphopeptides from total casein and its fractions / V. Yukalo, L. Storozh // Food Chemistry and Technology.- 2013.- Vol.47, №.2. - Р. 32-40.
8. Farrell H.M. Nomenclature of the proteins of cows' milk - sixth revision / H.M. Farrell, R. Jimenez-Flores, G.T. Bleck // J. Dairy Sci. - 2004. - Vol.87, № 6. -P. 1641-1674.
9. Горбатова К.К. Химия и физика белков молока: Учебное пособие / Горбатова К.К. - М.: Колос, 1993. - 192 с.
10. Декуша Г.В. Розробка технологи сухих сумшей з гiдролiзованим бшком для дитячого харчування : дис. канд. техн. наук : 05.18.16 : захищ. 10.06.09 / Г.В. Декуша. - Одеса, 2009. - 157 с.
Рецензент - д.т.н., професор Щж Б.Р.
200
