CC BY
19
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro Ha^OHaibHoro ymBepcurery BeTepHHapHOi MegnuUHH Ta 6i0TexH0iroriH iMeHi C.3. f^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyj
doi: 10.15421/nvlvet7510
ISSN 2519-268X print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
УДК 577.112.083/122.2
Отримання казешових фосфопептидiв за дп протеолггичних систем лактококiв
В.Г. Юкало, Л.А. Сторож biotech@tu.edu.te.ua
Тернотльський нащональний техмчний ушверситет iMeHi 1вана Пулюя, вул. Руська, 56, м. Тернотль, 46001, Украта
Протеши молока, зокрема протеши казеинового комплексу, е попередниками бiологiчно активних пептидiв. Ц пептиди утворюються в процеа розщеплення казе'тв травними протеазами у шлунково-кишковому трактi. Також вони можуть звтьнятися тд час технологiчних процеЫв виробництва молочних продуктiв за ди молокозгортальних препаратiв та ен-зимiв протеолтичних систем молочнокислих бактерт. Одними iз найважливших бiологiчно активних пептидiв, ят утворюються з казе'тв, е фосфопептиди. Вони позитивно впливають на засвоення кальщю та тших двовалентних ютв мета-лiв. Для отримання фосфопептидiв iз казету використовують активт протеолтичт препарати тваринного, рослинного i мiкробiологiчного походження. Не з 'ясованим залишаеться питання можливостi утворення фосфопептидiв за ди протеаз молочнокислих бактерт, зокрема лактокотв, ят поширеш в молоц та молочних продуктах. Метою нашоI роботи було встановити можливкть утворення казетових фосфопептидiв за дп ензимiв протетаза-позитивних протеолтично активних лактокотв. Для до^джень була використана протеолтична система, яка дозволила збыьшити активтсть протеаз лактокотв. Були вiдiбранi три штами протетаза-позитивних протеолтично активних лактокотв рiзних пiдвидiв. Як субстрати були видтею загальний кислотний казе'т, нативний мщелярний казе'н, сумш фракцт а8]-СМ i а82-СМ, @-СМ. У вах випадках вихiд фосфопептидiв не перевищував 3%. Такий вихiд е занадто низьким для виробництва фосфопептидiв, але може мати значення при !х утворенн у ферментованих молочних продуктах.
Ключовi слова: фосфопептиди, казе'н, лактококи, протеолiз.
Протеины молока, в частности протеины казеинового комплекса, являются предшественниками биологически активных пептидов. Эти пептиды образуются в процессе расщепления казеина пищеварительными протеазами в желудочно-кишечном тракте. Также они могут освобождаться при технологических процессах производства молочных продуктов под действием молокосвертывающих препаратов и ферментов протеолитических систем молочнокислых бактерий. Одними из важнейших биологически активных пептидов, которые образуются из казеина, являются фосфопептиды. Они положительно влияют на усвоение кальция и других двухвалентных ионов металлов. Для получения фосфопептидов с казеина используют активные протеолитические препараты животного, растительного и микробиологического происхождения. Невыясненным остается вопрос о возможности образования фосфопептидов под действием протеаз молочнокислых бактерий, в частности лактококков, которые распространены в молоке и молочных продуктах. Целью нашей работы было установить возможность образования казеиновых фосфопептидов под действием энзимов протеиназа-положительных протеолитически активных лактококков. Для исследований была использована протеолитическая систе-
Citation:
Yukalo, V.G., Storozh, L.A. (2017). Obtaining of casein phosphopeptides under the influence of proteolytic systems of Lactococci. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 19(75), 50-54.
Получение казеиновых фосфопептидов под действием протеолитических систем лактококков
В.Г. Юкало, Л.А. Сторож biotech@tu.edu.te.ua
Тернопольский национальный технический университет имени Ивана Пулюя, ул. Русская, 56, г. Тернополь, 46001, Украина
ма, которая позволила увеличить активность протеаз лактококков. Были отобраны три штамма протеиназа-положительных протеолитически активных лактококков разных подвидов. Как субстраты были выделены общий кислотный казеин, нативный мицеллярный казеин, смесь фракций aS1-CN и aS2-CN, fi-CN. Во всех случаях выход фосфопептидов не превышал 3%. Такой выход слишком низкий для производства фосфопептидов, но может иметь значение при их образовании в ферментированных молочных продуктах.
Ключевые слова: фосфопептиды, казеин, лактококки, протеолиз.
Obtaining of casein phosphopeptides under the influence of proteolytic systems of Lactococci
V.G. Yukalo, L.A. Storozh biotech@tu.edu.te.ua
Ternopil National Technical University Ivan Pul'uj, Ruska Str., 56, Ternopil, 46001, Ukraine
Milk proteins, particularly casein complex proteins, are precursors of biologically active peptides. These peptides are formed during the cleavage of caseins by digestive proteases in the gastrointestinal tract. They can also be released during the technological processes ofproduction of dairy products under the influence of milkclotting preparations and enzymes ofproteolytic system of lactic acid bacteria. One of the most important bioactive peptides formed of casein, is phosphopeptide. Phosphopeptides positively affect the absorption of calcium and other divalent metal ions. To get phosphopeptides from casein active proteolytic preparations of animal, plant and microbiological origin are used. The possibility of formation of phosphopeptides under the influence of lactic acid bacteria proteases, in particular lactococci that are common in milk and dairy products had not been clarified. The aim of our study was to establish the possibility of formation casein phosphopeptides under the influence of proteinase-positive proteolytically active lactococcus' enzymes. Proteolytic system which allowed increasing the activity of lactococcus proteases was used for research. Three strains of proteinase positive proteolytically active lactococci different subspecies were selected. The total acid casein, native micellar casein, the amount of fractions 6S1-CN and 6S2-CN, в-CN were identified as substrates. It has been established that both preparations of total casein split better under the influence of selected lactococci strains. However, at the beginning ofproteolysis the intensity of splitting was slightly higher for undenatured micellar casein compared to the acid casein. Fractions aS-CN-XP i P-CN-5P were less sensitive to proteolytic system of lactococcus. After three hours of incubation, the selection of phopsphopeptides has been implemented. In all cases, their output did not exceed 3%. Such output is too low for phopsphopeptides production but may be important for their formation in fermented dairy products.
Key words: phosphopeptides, casein, lactococci, proteolysis.
Вступ
Лактококи для забезпечення свого розвитку в мо-лощ використовують в першу чергу вшьт амшокис-лоти та компоненти протеозо-пептонно! фракцп. Далi розвиток протешаза-негативних штамiв припиняеть-ся. Протешаза-позитивш штами здатш розщеплювати протеши молока i продовжувати свш розвиток завдя-ки послвдовнш до ензимiв протеолгтично! системи: приклгтинних протешаз, мембранних i внутршньок-лгтинних протешаз та пептидаз. Окремi штами лактокошв характеризуются високою загальною протеоль тичною актившстю, а !хш приклгтинш проте!нази мають широку специфiчнiсть до по вщношенню до протешш казешового комплексу. Показано, що прик-лгтинна проте!наза лактокошв лише Р-казе!н може розщеплювати з утворенням бшьше сотш рiзних пеп-тидiв (Juillard et al., 1995).
На сьогодшшнш день встановлено, що в процеа протеолiзу протешв казешового комплексу утворю-еться велика шльшсть пептидiв з рiзними видами бюлопчно! активность Одними з найважливших е казофосфопептиди, яш вщграють суттеву роль у забезпеченш оргашзму юнами кальцш та шшими двовалентними юнами металiв (Yukalo et al., 2012). Нами рашше були охарактеризовав протешаза-позитивш штами лактокошв Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. сгemoris i Lactococcus lactis biovar. diacetylactis та вццбраш штами з найбь
льшою протеолггачною актившстю (Yukalo and Storozh, 2011). Так1 штами, очевидно, можуть призво-дити до зв1льнення фосфопептид1в при використанш протешв казешового комплексу в процеа проте!но-вого живлення.
Метою роботи було встановити можливють утво-рення казофосфопептид1в за дп ензим1в проте1наза-позитивних протеолггично активних лактокошв.
MaTepia™ i методи дослщжень
Для дослвдження було вщбрано стшш протеолгга-чно активш штами l12 (Lactococcus lactis subsp. lactis), c4 (Lactococcus lactis subsp. cremoris) i d7 (Lactococcus lactis biovar. diacetylactis), яш культивуються на кафе-дрi харчово! бютехнологп i хiмil Тернопiльського нацiонального технiчного унiверситету iменi 1вана Пулюя. Штами пiдтримували шляхом переавання у знежирене стерилiзоване молоко через кожш 20 днiв.
Протеолггачну активнiсть лактокок1в визначали методом Гула в модифжаци Залашка М.В. (Zalashko et al., 1970). В основi методу - реакцiя реактиву Фоль на iз залишками тирозину та триптофану продукпв протеолiзу казе!ну. Оптичну густину забарвлених продуктiв протеолiзу визначали спектрофотометрич-но при довжинi хвилi 650 нм.
Як субстрати використовували загальний казе!н, який видiляли iз свiжого молока подвiйним переоса-дженням в iзоелектричнiй точцi, та мщелярний казе!н,
який отримували при розшаруваннi системи «протеш - кислий полiсахарид - вода» в умовах термодинамь чно1 несумiсностi компонентiв (Yukalo, 2005). 1з зага-льного казешу видiляли сумш фракцiй aSi-CN i aS2-CN шляхом диференцшного осадження. Роздiлення aS-CN i P-CN фраIcцiй проводили з врахуванням вщ-мiнностей в ïx розчинностi в присутностi сечовини при значениях pH близько 4,6 (Yukalo and Storozh, 2010).
Концентрацш протешв у препаратах визначали за поглинанням при довжинi xвилi 280 нм на спектрофо-тометрi СФ-46. При цьому використовували загаль-ноприйнятi коефщенти поглинання: 10,0 - для aS1-CN; 10,1 - для as2-CN; 4,6 - для P-CN i 8,2 - для зага-льного казешу.
Фосфопептиди iз гiдролiзатiв видшяли осаджен-ням солями кальцiю в присутносл етанолу, як описано рашше (Yukalo and Storozh, 2013).
В робол на графiкаx наведено середш значення, отриманi в результат п'яти вимiрювань. Математич-но-статистичий аналiз виходу фосфопептидiв проводили з використанням програми Microsoft Office Excel 2003.
Результати та ïx обговорення
Для проведення дослвджень з метою отримання фосфопептидiв були вiдiбранi стшш протеолiтично активнi штами l12, c4, d7. Очищену бiомасу, яку використовували для протеолiзу фосфопротеïнiв, отримували за методикою вирощування лактокошв у знежи-реному молоцi в присутносл р-глщерофосфату (Yukalo, 2006). При цьому, як було показано рашше новозеландськими вченими Т. Томасом i О. Мшсом, молочнокислi лактококи збертають сво1 протеолгтич-нi системи, в тому числ1 i приклiтиннi протешази. Нарощування бiомаси вiдiбраниx штамiв проводили за схемою, вказаною на рис. 1.
Знежгфене молоко 3 M р-глщерофосфат
Змппування та автожлавування
1нокуляц1я +- активованоТ
.. культура
1нкубагш протягом 7 годин при 30°С (до T4so=0,59)
I
Центрнфугування (7 000 g, 10 хвнлин)
I
Ресуспендуванняв 0.1 M фосфатному буфер! (4°С.рН 7.7)
I
Центрнфугування (7 000 g. 10 хвнлин)
I
Ресуспендування в 0,1 M фосфатному буфер1(4"С. рН 7,7)
I
Центрнфугування (7 000 g. 10 хвнлнн)
+
Очищенi к.iimuHU шктокикш
Рис. 1. Схема нарощування бюмаси лактококiв у присутностi р-глщерофосфату
Отриманi таким чином очищенi клггини лактоко-кiв використовували для протеолiзу фосфопротешо-вих субстратiв. Iнкубуваиня проводили у термостат
при температур1 30 °С. Значення рН тдтримували на piBHi 5,5. До 18 мл 2% фосфопротешового субстрату в 0,05 М ацетатному буферi (рН 5,5) вносили 2 мл бюмаси лактокошв, отримано1 в молочному середовищi у присутносл ß-глiцерофосфату (рис. 1). Стутнь протеолiзу оцiнювали через кожш 60 хвилин протягом 3 годин. При цьому з реакцшно1 сумiшi вiдбирали по 3 мл гiдролiзату, додавали по 3 мл 10% трихлороц-тово1 кислоти. Осад нерозщеплених протеïнiв ввдфь льтровували. Розчинш продукти протеолiзу розводи-ли в десять разiв 5% оцтовою кислотою i вимiрювали оптичну густину на спектрофотометрi СФ-46 при довжинi хвилi 280 нм. Для отримання об'ективних результатiв ми припустили, що продукти протеолiзу кожноï фракцiï мають так ж коефiцieнти поглинання, як i самi фракцiï. А саме, загальний препарат фосфоп-ротеïнiв i його гiдролiзат - 8,2; ß-CN-5P i його пдро-лiзат - 4,6; для сум^ aS1-CN-XP i aS2-CN-XP та ïï гiдролiзатiв, враховуючи сшвввдношення цих фрак-цiй, для розрахуншв вибрали значення 10,0. Було зроблено наступи перерахунки: Е280 для загального препарату фосфопротешв залишали без змiн; Е280 для ß-CN-5P перемножували на 1,78; Е280 для aS-CN-XP перемножували на 0,82. Отримаш результати щодо ходу протеолiзу представлено у виглядi графшв на рис. 2, 3 i 4 на основi середнiх значень п'яти вимiрю-вань.
О 60 120 180
Триввшсть, хв.
мщСЛЯркий (|jOC[|»0llp0TCÏ}l —*— ß-CN-5P
загальмнй препарат фосфопроте'Мв —ч— u.-t N-ХГ
Рис. 2. Протеолiз фосфопротешових субстратв лактококами п1двиду Lactococcus lactis subsp. lactis (штам //;)
0 60 120 ISO
Три вал Есть. кв.
мщелярчмй фосфогтротцмi —*— (Ï-CN-5P
¡ai альннй препарат фосфоиротеиав —м— as-CN-XP
Рис. 3. Протеолiз фосфопротешових субстратiв лактококами шдвиду Lactococcus lactis subsp.cremoris (штам с4)
Phc. 4. npoieo^i3 $0C$0np0ieiH0BMx cyßcipaiiB ■aKiOKOKaMM nigBMgy Lactococcus lactis biovar. diacetylactis (miaM d7)
Ha rpa^iKax MomHa no6aHHTH BigMiHHocTi b iHTeH-CHBHOCTi npoTeom3y $0C$0np0Tei'H0BHx cy6crpariB BHÖpaHHMH mTaMaMH naKTOKoKiB. HanBHiy aKTHBHicrb noKa3aB mTaM l12 nigBHgy Lactococcus lactis subsp. lactis. B ycix BunagKax iHTeHCHBHo po3ieraraB&iHca npenapaTH 3ara^bHoro $oc$onpoTei'Hy. Miue^apHHH npenapaT HegeHarypoBaHux $oc$onpoTeiHiB noKa3aB 6^H3bKi 3HaneHHa go Kuc^oTHoro 3araibHoro npenapaTy $oc$onpoTei'HiB. npunoMy, Ha nonarKy npoTeom3y iHTeHCHBHicTb Horo po3ieraeHHa 6y^a gego bhiom, go b neBHrn Mipi y3rogmyeTbca 3 TBepgmeHHaMH M. ^eprnKoBa npo 6iflbmy gocrynHicrb HegeHarypoBa-hhx motohhhx npoTeiHiB go gii' TpaBHHx npoTea3 (Chernikov, 1975). A^e Ha ni3Himux eTanax npoTeom3y cyrreBHx BigMiHHocTen b iHTeHCHBHocTi po3gen^eHHa o6ox npenapaTiB 3ara^bHoro $oc$onpoTei'Hy 3a gii' npo-Tea3 flaKToKoKiB He cnocTepiraroca. m CTocyeTbca cy6cTpaTiB aS-CN-XP i ß-CN-5P, to bohh BuaBH^uca MeHm nyTjiHBHMH go gii' npoTeojiiriHiHoi CHCTeMH naK-tokokb. Pa3oM 3 thm, $oc$onpoTei'H ß-CN-5P Kpage
Та6мицм 1
Buxig (|)()C(|)()iiciiiii.iiB nicra npoieo^i3y $0C$0np0ieiH0BMx cyßcipaiiB npoieiMa3a-no3MiMBMMMM miaMaMH
■BaKTOKQKiB (M ± m, n = 5)
po3ieraraBaBca npu iHKy6aqii' 3i mTaMoM l12 nigBHgy Lactococcus lactis subsp. lactis. ,3,o npoTea3 mTaMiB c4 nigBHgy Lactococcus lactis subsp. cremoris Ta d7 nigBHgy Lactococcus lactis biovar. diacetylactis HyraHBimuMH 6y^H $oc$onpoTei'HH cyMimi aS-CN-XP.
nicna Tpbox rogHH iHKy6yBaHHa Big6upa^H npo6u g^a BHgi^eHHa $oc$onemugiB. 3HaneHHa pH rigpofli3a-Ty goBoguflH 1 H x^opugHora khc^otom go 4,6 gna oca-gmeHHa Hepo3ieraeHHx npoTei'HiB, aKi noTiM Biggina^H ueHTpu^yryBaHHaM. ^o 9 m^ orpuMaHoi' HagocagoBoi' piguHH, aKa MicTH^a npogyKTH npoTeom3y, gogaBa^u 1 Mfl 10% CaCl2 i 10 Mfl eTaHo^y. Ocag $oc$onenrugiB oTpuMyBa^H uempH^yryBaHHaM, npoMHB&m eTaHo^oM, BHcymyBa^H go nocriHHoi' Macu i 3BamyB&m. ,3,aHi 3Ba-myBaHHa HaBegeHi y Ta6fl. 1. Pe3y^braTH orpuMaHo Ha ocHoBi n'aTH noBTopHocTen 3 ko®hom i3 KoM6maum.
,3ga o6ox npenapaTiB 3ara^bHoro $oc$onpoTemy, a TaKom onugeHoro $oc$onpoTei'Hy ß-CN-5P BHxig $oc-^onenTugiB 6iflbmHM 6yB npu BHKopucTaHHi KrnrHH mTaMy l12. y BunagKy cyMimi $oc$onpoTei'HiB aS-CN-XP, npu iHKy6yBaHHi ii 3i mTaMoM l12 BHxig 6yB MeHmun, Him 3i mTaMaMH c4 Ta d7. ,3ga Bcix $oc$onpoTei'HoBHx cy6cTpariB BHxig $oc$onemugiB 6yB HH3bKHH i He ne-peBHiyBaB 3%. ^ Mome MaTH 3HaneHHa npu yTBopeHHi $oc$onenTugiB y ^epMemoBaHux mo^ohhhx npogyK-Tax, a^e g^a Bugi^eHHa npenapaTiB $oc$onenTugiB TaKHH BHxig 3aHagTo HH3bKHH i npouec He e onpaBga-hhm. npu Bupo6HHUTBi ^epMeHToBaHHx mo^ohhhx npo-gyKTiB Mome npoBoguTuca ce^eKqia mTaMiB motohhokh-Cflux 6aKTepin gna orpuMaHHa 6io^oriHHo aKTHBHux nenTugiB, 3oKpeMa $oc$onenragiB. TaK, $paHuy3bKHMH BHeHHMH (Algaron et al., 2004) MeTogaMH reHHoi' iHme-Hepii' 6yflH CKoHCTpynoBaHi mTaMH, aKi go3Bo^aMTb 36iflbmuTH BHxig $oc$onenTugiB 3 npoTeiHiB Mo^oKa npu Bupo6HHUTBi ^epMeHToBaHux mo^ohhhx npogyKTiB.
Cy6cTpaT
fflraM 3arantHHH npenapaT ^oc^onpoTeiHiB M^enapHHn ^oc^onpo-TeiH aS-CN-XP ß-CN-5P
K-Tb ^oc^o-nenTHgiB, BHxig, % K-Tb $oc$o-nenTHgiB, BHxig, % K-Tb ^oc^o-nenrugiB, BHxig, % K-Tb $oc$o-nenTHgiB, BHxig %
Mr Mr Mr Mr
Lactococcus
lactis subsp. 2,7 ± 0,2 1,50 2,5 ± 0,2 1,39 1,5 ± 0,1 0,83 1,6 ± 0,2 0,89
Lactis (l12)
Lactococcus
lactis subsp. 2,3 ± 0,1 1,28 2,3 ± 0,2 1,28 1,9 ± 0,2 1,06 1,3 ± 0,1 0,72
Cremoris (c4)
Lactococcus
lactis biovar. 1,9 ± 0,1 1,06 2,0 ± 0,1 1,11 1,8 ± 0,1 1,00 1,4 ± 0,1 0,78
diacetylactis (d7)
Bmcmobu'm
npu oTpuMaHHi $oc$onenTugiB 3 BHKopucTaHHaM npoTei'Ha3a-no3HTHBHHx npoTeo^iTHHHo aKTHBHux mTaMiB naKTOKoKiB i HoTupbox BugiB ^oc^onpoTeiHoBux cy6cTpaTiB (3ara^bHHH khc^othhh Ka3ei'H, HaTHBHHH
Miue^apHHH Ka3ei'H, cyMim aSi-CN i aS2-CN, ß-CN) y Bcix BunagKax BHxig 6yB HH3bKHM i He nepeBHigyBaB 3%. TaKHH BHxig e 3aHagTo HH3bKHM gna Bupo6HHUTBa $oc$onenTHgiB, are Mome MaTH 3HaneHHa npu i'x yTBopeHHi y ^epMeHTOBaHHx mo^ohhhx npogyKTax.
Перспективи подальших до^джень. У подальшш робот потрiбно вiдiбрати молочнокислi палички, протеолiтична активнiсть яких вища порiвняно з лактококами. Вони можуть бути використанi для отримання бiльшоï кiлькостi фосфопептидiв i створення функцюнальних харчових продуктiв.
Бiблiографiчнi посилання
Juillard, V., Laan, H., Kunji, E.R. (1995). The extracellular PI-type proteinase of Lactococcus lactis hydrolyzes P-casein into more than one hundred different oligopeptides. J. Bacteriol. 177(12), 3472-3478. Yukalo, A.V., Storozh, L.A., Yukalo, V.H. (2012). Pro-teiny kazeinovoho kompleksu moloka koriv (Bos taurus) yak poperednyky biolоhichno aktyvnykh pepty-div. Biotekhnolohiia. 5(4), 21-33 (in Ukrainian). Yukalo, V.H., Storozh, L.A. (2011). Proteoliz riznykh frakzii kazeinu fermentnymy systemаmy laktokokiv. Kharchova promyslovist. 10, 144-148 (in Ukrainian). Zalashko, M.V., Obraztsova, N.V., Savchenko, E.I. (1970). Issliedovaniie proteoliticheskoi aktivnosti mo-lochnokislykh baktierii. Fiziologiia i biokhimiia
mikroorganizmov. Minsk: Nauka i tiekhnika, 121-128 (in Russian).
Yukalo, V.G. (2005). Obtaining of casein protein complex fractions from cow milk. Nutracos. 5, 17-19.
Yukalo, V.H., Storozh, L.A. (2010). Vydilennia sumishi aS-kazeiniv koroviachoho moloka dlia otrymannia bi-oaktyvnykh peptydiv. Naukovi pratsi NUKHT. 33, 58-60 (in Ukrainian).
Yukalo, V., Storozh, L. (2013). The isolation of phospho-peptides from total casein and its fractions. Food chemistry and technology. 47(2), 32-40.
Yukalo, V.H. (2006). Modelna proteolitychna systema dlia vydilennia bioaktyvnykh peptydiv z bilkiv kazeinovoho kompleksu. Materialy IX Ukrainskoho biokhimichnoho zyizdu. Kyiv: IB NAN Ukrainy (in Ukrainian).
Chernikov, M.P. (1975). Proteoliz i biologichiеskaia tsennost bielkov (kazeiny kak sobstvienno pishchievy-ie bielky). M.: Mieditsina (in Russian).
Algaron, F., Miranda, G., Le Bars, D., Monnet, V. (2004). Milk fermentation by Lactococcus lactis with modified proteolytic systems to accumulate potentially bio-active peptides. Lait. 84, 115-123.
Стаття надiйшла до редакцН 6.02.2017
