CC BY
7
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
261
ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МАКРОФАГОВ ЧЕЛОВЕКА С ИНДУЦИБЕЛЬНОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНА TNFAIP3
О.Н. Шевелева1, Е.А. Протасова1, Т.А. Ненашева1, Н.Н. Буторина1, С.П. Медведев2, Е.В. Григорьева2, В.И. Мельникова1, И.В. Лядова1
1 ФГБНУ Институт биологии развития им Н.К. Кольцова РАН, Москва, россия
2 ФГБНУ ФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, россия
e-mail: on_sheveleva@mail.ru
Ключевые слова: макрофаги, клетки с индуцированной плюрипотентностью, геномное редактирование, TNFAIP3.
Макрофаги — важнейшие клетки врожденного иммунитета, участвующие в формировании воспалительного и иммунного ответа, репарации ткани и поддержании гомеостаза. Они присутствуют во всех тканях организма и представляют собой привлекательную мишень для терапии различных заболеваний. Одной из важных задач клеточной терапии в настоящее время является получение генетически модифицированных макрофагов. Основная сложность в модификации макрофагов заключается в их невосприимчивости к генетическим манипуляциям и невозможности получения их из моноцитов периферической крови в достаточном количестве. По этой причине перспективным является подход, при котором модифицированные макрофаги (мод-МФ) получают in vitro из модифицированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (мод-иПСК). Целью настоящего исследования было получение мод-МФ из иПСК с управляемой экспрессией гена TNFAIP3, кодирующего белок А20, который принимает участие в ограничении воспалительного ответа и снижении клеточной гибели.
На первом этапе были получены мод-иПСК суправля-емой доксициклином экспрессией TNFAIP3. За основу была взята линия иПСК, полученная из моноцитов крови в ИЦиГ СО РАН. Генетическая модификация осуществлялась электропорацией с применением CRISPR-Cas9. Полученные мод-иПСК.А20 были охарактеризованы по основным критериям плюрипотентных клеток: экспрессии щелочной фосфатазы и основных маркеров плюрипотентных клеток (OCT4, SOX2, NANOG) и способности к дифференцировке в производные трех зародышевых листков.
На втором этапе был отработан протокол получения из мод-иПСК.А20 мод-МФ.А20. Мод-МФ.А20 имели характерный фенотип, сходный с немодифицированными макрофагами (экспрессировали маркеры CD14, CD45, CD163, HLA-DR и др.), обладали фагоцитарной активностью и увеличивали экспрессию TNFAIP3 в 2-7 раз в присутствии доксициклина, что было подтверждено методом ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттингом и транскриптомным анализом.
Таким образом, в данной работе предложен эффективный и воспроизводимый протокол получения мод-МФ с управляемой экспрессией TNFAIP3, который использован нами для оценки противовоспалительной активности мод-МФ.А20, полезен для дальнейшего анализа роли TNFAIP3 в регуляции функции макрофагов, а также создает основу для получения других генетически модифицированных МФ человека. Работа осуществлялась при поддержке Минобрнауки РФ, проект
№ 075-15-2020-773. Работа проводилась с использованием оборудования ЦКП ИБР им. Н.К. Кольцова РАН.
РОЛЬ КОНСТИТУТИВНОГО ГЕТЕРОХРОМАТИНА В ИНАКТИВАЦИИ Х-ХРОМОСОМЫ
А.И. Шевченко, С.М. Закиян
ФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия
e-mail: epigene@bionet.nsc.ru
Ключевые слова: инактивация Х-хромосомы, конститутивный гетерохроматин, длинные некодирующие РНК.
При исследовании трофобластных стволовых клеток полёвки и эмбриональных стволовых клеток человека обнаружено, что в процессе инактивации в ответ на экспрессию РНК гена Xist/XIST модификации из районов конститутивного гетерохроматина распространяются по инактивируемой Х-хромосоме, формируя на ней домены, обогащенные триметилированым гистоном H3K9, белками HPI-гамма и KAP1, а также гистонметилтрас-феразой SETDB1.
Распространение меток конститутивного гетерохро-матина может сопровождаться утратой модификаций активного хроматина, инактивацией транскрпипции Х-сцепленных генов и подержанием их транскрипционного сайленсинга. Мы предполагаем, что индуцируемое некодирующей РНК распространение репрессивных меток из районов конститутивного гетерохроматина может являться эволюционно исходным механизмом процесса инактивации у млекопитающих. Работа поддержана Бюджетным проектом ИЦиГ СО РАН FWNR-2022-0015.
ПОЛУЧЕНИЕ ГЛИАЛЬНОЙ ПОПУЛЯЦИИ КЛЕТОК ИЗ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК ПАЦИЕНТОВ С МОНОГЕННЫМИ ФОРМАМИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА
Д.М. Шимченко, Т.П. Герасимова,
И.А. Гривенников, С.А. Антонов, Л.В. Новосадова,
Е.Л. Арсеньева, В.З. Тарантул, Е.В. Новосадова
Институт молекулярной генетики НИЦ «Курчатовский институт», Москва, Россия
e-mail: shimchenko1211@mail.ru
Ключевые слова: болезнь Паркинсона, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, дифференцировка, гли-альные клетки.
Болезнь Паркинсона (БП) — одно из наиболее распространенных неизлечимых нейродегенератив-ных заболеваний. Основными характерными чертами патогенеза заболевания являются прогрессирующая гибель дофаминергических нейронов черной субстанции [1]. Важную роль в функционировании центральной нервной системы (ЦНС) играет нейро-глия. Данная популяция клеток принимает участие в обмене нейротрансмиттеров, формировании и созревании синапсов, регуляции рН, водного и ионного гомеостаза и формировании гематоэнцефалическо-го барьера. При патологических состояниях функция глии нарушается, астроциты активируют экспрессию воспалительных генов, участвуя в поддержании
Гены & Клетки XVII, №3, 2022
2B2
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
нейровоспаления [2]. Для получения нейронов и гли-альных клеток в настоящее время используют индуцированные плюрипотентные клетки (ИПСК) человека. Уникальность этого подхода состоит в том, что клеточный материал, полученный от пациентов с генетическими нарушениями, для получения ИПСК будет транслировать эти нарушения во все дифференцированные производные. Таким образом, можно изучать влияние определенной генетической мутации в разных клеточных популяциях, дифференцированных из одной и той же уникальной линии ИПСК.
Ранее нами был показан ряд изменений в профиле экспрессии большого количества генов в дофаминерги-ческих нейронах дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) пациентов с разными мутациями, приводящими к БП [3].
В настоящей работе были получены глиальные культуры, дифференцированные из ИПСК пациентов с мутациями в генах GBA (глюкоцереброзидаза), PARK2 (паркин) и LRRK2 (дардарин), приводящих к БП, и здоровых доноров. Полученные культуры клеток были охарактеризованы с помощью иммуноцитохимического анализа и ПЦР в реальном времени. Была обнаружена дифференциальная экспрессия ряда генов у здоровых доноров и у пациентов с БП. Показано, что в ответ на воспалительные стимулы глиальные клетки меняют экспрессию генов и секреторный профиль, тем самым проявляя свойства иммунокомпетентных клеток.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках соглашения № 075-15-2021-1357.
Литература:
1. Cookson M.R., Handy J., Lewis P.A. International journal of clinical and experimental pathology, 2008.V. 1. P. 217-231.
2. Booth H., Hirst W.D., Wade-Martins R. Trends in neunoscienc-es, 2017. V. 40. P. 358-370.
3. Novosadova E.V., Nenasheva V.V. et al. Journal of Molecular Neuroscience, 2020. V. 70. P. 514-521.
ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА NES В МЕЗЕНХИМНЫХ КЛЕТКАХ-ПРЕДШЕСТВЕННИЦАХ ИЗ КОСТНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА
И.Н. Шипунова1, А.И. Дорофеева1, Т.Ф. Савватеева2, Л.А. Кузьмина1, Е.Н. Паровичникова1
1 ФГБУ НМИЦ гематологии Минздрава России, Москва, Россия
2 ГБОУ Московская школа на Юго-Западе № 1543, Москва, Россия
e-mail: iranifontova@yandex.ru
Ключевые слова: мезенхимные стромальные клетки, коло-ниеобразующие единицы фибробластов, экспрессия генов, нестин.
Кроветворные микроокружение костного мозга (КМ) — это некроветворные клетки, необходимые для успешного функционирования стволовых клеток крови в течение всей жизни организма. Большую часть кроветворного микроокружения составляют стро-мальные клетки — потомки мезенхимной стволовой клетки (МСК). Иерархия стромальных предшественников охарактеризована скудно, in vivo выделяют мультипотентные мезенхимные стромальные клетки
(ММСК) и колониеобразующие единицы фибробла-стов (КОЕф). МСК не имеют уникального сочетания поверхностных антигенов, что затрудняет их выделение в виде чистой популяции. Показано, что экспрессия нестина, изначально выявленная в нейральных предшественниках, характерна и для МСК. Часто экспрессия гена нестина (NES) используется в качестве маркера этих стромальных предшественников. Целью работы было оценить уровень экспрессии гена NES в ММСК и их потомках — КОЕф, а также выяснить, как изменяется этот показатель при переходе от олигопо-тентных клеток-предшественниц, способных к осте-огенной и адипогенной дифференцировкам, к моно-потентным клеткам-предшественницам, способным осуществлять дифференцировку только в одну из указанных линий.
Из КМ 19 доноров (11 мужчин, 8 женщин, 29,5 ± 2,7 лет) получали ММСК и КОЕф по стандартным методикам. Из ММСК и КОЕф выделяли РНК. Из тех же образцов КМ были получены индивидуальные клоны КОЕф. Для этого по 15 ООО клеток КМ культивировали в лунках 96-луночной платы. Клетки из лунок, где был выявлен рост одного клона, по достижении конфлуентности пересаживали в ячейки 6-луночной платы. Затем, конфлуентную ячейку рассаживали на 3 и через 2-3 дня в 2 ячейки добавляли стандартные смеси индукторов костной и жировой дифферен-цировок. В 1 ячейке контрольные клетки культивировали в стандартной среде. Через 14 дней из клеток выделяли РНК. Ответ на индукторы дифференциров-ки определяли по изменению относительного уровня экспрессии (ОУЭ) маркерных генов (ALPL и PTHR для остео- и FABP4 и PPARG для адипо- дифференцировок). ОУЭ маркерных генов и гена NES анализировали при помощи ПЦР в реальном времени. Было проанализировано 299 индивидуальных клонов КОЕф.
Оказалось, что средний ОУЭ NES достоверно не отличается в ММСК (0,41 ± 0,13) и в суммарной популяции КОЕф (0,24 ± 0,05). В индивидуальных клонах КОЕф ОУЭ был недостоверно выше, чем в суммарной популяции (0,31 ± 0,04). При анализе КОЕф, различающихся по дифференцировочному потенциалу, наивысший ОУЭ гена NES выявлен в группе монопотентных остеогенных предшественников, тогда как в олигопо-тентных предшественниках его экспрессия была статистически достоверно ниже.
Итак, экспрессия гена NES в мезенхимных стромальных предшественниках из костного мозга не является специфичной для МСК и не может быть использована в качестве уникального маркера этого типа клеток. Работа поддержана грантом Российского Научного Фонда (проект № 22-15-00018).
ПЛАЦЕНТАРНЫЕ МАКРОФАГИ И ТУЧНЫЕ КЛЕТКИ В УСЛОВИЯХ ЭНДОГЕННОГО ДИСБАЛАНСА БИОГЕННЫХ АМИНОВ ПРИ ПРЕЭКЛАМПСИИ
А.И. Шорников1, Л.М. Меркулова2
1 ФГБОУ ВО Марийский государственный университет, Йошкар-Ола, Россия
2 ФГБОУ ВО ЧГУ им. И.Н. Ульянова, Чебоксары, Россия
e-mail: drsorn@mail.ru
Ключевые слова: беременность, биогенные амины, плацента, преэклампсия, макрофаги, тучные клетки.
Гены & Клетки XVII, №3, 2G22
