CC BY
14
HayKOBHH BicHHK ^HyBME iMeHi C.3. IW^KOTO, 2018, T 20, № 85 HayKOBMM BiCHMK ^tBiBCtKoro Ha^OHa^tHoro yHiBepcMTeTy
BeTepMHapHoi Megw^HM Ta öioTexHO^oriw iMeHi C.3. I^M^Koro
Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies
ISSN 2519-268X print doi: 10.15421/nvlvet8501
ISSN 2518-1327 online http://nvlvet.com.ua/
UDC 637.127.576
Dextran gels for the exclusive chromatography of milk serum proteins
V.G. Yukalo, K.Ye. Datsyshyn
Ternopil Ivan Pul'uj National Technical University, Ternopil, Ukraine
Yukalo, V.G., & Datsyshyn, K.Ye. (2018). Dextran gels for the exclusive chromatography of milk serum proteins. Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies. 20(85), 3-8. doi: 10.15421/nvlvet8501
The ability of serum proteins to form biologically active peptides as a result of proteolysis in the gastrointestinal tract stimulated the research of the ways of their selection. Homogeneous serum proteins (P-lactoglobulin, a-lactalbumin, lactoferrin, serum albumin, immunoglobulins) are necessary for isolating, researching and using biologically active peptides. Today, there are many industrial techniques and laboratory methods that allow obtaining the individual purified serum proteins. They include ultrafiltration or diafiltration, demineralization by electrodialysis, thermal denaturation, differential healing, preparative electrophoresis on paper, ion-exchange chromatography on DEAE-cellulose, and others. The main disadvantages of these methods are many stages, duration of procedure as well as the use of extreme factors, which can lead to the structure damage and changes in the composition of protein molecules. In view of above, an exclusive chromatography on dextran gels may be promising. This method has several advantages: accessibility, the ability to perform fractionation in different conditions (temperature, ionic composition, pH), simultaneous purification from low molecular compounds of milk serum, minimal damage to protein molecules. It is important to choose the correct gel and to separate the chromatographic peaks into sectors for analyzing the protein composition in order to improve the resolution of the method. The purpose of the work was to select a dextran gel for fractionating milk serum proteins with exclusive chromatography. Taking into account the range of molecular masses of serum proteins, the following dextran gels were chosen: G-75, G-100 and G-150. The studies were carried out in columns of chromatography set for liquid chromatography of «Reanal» company. The fractional composition and homogeneity of the serum proteins were determined by disc-electrophoresis in the native conditions for neutral and acidic proteins in the plates of the polyacrylamide gel. The proteins composition in selected chromatographic fractions was analyzed by disc-electrophoresis in a polyacrylamide gel. The obtained results indicate the expediency of using exclusive chromatography on dextran gels to isolate homogeneous serum protein in native conditions. The most promising for the first .stage of immunoglobulins, p-lacto-globulin, a-lactalbumin and proteose-peptone fraction obtaining appeared the sephadexes G-100 and G-150 by the electrophoresis results.
Key words: milk whey proteins, protein fractions, exclusive chromatography.
- ■ • • M 1 ••• •• •
Декстранов1 гел1 для ексклюзивно1 хроматографп протешш сироватки молока
В.Г. Юкало, К.С. Дацишин
Тернотлъсъкий нацiональний техтчний yuieepcumem iMeHi 1вана Пулюя, м. Тернотлъ, Украгна
Здаттстъ протегтв сироватки молока утворювати бюлоачно активт пептиди в резулъ-mami nротeолiзy в шлунково-кишковому mрaкmi стимулювала до^дження шляхiв гх видтення. Гомогент протегни сироватки ф-лактоглобулт, a-лакталъбумт, лактоферин, алъбумт сироватки кровi, муноглобулти) нeобхiднi для видтення, до^дження i застосування бюло-гiчно активних nenmидiв. Вiдомi методи фракцюнування протегтв сироватки часто е складними, багатостадтними або призво-дятъ до денатурацп протегтв. У зв 'язку з цим, перспективною може бути ексклюзивна хромamогрaфiя на декстранових гелях. Цей метод мае ряд переваг: доступтстъ, можливктъ проводити фракцюнування в рiзних умовах (температура, юнний склад, рН), мтмалъне пошкодження молекул протегтв. Метою роботи було проведення вибору декстранового гелю для фракщонування протегтв сироватки молока ексклюзивною хромamогрaфiею. Враховуючи дianaзон молекулярних мас протегтв сироватки, було вибрано нaсmynнi дeксmрaновi гелг. G-75, G-100, G-150. До^дження проводили на колонках з хромamогрaфiчного набору для
Article info
Received 10.01.2018 Received in revised form
19.02.2018 Accepted 21.02.2018
Ternopil Ivan Pul'uj National Technical University, Ruska St., 56, Ternopil, 46001, Ukraine Tel. :+38-097-788-46-96 E-mail: katkostyuk3103@gmail. com; biotech@tu.edu. te.ua
píóuHHo'i хроматографа фiрми «Reanal». Слад протегтв у eidi6paHux хроматографiчних фракцiях aHanisyeanu диск-електрофорезом в полiaкрилaмiдному гелi. Отримаш результати ceid4amb про доцтьтсть використання ексклюзивног хроматографа на декстранових гелях для видшення гомогенних протегтв сироватки молока в нативних умовах. НайбЫьш перспективными для першог стадп отримання туноглобултв, р-лактоглобулту, а-лактальбумту i протеозо-пептонног фракцп за даними елект-рофорезу виявились сефадекси G-100 i G-150.
Ключовi слова: протегни сироватки молока, протеmовi фракцп, ексклюзивна хромaтогрaфiя.
Вступ
Фракцшний склад протйшв сироватки молока вивчаеться з початку минулого столитя. Вже у 70-х роках були отримаш кристали основних проте1шв сироватки молока (Fox et al., 2015; Yukalo and Datsyshyn, 2017). На сьогодшшнш день розроблено декшька шдход1в для примислового видшення за-гального протешу сироватки. До найбшьш пошире-них вшносяться: ультраф1льтращя або д1аф1льтращя, демшерал1защя електрод1ал1зом, юнообмшна хрома-тограф1я i термальна денатуращя. Також у препара-тивних кшькостях можна отримати протеши сироватки молока висолюванням та ексклюзивною хромато-графieю або гель-фiльтрацieю (McSweeney and Fox, 2013). Вщкриття додатково! функцй' протегнш сироватки молока, а саме здатностi утворювати бюлопчно активнi пептиди у процесi протеолiзу в шлунково-кишковому трактi стимулювало пошук методiв отримання окремих протешових фракцiй (Iukalo et al., 2013). На сьогодшшнш день вщомо багато лабора-торних методик, яш дозволяють видiлити окремi очищенi протеши. Це диференцшне висолювання (з використанням MgSO4 або (NH4)2SO4), препаративний електрофорез на паперi, iонообмiнна хроматографiя на ДЕАЕ-целюлозi та iн. (Konrad, 2008; Lozano, 2008). Недолшами цих методiв е багатостадiйнiсть, дов-готривалiсть та використання екстремальних фак-торiв, що можуть призвести до пошкодження струк-тури i змiни складу молекул проте!шв.
У звязку з цим, перспективною може бути ексклюзивна хроматографiя на декстранових гелях. Препаративний варiант цього виду хроматограф^' вже усшшно використовувався для отримання загального протешу сироватки молока (McSweeney and Fox, 2013). До переваг ексклюзивно! хроматограф^' можна вiднести li доступнiсть, можливiсть проведения фракшонуван-ня в рiзних умовах (температура, рН, склад iонiв), одночасну очистку вш низькомолекулярних сполук сироватки молока, мштальт пошкодження молекул проте1шв у процеа фракцiонування. До недолiкiв вiдноситься менша роздiльна здатнiсть у порiвняннi з шшими видами хроматограф^'. Для шдвищення роздшьно1 здатностi методу важливим е правильний вибiр гелю, а також роздшення хроматографiчних пiкiв на сектори для аналiзу протешового складу.
Метою роботи було вибiр декстранового гелю для фракцюнування протегнш сироватки молока ексклюзивною хроматографiею.
Матерiал i методи дослщжень
Сироватку отримували зi свгжого молока кис-лотнiстю 17-19 °Т. Молоко знежирювали центри-фугуванням (5000 об/хв протягом 15 хв). Протеши
казешового комплексу вiддiляли центрифугуванням пiсля iзоелектричного осадження при рН 4,6. Протеши сироватки молока очищали вщ низькомолекулярних сполук i переводили в середовище необхшно-го буферу гель-фттрашею на колонш з сефадексом G-25 («Pharmacia»).
Концентрацш проте1шв визначали спектрофото-метрично (X = 280 нм). Для розрахунку концентрацп використовували наступнi коефiцiенти поглинання (D^) : 19,6 - для р-лактоглобулшу (P-BG); 20,1 - а -
лактальбум^ (а-LA) i 12,3 - для загального протешу сироватки молока (Farrell et al., 2004).
Ексклюзивну хроматографш протегнш сироватки молока проводили на декстранових гелях фiрми «Pharmacia» в колонках з набору для рщинно1 хрома-тографп фiрми «Reanal». В хроматографiчних i елек-трофоретичних досл1дженнях, а також для приготу-вання буферiв використовували реактиви фiрми «Pharmacia», «Reanal», «Sigma» та вичизняш реакти-ви високого ступеня очистки.
Фракцiйний склад i гомогеншсть проте1шв сиро-ватки молока визначали диск-електрофорезом в на-тивних умовах для нейтральних i кислих протегнш в пластинках полiакриламiдного гелю (ПАГ) (Yukalo et al., 2009). Гелi фiксували i фарбували загальноприй-нятими методами. Кiлькiсну обробку електрофоре-грам проводили використовуючи функцiю зчитування графiчних зображень imread (Yukalo et al., 2007).
Результати та ix обговорення
При виборi декстранового гелю враховували мо-лекулярнi маси проте1шв, а також особливосп гх про-сторово1 структури i фiзико-хiмiчних властивостей. Серед протешв сироватки молока до попереднишв бiоактивних пептидiв вiдносяться р-лактоглобулш (М = 18363 Да); а-лактальбумш (М = 14178 Да); аль-бумш сироватки кровi (М = 66399 Да); лактоферин (М = 76110) i за даними окремих авторiв iмуноглобу-лши (М вiд 150000 до 500000 Да) (Farrell et al., 2004; Iukalo et al., 2013). Bri вказаш фракцп вщносяться до глобулярних проте1шв, розчиннi при фiзiологiчних значеннях температури i рН. Важливою властивiстю Р-лактоглобул^ е його здатшсть утворювати в пев-них умовах димери та октамери (Fox et al., 2015). Необхшно вщзначити, що велику кiлькiсть природних бюактивних пептидiв мiстить низькомолекулярна протеозо-пептонна фракщя. Тому ll видiлення теж бажано передбачити шд час ексклюзивно1 хромато-графп протешв сироватки молока.
Гель, який мiг би забезпечити фракцюнування молекул проте1шв з таким дiапазоном молекулярних мас вiдсутнiй (Osterman, 1985). Проте, якщо поставити за мету видшення, о^м гомогенних фракцш, ще двох
rpyn прoтeïнiв (iмyнoглoбyлiни) i пeптидiв (прoтeoзo-пeптoннa фрaкцiя) - то мoжнa вибирaти з трьox вид1в гeлю. Цe ceфaдeкc G-75 (дiaпaзoн фрaкцioнyвaння 3000-70000 Дд), ceфaдeкc G-100 (4000-150000 Дд) i ceфaдeкc G-150 (5000-300000 Дд). При цьoмy y вcix випддкax мoжнa cпoдiвaтиcь га видiлeння фрдкцш ß-LG, a-LA, BSA i LF. Групд iмyнoглoбyлiнiв мoжe вийти з oб'eмoм eлюeнтy близьким дo вiльнoгo oб'eмy кoлoнки, a групд пeптидiв ППФ вийдe з oб'eмoм близьким дo швшго oб'eмy кoлoнки.
Рeзyльтaти eкcклюзивнoï xрoмaтoгрaфiï cирoвaтки мoлoкa нд ceфaдeкci G-75 пoкaзaнi нд риc. 1.1. Ha xрoмaтoгрaмi виднo лишe двд тки. Шрший acимeт-ричний п1к пeрeд aнaлiзoм прoтeïнoвoгo cклaдy ми рoздiлили нд три ceктoри (I, II, III). Об'едндш фрдкцй' кoжнoгo cera^a, a тaкoж дрyгoгo xрoмaтoгрaфiчнoгo шку (ceктoр IV) дндл1зувдли диcк-eлeктрoфoрeзoм нд плacтинкax ПАГ. Рeзyльтaти eлeктрoфoрeзy пoкaзaнi на електрофореграм1 (рис. 1.2.). Контрольный внрсць
2,5
cирoвaтки мicтить ocнoвнi прoтelни вiдпoвlднo дo дiючoï клacифiкaцiï (Farrell et al., 2004). У вcix вщб-рaниx ceктoрax фкрш ceктoрy IV) виднo cyмiш прoтe-ïнiв. У ceктoрi I i II прeдcтaвлeнi вci ocнoвнi прoтeïни cирoвaтки, a ceктoрi III - cyмiш низькoмoлeкyлярниx iмyнoглoбyлiнiв тд фрдкцш ß-LG i a-LA. Bci низьто-мoлeкyлярнi кoмпoнeнти прoтeoзo-пeптoннoï фрдкцп рoзмiщeнi в дрyгoмy xрoматoграфiчнoмy п1ку (cera^ IV). Зaгaлoм oтримaнi рeзyльтaти cвiдчaть прo низьку eфeктивнicть ceфддeкcy G-75 при фрдкцюнувднш прoтeïнiв cирoвaтки мoлoкa.
Ha риc. 2 i 3 прeдcтaвлeнi рeзyльтaти eкcклюзивнoï xрoмaтoгрaфiï cирoвaтки мoлoкa нд ceфддeкcax G-100 i G-150 ввдшввдш. Отримдш пoдiбнi xрoмaтoгрaфiчнi прoфiлi, яш cклдддютьcя з трьox п1к1в. Другий п1к в o6ox випддкax acимeтричний i тoмy ми дого рoздiли-ли при вiдбoрi зрдзк1в для eлeктрoфoрeтичнoгo дндл1зу нд двд ^кюри (II i III).
1,5
0.5
10
20
30
« Фракцп »
Рис. 1. Хрoмaтoгрaмa (1) прoтeïнiв cирoвaтки мoлoкa oтримaнa eкcклюзивнoю xрoмaтoгрaфieю нд ceфддeкci G-75. Елeктрoфoрeгрaмa (2) зaгaльнoгo прoтeïнy cирoвaтки (2.1) тд ïï oкрeмиx Фрдкц1й ceктoрy I (2.2), ^^юру III
(2.4) тд те^иру IV (2.5)
з п
Фракцн
Рис. 2. Хроматограма (1) проте!шв сироватки молока отримана ексклюзивною хроматограф1ею на сефадекс G-100. Електрофореграма (2) загального протешу сироватки (2.1.) та об'еднаних фракцш сектору I (2.2); сектору
II (2.з); сектору III (2.4) та сектору IV (2.5)
Вщбраш об'еднаш фракци кожного сектору д1ал1зували проти електрофоретичного буферу 1 анал1зували диск-електрофорезом в ПАГ. До складу першого хроматограф1чного тку входять високомо-лекулярш проте!ни-1муноглобулши, лактоферин 1 альбумш сироватки. Сектори другого хроматограф1ч-ного тку мютять у р1зних сшввщношеннях P-LG 1 а-LA. У четвертому сектор1 (третш хроматограф1чний шк) розмщеш низькомолекулярш компоненти проте-озо-пептонно! фракци. Вони не фшсуються у ПАГ 1 електрофоретична дор1жка 5 на електрофореграмах
(рис. 2.2 1 рис. 3.2) не заповнена. В результат! фракць онування проте!шв сироватки молока на сефадексах G-100 1 G-150 не отримано т одше! гомогенно! фрак-ц!!, але сумш1 перших трьох сектор!в е перспектив-ними для вид!лення !ндив!дуальних проте!шв. Так, з першого сектора не складно вщдшити 1муноглобуль ни, а вмют другого ! третього сектор!в можна роздши-ти на дв! фракц!! P-LG ! а-LA. Цього можна досягнути повторною ексклюзивною хроматограф!ею з под!лом хроматограф!чних п!к1в на сектори.
W
2.5 -
1,5 -
0.5 -
10 20 30 40 50
Фракцп
Рис. 3. Хроматограма (1) протешв сироватки молока отримана ексклюзивною хроматограф1ею на сефадека G-150. Електрофореграма (2) загального протешу сироватки молока (2.1.) та об'еднаних фракцш сектору I (2.2);
сектору II (2.3); сектору III (2.4) та сектору IV (2.5).
Висновки
Отримаш результати свщчать про дошльшсть використання ексклюзивно! хроматографи на декстранових гелях для видшення гомогенних протегнш сироватки молока в нативних умовах. Найбшьш перспе-ктивними для отримання 1муноглобулш1в, р-лактоглобул1ну, а-лактальбум1ну i протеозо-пептонно! фракцп за даними електрофоретичного аналiзу виявились сефадекси G-100 i G-150.
References
Fox, P., Uniacke-Lowe, T., McSweeney, P., & O'Mahony, J. (2015). Dairy Chemistry and Biochemistry. doi: 10.1007/978-3-319-14892-2
McSweeney, P.L.H. & Fox, P.F. (2013). Advanced Dairy Chemistry: Volume 1A: Proteins: Basic Aspects, 4th Edition. doi: 10.1007/978-1-4614-4714-6 Iukalo, A.V., Datsyshyn, K.Ye., & Yukalo, V.G. (2013). Bioaktyvni peptydy proteiniv syrovatky moloka koriv (Bos taurus). Biotekhnolohiia Akta. 6, 49-61 (in Ukrainian).
Konrad, G. (2008). A new method for isolation of native a-lactalbumin from sweet whey. International Dairy Journal. 18(1), 47-54. doi:
10.1016/j.idairyj.2007.06.004 Lozano, J. (2008). An improved method for isolation of P-lactoglobulin. International Dairy Journal. 18(1), 55-63. doi: 10.1016/j.idairyj.2007.05.003 Farrell, H.M., Jimenez-Flores, R., Bleck, G.T., Brown, E.M., Butler, J.E., Creamer, L.K., Hicks, C.L., Hollar,
C.M., Ng-Kwai-Hang K.F., & Swaisgood, H.E. (2004). Nomenclature of the proteins of cows' milk-sixth revision. Journal of Dairy Science. 87(6), 16411674. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(04)73319-6 Yukalo, A., Yukalo, V., & Shynkaryk, M. (2009). Electrophoresis separation of the Milk Protein. Proceedings of the International Conference on Bio and Food Electrotechnologies, 227-231. Yukalo, V.G., Yavorskyy, B.I., Storozh, L.A., & Solovodzinska, I.Y. (2007). Kilkisnyi elektroforetychnyi analiz bilkiv kazeinovoho
kompleksu. Biolohiia tvaryn. 9(1-2), 295-298 (in Ukrainian).
Yukalo, V.G., & Datsyshyn, K.Ye. (2017). Selection of conditions for preparative electrophoresis of milk whey proteins in native conditions. Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies. 19(80), 13-17 doi: 10.15421/nvlvet8003
Osterman, L.A. (1985). Khromatografiya belkov i nukleinovykh kislot. M.: Nauka (in Russian).
