CC BY
9
РАЗЛИЧИЯ В ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В МЕЗЕНХИМНЫХ КЛЕТКАХ-ПРЕДШЕСТВЕННИЦАХ ИЗ КОСТНОГО МОЗГА БОЛЬНЫХ АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИЕЙ В ДЕБЮТЕ ПРИ РАЗНЫХ ФОРМАХ ЗАБОЛЕВАНИЯ
А.И. Дорофеева, И.Н. Шипунова, А.В. Лучкин, З.Т. Фидарова, Е.А. Михайлова
ФГБУ НМИЦ гематологии Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: dorofeyeva.alyona@gmail.com
Ключевые слова: мезенхимные стромальные клетки, коло-ниеобразующие единицы фибробластов, экспрессия генов, апластическая анемия.
Апластическая анемия (АА) — редкое заболевание системы крови, характеризующееся панцитопенией и аплазией костного мозга (КМ). Выделяют три формы АА: нетяжелая (НАА), тяжелая (ТАА) и сверхтяжелая. Хотя патогенез заболевания недостаточно изучен, считается, что в основе его лежит гибель стволовых кроветворных клеток (СКК) в результате аутоиммунной атаки цитотоксических Т-лимфоцитов. Другой причиной аплазии КМ при АА может быть нарушение функционирования стромального микроокружения. Для изучения свойств стромы КМ in vitro выделяют предшественники двух типов: мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) и колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕф). Известно, что в ММСК из КМ больных АА изменен относительный уровень экспрессии (ОУЭ) ряда генов, однако КОЕф больных охарактеризованы недостаточно. Данные о свойствах стромальных предшественников при разных формах АА в литературе также отсутствуют. Цель работы — проанализировать ОУЭ генов, ассоциированных с пролиферацией, диффе-ренцировкой, иммунорегуляцией и поддержанием СКК, в ММСК и КОЕф из КМ больных АА в дебюте заболевания и выявить отличия, характерные для НАА и ТАА, а также общие для обеих форм изменения, по сравнению со здоровыми донорами.
Из КМ 17 больных НАА (8 мужчин, 9 женщин, 33,8 ± 2,2 лет), 10 больных ТАА (7 мужчин, 3 женщины, 30,7 ± 4,6 лет) и 22 здоровых доноров (11 мужчин, 11 женщин, 29,9 ± 2,5 лет) получали ММСК и КОЕф по стандартным методикам. Из ММСК и КОЕф выделяли РНК и строили кДНК, которую анализировали методом ПЦР в реальном времени. ОУЭ генов рассчитывали методом AACt, использовав для нормализации гены GAPDH и BACT.
В ММСК всех больных АА достоверно повышен ОУЭ фактора комплемента H (CFH), промежуточного фила-мента нестина (NES), рецепторов к факторам роста фибробластов (FGFR1, FGFR2) и фактору роста, выделенному из тромбоцитов (PDGFRA), а также достоверно снижен ОУЭ ангиопоэтина-1 (ANGPT1) по сравнению с ММСК доноров. В ММСК больных НАА также достоверно повышен ОУЭ PDGFRA по сравнению с ММСК ТАА и доноров.
В КОЕф всех больных АА выявлено достоверное повышение ОУЭ рецепторов к факторам роста (PDGFRA, PDGFRB), а также NES по сравнению с донорами. Среди факторов, осуществляющих регуляцию СКК, ОУЭ ANGPT1 и фактора стволовых клеток (KITLG) достоверно повышен, а ОУЭ остеопонтина (SPP1) — снижен.
В КОЕф больных ТАА показано достоверное снижение ОУЭ иммунорегуляторных молекул (IL10, IL1B, CD274) и повышение ОУЭ FGFR1 по сравнению с КОЕф больных НАА и КОЕф доноров.
Таким образом, при АА ММСК и КОЕф по-разному изменены с точки зрения экспрессии генов. При разных формах заболевания наиболее выраженные изменения происходят в различных типах стромальных предшественников: при НАА — в ММСК, при ТАА — в КОЕф, что может быть связано с различиями в патогенезе НАА и ТАА.
МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ИЗ КОСТНОГО МОЗГА МИНИ ПИГОВ, ИМПЛАНТИРОВАННЫЕ ПОД КАПСУЛУ ПОЧКИ, ОБРАЗУЮТ ОЧАГ, СОДЕРЖАЩИЙ КОСТЬ, СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ КОСТНОГО МОЗГА И МЫШЦЫ
Н.И. Дризе1, И.Н. Шипунова1, Н.В. Сац1,
А.И. Дорофеева1, Н.М. Капранов1,
А.В. Садовская1, 2, Ю.В. Ткачук3, А.В. Бондаренко3,
М.А. Котский3, И.Б. Капланская4,
Т.В. Васильева2, Н.А. Петинати1
1 ФГБУ НМИЦ гематологии Минздрава России, Москва, Россия
2 Биологический факультет, МГУ
им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
3 НИИ Медицины Труда им. Н.Ф. Измерова, Москва, Россия
4 МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ НМИЦ радиологии, Москва, Россия
e-mail: ndrize@yandex.ru
Ключевые слова: Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки; имплантация, пролиферация, дифференци-ровка, экспрессия генов
Последние достижения в области исследования стволовых клеток дали стимул для разработки методов регенеративной медицины на их основе, способствующих восстановлению или замене поврежденных тканей и органов. Сравнительные исследования продемонстрировали, что мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (МСК) из различных источников, включая кости, костный мозг, кожу или жировую ткань человека и свиньи имеют сопоставимые характеристики. МСК хорошо изучены in vitro, тогда как их судьба после имплантации не в составе специфических носителей in vivo практически не изучена.
В работе изучали свойства МСК из костного мозга мини пигов (КМ-МСК) до и после аутологичной имплантации под капсулу почки. КМ-МСК от четырех мини пигов культивировали, охарактеризовали по поверхностным маркерам и способности к адипогенной и остеогенной дифференцировке. По изученным параметрам КМ-МСК мини пигов не отличались от КМ-МСК человека. Часть клеток от каждого животного трансдуцировали лентиви-русным вектором, содержащим ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). Через 2,5 мес после имплантации КМ-МСК сформировались эктопические очаги, содержащие кости, очаги кроветворения, стромальные клетки костного мозга и мышечные клетки. Все очаги содержали клетки, несущие ген GFP. Это подтверждает их происхождение от имплантированных КМ-МСК. Небольшие кусочки каждого имплантата помещали в 6-ячеечные платы с полной питательной средой. Клетки, выползшие из этих имплантатов, были культивированы, клонированы по 1 клетке и проанализированы. Эти клетки отвечали большинству критериев МСК (ИМ-МСК). ИМ-МСК продемонстрировали высокий пролиферативный
потенциал, аналогичный КМ-МСК. Способность к диф-ференцировке ИМ-МСК отличалась от КМ-МСК. Клоны ИМ-МСК не реагировали на индукторы адипогенной дифференцировки, 67% из них дифференцировались в сторону остеогенной линии. Остальные клоны не дифференцировались. Часть клонов ИМ-МСК содержала ЭРР. ИМ-МСК экспрессировали гены С-МУС и ЫЕБ значительно выше, чем КМ-МСК, в то время как экспрессия 0СТ4 была ниже. По-видимому, в состав ИМ-МСк входит субпопуляция, обладающая некоторыми свойствами эмбриональных стволовых клеток. Таким образом, КМ-МСК обнаруживали функциональную гетерогенность после имплантации под капсулу почки. Повторный перенос мезенхимных стромальных клеток-предшественников, вероятно, активировал дремлющую субпопуляцию стволовых клеток. Можно заключить, что популяция КМ-МСК состоит из мезенхимных клеток-предшественниц различной степени дифференцировки, в том числе и из стволовых клеток. Эти недавно открытые свойства КМ-МСК мини пигов требуют дальнейшего изучения, поскольку они открывают новые возможности и ограничения манипуляций с ними.
МАТРИКСЫ ИЗ ФИБРОИНА, СШИТОГО
ДЖЕНИПИНОМ, ДЛЯ ТКАНЕВОЙ
ИНЖЕНЕРИИ: ПОЛУЧЕНИЕ, ИЗУЧЕНИЕ
И ОЦЕНКА IN VITRO
М.Г. Дроздова1, В.Н. Бирюкова1, Н.А. Сажнев2,
Н.Р. Кильдеева2, Е.А. Марквичева1
1 ГНЦ ФГБУН Институт биоорганической химии им. Шемякина-Овчинникова РАН, Москва, Россия
2 ФГБОУН ВО Российский государственный университет им. А.Н. Косыгина, Москва, Россия
e-mail: drozdovamg@gmail.com
Ключевые слова: тканевая инженерия, фиброин, дженипин,
фибробласты L929, мезенхимальные стволовые клетки.
Фиброин (Фб) — перспективный материал для тканевой инженерии (ТИ), благодаря хорошим механическим свойствам, биосовместимости и биоразлагаемости. Однако матриксы из регенерированного Фб водорастворимы. Использование химической сшивки для предотвращения растворимости Фб может оказаться неэффективным из-за низкого содержания первичных аминогрупп в его структуре. Поскольку растворимость Фб зависит от конформационного состояния: водорастворимые а-спирали и нерастворимые ß-складчатые структуры, создание условий для конформационного перехода а ^ ß при образовании гидрогеля из Фб позволяет влиять на его растворимость.
Целью исследования было получение матриксов на основе Фб, сшитого дженипином (Дж), и изучение их структуры, физико-химических свойств, а также оценка биосовместимости in vitro.
Для получения пористых матриксов растворы Фб (20 и 30 масс. %) замораживали при -10°С и лио-филизовали. Полученные матриксы сшивали инкубацией в растворе Дж (10 масс. %) в этаноле в течение 24 часов. С помощью конфокальной лазерной микроскопии (КЛМ) было показано, что матриксы образуют систему с открытыми порами средним размером 149 ± 7 мкм и 355 ± 14 мкм для матриксов Фб-20 (20 масс.%) и Фб-30 (30 масс.%) соответственно. Отсутствие растворимости обеспечивалось как переводом Фб в ß-конформацию, так и химической сшивкой Дж в спиртовой среде.
Цитотоксичность Фб матриксов изучали с помощью экстракт теста с использованием мышиных фибробластов 1_929 в качестве модельных клеток. Жизнеспособность клеток определяли методом МТТ. После инкубации клеток в неразбавленных экстрактах происходило некоторое снижение их жизнеспособности, однако изменений в морфологии не наблюдали. После разбавления экстрактов жизнеспособность клеток повышалась. Распределение и морфологию клеток _929 и имморта-лизованных мезенхимальных стволовых клеток человека (ИТЕРТ-МБС) оценивали с помощью КЛМ через 7 дней культивирования в матриксах. Для этого клетки окрашивали витальным красителем Кальцеин АМ. Клетки сохраняли жизнеспособность, имели характерную веретенообразную морфологию и образовывали плотный клеточный монослой на матриксах Фб. Таким образом, макропористые матриксы Фб являются перспективными для ТИ. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-13-00261).
КЛЕТОЧНАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА, АССОЦИИРОВАННОЙ С МУТАЦИЕЙ В ГЕНЕ GBA
Е.С. Дроздова1, 2, Е.В. Григорьева2,
С.В. Павлова2, С.П. Медведев2, Д.А. Сорогина1, 2,
А.Е. Копытова3, Г.В. Байдакова4,
Е.Ю. Захарова4, С.Н. Пчелина3, С.М. Закаян2
1 Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия
2 ФГБНУ ФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия
3 ФГБУ Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра Курчатовский институт, Гатчина, Россия
4 ФГБНУ Медико-генетический научный центр, Москва, Россия
e-mail: e.drozdova2@g.nsu.ru
Ключевые слова: инуцированные плюрипотентные стволовые клетки, болезнь Паркинсона, дофаминергические нейроны, глюкоцереброзидаза, мутация p.N370S, амброксол.
Вторым по распространенности нейродегенератив-ным заболеванием является болезнь Паркинсона (БП) — хроническая патология, поражающая дофаминергические (ДА) нейроны черной субстанции. Одна из причин развития БП — мутации в гене GBA, которые приводят к снижению уровня мРНК GBA и белка глюкоцеребро-зидазы (GCase). Снижение активности GCase приводит к накоплению липидного продукта метаболизма, способствующего формированию нейротоксичных агрегатов белка а-синуклеина.
Для изучения механизмов мультифакторных заболеваний и поиска способов их лечения необходимо создавать адекватные модели, что является достаточно нетривиальной задачей, особенно в случае нейро-дегенеративных патологий: работа с образцами клеток мозга пациентов лимитирована постмортальными материалами, а использование животных моделей для тестирования новых лекарственных препаратов ограничивается из-за различий в метаболизме ксенобиотиков. Решением данных проблем стали индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), способные
