CC BY
4
2B2
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
нейровоспаления [2]. Для получения нейронов и гли-альных клеток в настоящее время используют индуцированные плюрипотентные клетки (ИПСК) человека. Уникальность этого подхода состоит в том, что клеточный материал, полученный от пациентов с генетическими нарушениями, для получения ИПСК будет транслировать эти нарушения во все дифференцированные производные. Таким образом, можно изучать влияние определенной генетической мутации в разных клеточных популяциях, дифференцированных из одной и той же уникальной линии ИПСК.
Ранее нами был показан ряд изменений в профиле экспрессии большого количества генов в дофаминерги-ческих нейронах дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) пациентов с разными мутациями, приводящими к БП [3].
В настоящей работе были получены глиальные культуры, дифференцированные из ИПСК пациентов с мутациями в генах GBA (глюкоцереброзидаза), PARK2 (паркин) и LRRK2 (дардарин), приводящих к БП, и здоровых доноров. Полученные культуры клеток были охарактеризованы с помощью иммуноцитохимического анализа и ПЦР в реальном времени. Была обнаружена дифференциальная экспрессия ряда генов у здоровых доноров и у пациентов с БП. Показано, что в ответ на воспалительные стимулы глиальные клетки меняют экспрессию генов и секреторный профиль, тем самым проявляя свойства иммунокомпетентных клеток.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках соглашения № 075-15-2021-1357.
Литература:
1. Cookson M.R., Handy J., Lewis P.A. International journal of clinical and experimental pathology, 2008.V. 1. P. 217-231.
2. Booth H., Hirst W.D., Wade-Martins R. Trends in neunoscienc-es, 2017. V. 40. P. 358-370.
3. Novosadova E.V., Nenasheva V.V. et al. Journal of Molecular Neuroscience, 2020. V. 70. P. 514-521.
ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА NES В МЕЗЕНХИМНЫХ КЛЕТКАХ-ПРЕДШЕСТВЕННИЦАХ ИЗ КОСТНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА
И.Н. Шипунова1, А.И. Дорофеева1, Т.Ф. Савватеева2, Л.А. Кузьмина1, Е.Н. Паровичникова1
1 ФГБУ НМИЦ гематологии Минздрава России, Москва, Россия
2 ГБОУ Московская школа на Юго-Западе № 1543, Москва, Россия
e-mail: iranifontova@yandex.ru
Ключевые слова: мезенхимные стромальные клетки, коло-ниеобразующие единицы фибробластов, экспрессия генов, нестин.
Кроветворные микроокружение костного мозга (КМ) — это некроветворные клетки, необходимые для успешного функционирования стволовых клеток крови в течение всей жизни организма. Большую часть кроветворного микроокружения составляют стро-мальные клетки — потомки мезенхимной стволовой клетки (МСК). Иерархия стромальных предшественников охарактеризована скудно, in vivo выделяют мультипотентные мезенхимные стромальные клетки
(ММСК) и колониеобразующие единицы фибробла-стов (КОЕф). МСК не имеют уникального сочетания поверхностных антигенов, что затрудняет их выделение в виде чистой популяции. Показано, что экспрессия нестина, изначально выявленная в нейральных предшественниках, характерна и для МСК. Часто экспрессия гена нестина (NES) используется в качестве маркера этих стромальных предшественников. Целью работы было оценить уровень экспрессии гена NES в ММСК и их потомках — КОЕф, а также выяснить, как изменяется этот показатель при переходе от олигопо-тентных клеток-предшественниц, способных к осте-огенной и адипогенной дифференцировкам, к моно-потентным клеткам-предшественницам, способным осуществлять дифференцировку только в одну из указанных линий.
Из КМ 19 доноров (11 мужчин, 8 женщин, 29,5 ± 2,7 лет) получали ММСК и КОЕф по стандартным методикам. Из ММСК и КОЕф выделяли РНК. Из тех же образцов КМ были получены индивидуальные клоны КОЕф. Для этого по 15 ООО клеток КМ культивировали в лунках 96-луночной платы. Клетки из лунок, где был выявлен рост одного клона, по достижении конфлуентности пересаживали в ячейки 6-луночной платы. Затем, конфлуентную ячейку рассаживали на 3 и через 2-3 дня в 2 ячейки добавляли стандартные смеси индукторов костной и жировой дифферен-цировок. В 1 ячейке контрольные клетки культивировали в стандартной среде. Через 14 дней из клеток выделяли РНК. Ответ на индукторы дифференциров-ки определяли по изменению относительного уровня экспрессии (ОУЭ) маркерных генов (ALPL и PTHR для остео- и FABP4 и PPARG для адипо- дифференцировок). ОУЭ маркерных генов и гена NES анализировали при помощи ПЦР в реальном времени. Было проанализировано 299 индивидуальных клонов КОЕф.
Оказалось, что средний ОУЭ NES достоверно не отличается в ММСК (0,41 ± 0,13) и в суммарной популяции КОЕф (0,24 ± 0,05). В индивидуальных клонах КОЕф ОУЭ был недостоверно выше, чем в суммарной популяции (0,31 ± 0,04). При анализе КОЕф, различающихся по дифференцировочному потенциалу, наивысший ОУЭ гена NES выявлен в группе монопотентных остеогенных предшественников, тогда как в олигопо-тентных предшественниках его экспрессия была статистически достоверно ниже.
Итак, экспрессия гена NES в мезенхимных стромальных предшественниках из костного мозга не является специфичной для МСК и не может быть использована в качестве уникального маркера этого типа клеток. Работа поддержана грантом Российского Научного Фонда (проект № 22-15-00018).
ПЛАЦЕНТАРНЫЕ МАКРОФАГИ И ТУЧНЫЕ КЛЕТКИ В УСЛОВИЯХ ЭНДОГЕННОГО ДИСБАЛАНСА БИОГЕННЫХ АМИНОВ ПРИ ПРЕЭКЛАМПСИИ
А.И. Шорников1, Л.М. Меркулова2
1 ФГБОУ ВО Марийский государственный университет, Йошкар-Ола, Россия
2 ФГБОУ ВО ЧГУ им. И.Н. Ульянова, Чебоксары, Россия
e-mail: drsorn@mail.ru
Ключевые слова: беременность, биогенные амины, плацента, преэклампсия, макрофаги, тучные клетки.
Гены & Клетки XVII, №3, 2G22
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
263
Многие причины осложнений беременности основаны на факторах иммунобиологического взаимодействия на границе матка — плодное яйцо (плацента). Расшифровка механизмов регуляции этих взаимоотношений помогла бы решить проблемы в регенерационной медицине, в трансплантологии и в поиске методов лечения преэклампсии.
Иммуногистохимичскими методами изучены особенности локализации в плаценте биогенных аминов (кате-холамины, гистамин и серотонин), послойная топография макрофагов (00-68) и тучных клеток (триптаза) при преэклампсии (ПЭ).
Исследованы 24 плаценты от родильниц, перенесших ПЭ. Контролем служили 8 плацент от женщин с физиологическим течением беременности и родов. Кусочки, вырезанные из материнского, среднего и плодного слоев плаценты, обработаны общепринятыми гистологическими и иммуногистохимическими методами для выявления вышеназванных веществ и клеточных структур.
Установлено, что гистамин, серотонин и катехоламины выявляются диффузно в структурах плаценты и более отчетливо в макрофагах (гранулярных люминесцирующих клетках). При ПЭ содержание биогенных аминов в плаценте превышает нормальные показатели в 1,6 раза. Одновременно выявляется дисбаланс содержания биогенных аминов между клеточными структурами и стромой.
При легкой ПЭ экспрессия 0068 в материнской части плаценты достоверно не отличается от нормы, но в плодной части и в среднем слое достоверно повышается, превышая нормальные показатели примерно в 1,5 раза. При тяжелом течении ПЭ экспрессия 0068 повышается 3,5 раза во всех слоях плаценты.
При физиологическом течении беременности выявляются единичные тучные клетки в строме и в межворсинчатом пространстве. Триптаза в норме выявлялась в синци-тиотрофобласте, эндотелии капилляров, в строме ворсин хориона. При этом в межворсинчатом пространстве обнаруживались единичные триптазаположительные клетки.
При легком течении ПЭ экспрессия триптазы в структурах плаценты повышается и превышает норму более чем в 2 раза, а при тяжелом течении — экспрессия триптазы резко снижается и достоверно не отличается от нормальных показателей, но сопровождается появлением триптазы в межворсинчатом пространстве, что может свидетельствовать о срыве адаптационных возможностей матери и плода.
Выявленные особенности иммуногистохимических показателей в плаценте могут дать дополнительную информацию для расшифровки механизмов патогенеза преэклампсии.
ЧАСТИЧНОЕ РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ КАК СПОСОБ РЕВИТАЛИЗАЦИИ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
М.А. Шорохова1, Ю.С. Иванова1, Л.Л. Алексеенко1, И.В. Кожухарова1, Н.А. Пуговкина1, А.П. Домнина1, И.К. Кунеев1, 2, Т.М. Гринчук1, О.Г. Люблинская1
1 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого (СПбПУ), Санкт-Петербург, Россия
e-mail: o.lyublinskaya@mail.ru
Ключевые слова: МСК, мезенхимные стволовые/стро-мальные клетки, клеточное старение, ревитализация, частичное репрограммирование.
Поиск путей предотвращения старения культивируемых мезенхимных стволовых/стромальных клеток человека (МСК) имеет как фундаментальное, так и прикладное значение, поскольку старение культур МСК препятствует внедрению в медицинскую практику клеточных продуктов, создаваемых на основе этих клеток. В данный момент мировым научным сообществом тестируется несколько стратегий замедления старения как на уровне клеток, так и на уровне организма в целом: модулирование сигнальных путей, ассоциированных с индукцией старения, элиминация стареющих клеток из популяции или из тканей организма с использованием сенолитиков, низкокалорийная диета и др. Однако, изучение процесса частичного репрограммирования клеток и возможностей с помощью этой технологии омолодить (ревитали-зировать) клетки и/или организм только начинается [1]. Примечательно, что наибольший успех в этой области был достигнут именно на моделях in vivo, тогда как клеточных работ в системе in vitro довольно мало, а полученные результаты иногда противоречивы. Настоящая работа направлена на изучение возможности ревитализировать постаревшие МСК эндометрия человека (эМСК) с применением техники частичного репрограммирования.
В своем исследовании мы оценили изменения,кото-рые произошли после индукции репрограммирования в культурах эМСК, постаревших в результате длительного культивирования (35-40 пассажей). Проведенные тесты показали, что спустя 3-5 дней после начала ре-программирования с помощью Сендай вирусов, кодирующих факторы Яманаки (OSKM), эМСК сохраняли свой фенотип и характеризовались экспрессией поверхностных маркеров, типичных для МСК. В то же время, ре-программируемые клетки утратили черты постаревших: они изменили морфологию, утратили распластанность и уменьшились в размере; уменьшился сигнал автофлуоресценции, связанный c накоплением в постаревших клетках липофусцина; в ядрах исчезли разрывы ДНК; сократилось количество клеток, экспрессирующих галактозидазу, ассоциированную со старением; активизировались системы тиол-дисульфидного обмена, контролирующие клеточный редокс-метаболизм. В реви-тализированных клетках изменилась активность маркерных генов клеточного старения: снизилась экспрессия p21, ингибитора циклин-зависимых киназ, опосредующего блокирование пролиферации постаревших клеток; увеличилась экспрессия генов-участников ответа на повреждение ДНК (Chk1 и ATM), чья сниженная активность обеспечивает толерантность стареющих клеток к перси-стирующим разрывам ДНК; повысилась экспрессия генов, отвечающих за активизацию редокс-метаболизма клеток (TXN и PRDX1).
Таким образом, проведенные нами тесты выявили признаки ревитализации эМСК, наблюдаемые через 3-5 дней после индукции репрограммирования клеток. Работа поддержана грантом РНФ № 22-24-20122.
Литература:
1. Ocampo A., Reddy P., Martinez-Redondo P., et al. Cell 2016; V.
167. P.1719.
Гены & Клетки XVII, №3, 2022
