CC BY
43
ФИЗИКО- ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 606:582.232
DOI 10.21685/2307-9150-2018-4-1
Д. И. Петрухина
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РАЗБАВЛЕННОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ РЕКУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЦИАНОБАКТЕРИЙ1
Аннотация.
Актуальность и цели. Представители 8р1ги11па и ЛгЖгаргга включены во многие лабораторные коллекции культур цианобактерий, так как их криокон-сервация обеспечивает долговременное сохранение культур. Цель исследования - изучение возможности культивирования коллекции культур цианобактерий родов 8р1ги11па и ЛгЖгыргга (9 штаммов) на разбавленной питательной среде Заррука после 12-месячной криоконсервации при температуре минус 80 °С.
Материалы и методы. «Отработанную» среду Заррука получали после культивирования на ней цианобактерий 8р1ги11па и ЛгЖгаргга. Основную биомассу цианобактерий 8р1ги11па (ЛгМгыргга) после культивирования подвергали криоконсервации. Отделенная от нее «отработанная» среда Заррука была смешана (1:1) с новой (свежей) средой Заррука для повторного использования после криоконсервации.
Результаты. Представлены данные о влиянии разбавленной питательной среды Заррука на скорость роста цианобактерий 8р1ги11па и ЛгЖгаргга после криоконсервации. Рост этих цианобактерий после оттаивания был удовлетворительным и имел ту же величину, что и рост этих цианобактерий на новой (свежей) питательной среде Заррука.
Выводы. Результаты представленной работы показывают, что повторное использование питательной среды Заррука может быть применимо для рекультивации представителей цианобактерий родов 8р1ги11па и ЛгМгаргга после долговременной криоконсервации.
Ключевые слова: ЛгМгаргга Бр., 8р1ги11па Бр., культуральная среда, ре-циклинг питательной среды.
1 Работа выполнена при поддержке стипендии Президента Российской Федерации для обучения за рубежом аспирантов российских вузов, стипендии MULTIC от международной стипендиальной программы ERASMUS MUNDUS Action 2 и стипендии Дрезденского технического университета для развития научной карьеры у женщин (Scholarship Program for the Promotion of Early-Career Female Scientists of TU Dresden).
© 2018 Петрухина Д. И. Данная статья доступна по условиям всемирной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая дает разрешение на неограниченное использование, копирование на любые носители при условии указания авторства, источника и ссылки на лицензию Creative Commons, а также изменений, если таковые имеют место.
D. I. Petrukhina
PROSPECTS OF USING DILUTED MEDIUM FOR CYANOBACTERIA RECULTIVATION
Abstract.
Background. Spirulina and Arthrospira species include a wide variety of laboratory cyanobacteria culture collections and their cryo-storage does provide long-term preservation. The aim of the work is to study a possibility of cultivation in diluted Zarrouk medium of the Spirulina and Arthrospira collection (9 strains) after 12 months of cryopreservation at a temperature of minus 80 °C.
Materials and methods. The effluent of Zarrouk medium was obtained from cyanobacteria's Spirulina and Arthrospira cultivation. Biomasses of Spirulina and Arthrospira were subject to cryopreservation. The effluent of Zarrouk medium was mixed (1:1) with new Zarrouk medium to reuse after cryo-storage.
Results. The article presents data concerning the influence of diluted Zarrouk medium on growth rate of Spirulina and Arthrospira after cryo-storage. The growth of these cyanobacteria after thawing was satisfactory and featured the same rate as the growth in the new Zarrouk medium.
Conclusions. The results of this work shows that reuse of Zarrouk medium may be appropriate to recultivation of the cyanobacteria Spirulina and Arthrospira collection after long-term cryo-storage.
Keywords: Arthrospira sp., Spirulina sp., culture medium, reuse of Zarrouk medium.
Введение
Цианобактерии родов Spirulina и Arthrospira благодаря относительной простоте и безопасности культивирования являются распространенными объектами научных исследований и одновременно выращиваются в промышленных масштабах во многих странах мира как объекты фотобиотехнологии [1]. Биомасса видов Spirulina и Arthrospira является важным биотехнологическим продуктом, характеризуется уникальными полезными свойствами и содержит такие ценные соединения, как легкоусвояемые протеины, липиды, полисахариды, фенольные соединения, и поэтому находит все большее применение в биотехнологических производствах. Например, в производстве пищевого белка, разнообразных лечебно-профилактических препаратов, высококачественных кормовых продуктов, пигментов и пищевых красителей, а также других востребованных продуктов для медицины, косметологии, животноводства и аквакультуры [2, 3].
Одним из первых подробное исследование условий роста цианобактерии Arthrospira sp. провел Клод Заррук (Claude Zarrouk) в своей диссертационной работе [4]. Питательная среда, разработанная Зарруком, стала стандартной средой для выращивания цианобактерий родов Arthrospira и Spiru-lina [1-3].
Представляется интересным возможность повторного использования питательной среды Заррука после выращивания на ней культур Arthrospira sp. и Spirulina sp. Применение этой многокомпонентной среды для культивирования цианобактерий после криоконсервации значительно повышает экономическую эффективность биотехнологического процесса.
Экспериментам по выращиванию водорослей в «отработанных» питательных средах в последнее время уделяется недостаточное внимание [5]. Результаты таких экспериментов представлены лишь в нескольких работах Morocho-Jâcome и соавт. [6, 7]. Авторами показано, что потребление циано-бактериями основных питательных веществ из жидкой питательной среды Заррука обычно не полное, т.е. после выращивания и отделения биомассы этих цианобактерий культуральная среда содержит достаточное количество нитратов, фосфатов и карбонатов в остаточных концентрациях [6, 7]. Эта особенность «отработанной» среды Заррука позволяет ограничится лишь частичным восполнением питательных веществ путем добавления свежей порции среды для повторного ее использования, например для рекультивирования Arthrospira sp. и Spirulina sp. после криоконсервирования.
Целью настоящей работы было определение потенциальной возможности использования разбавленной питательной среды Заррука для рекультивирования цианобактерий Spirulina (S. subsalsa, S. laxissima) и Arthrospira (A. platensis, A. maxima) после 12-месячной криоконсервации при температуре минус 80 °С.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы рода Spirulina: S. subsalsa (PCC 9445) и S. laxissima (SAG 256.80), а также рода Arthrospira: A. maxima (SAG 84.79, SAG 49.88); A. platensis (SAG 257.80, SAG 21.99, PCC 9223, PCC 9108, PCC 7345). Исследуемые штаммы были получены из коллекции культур университета Пастера, Франция (PCC) и коллекции водорослей университета Гёттенгена, Германия (SAG).
Выращивание исходных культур и низкотемпературное консервирование осуществляли согласно методике, описанной нами ранее [8]. Разбавленная среда была получена путем добавления к стандартной питательной среде Заррука равного объема культуральной среды (1:1), оставшейся после выращивания на ней биомассы цианобактерий, которую использовали для крио-консервирования.
Очистку среды Заррука после культивирования на ней цианобактерий Spirulina и Arthrospira не проводили, поскольку все используемые варианты очистки отработанной среды Заррука снижали в ней содержание нитратов, карбонатов и фосфатов в остаточных концентрациях.
Исследуемые штаммы цианобактерий криоконсервировали с раствором диметилсульфоксида (10 % ДМСО) в течение 12 месяцев при минус 80 °С. После оттаивания штаммы выращивали на стандартной и разбавленной среде Заррука и проводили сравнительную оценку скорости роста штаммов Arthro-spira и Spirulina в зависимости от варианта используемой для роста питательной среды Заррука.
Для облегчения определения прироста биомассы у исследуемых штаммов Spirulina и Arthrospira после оттаивания были созданы калибровочные кривые зависимости количества сухой биомассы от оптической плотности ее суспензии на длине волны в 750 нм для каждого из штаммов.
Для штаммов Arthrospira platensis (PCC 9108, SAG 21.99, SAG 257.80) ранее нами были получены уравнения регрессии и коэффициент детерминации [9]. Так, функциональная зависимость концентрации биомассы в раство-
ре и оптической плотности при 750 нм для штамма PCC 9108 имеет значение 0,83 г/л (y = 0,8271х, R2 = 0,9637), для штамма SAG 257.80 - 0,91 г/л (y = 0,9098х, R2 = 0,9887) и для штамма SAG 21.99 - 0,88 г/л (y = 0,8778х, R2 = 0,9816).
Результаты и обсуждение
На основе результатов экспериментов установлено, что оптическая плотность при 750 нм суспензии исследуемых цианобактерий и сухой вес их биомассы связаны линейной зависимостью: 0П750 = k х СВ. Коэффициент пропорциональности k для оценки биомассы по 0П750 в обратной зависимости СВ = k х 0П750 был определен для каждого штамма.
Для двух штаммов вида Arthrospira platensis были получены следующие значения: 0,77 г/л для PCC 7345 (y = 0,7729x, R2 = 0,9879), 0,86 г/л для PCC 9223 (y = 0,8662x, R2 = 0,971).
У двух штаммов вида Arthrospira maxima полученные значения были несколько различными: 0,78 г/л для SAG 49.88 (y = 0,7826x, R2 = 0,9314), 0,94 г/л для SAG 84.79 (y = 0,9388x, R2 = 0,9814).
Для Spirulina laxissima штамм SAG 256.80 было получено значение 0,45 г/л для (y = 0,4462x, R2 = 0,9549), что значительно отличает данный штамм как от представителей рода Arthrospira, так и от другого вида рода Spirulina - Spirulina subsalsa. В то же время для штамма РСС 9445 Spirulina subsalsa было получено значение 0,90 г/л (y = 0,9033x, R2 = 0,9611), более близкое к значениям штаммов рода Arthrospira.
Уравнение регрессии и коэффициент детерминации, полученные для исследуемых в нашей работе штаммов цианобактерий, подтверждают видо-специфичность функциональной зависимости концентрации биомассы циа-нобактерий в растворе и оптической плотности и необходимость его определения для каждого конкретного объекта исследования.
Согласно полученным результатам исследования было установлено, что использование разбавленной (1:1) среды Заррука не влияло на жизнеспособность и рост штаммов цианобактерий Spirulina и Arthrospira после крио-консервирования (табл. 1).
Таблица 1
Скорость роста штаммов Spirulina и Arthrospira после криоконсервации на разбавленной среде Заррука (в % от скорости роста цианобактерий на полной питательной среде Заррука, M ± m, n = 18)
Вид Штамм Скорость роста, %
S. subsalsa PCC 9445 90,00 ± 0,18
S. laxissima SAG 256.80 71,00 ± 0,27
A. maxima SAG 84.79 81,00 ± 0,32
SAG 49.88 83,00 ± 0,17
A. platensis SAG 257.80 84,00 ± 0,21
SAG 21.99 75,00 ± 0,08
PCC 9223 78,00 ± 0,07
PCC 9108 94,00 ± 0,07
PCC 7345 97,00 ± 0,17
Так, у исследуемых штаммов родов Spirulina (S. laxissima SAG 256.80, S. subsalsa РСС 9445) и Arthrospira (A. platensis PCC 9108, SAG 257.80, SAG 21.99, РСС 9223 и PCC 7345, A. maxima SAG 49.88 и SAG 84.79) после оттаивания наблюдали рост клеток на разбавленной среде Заррука при минимальной скорости - 71 % (штамм SAG 256.80) по сравнению с экспериментом по выращиванию цианобактерий на стандартной питательной среде Заррука.
Таким образом, полученные данные говорят о возможности применения для рекультивирования цианобактерий после криоконсервации разбавленной среды Заррука. Разбавление среды Заррука не только снижает стоимость питательной среды для выращивания Spirulina sp. и Arthrospira sp., но также уменьшает количество отходов, утилизируемых в окружающую среду после экспериментов за счет включения уже использованной культуральной среды.
Заключение
Результаты нашего исследования показали, что для рекультивации коллекции цианобактерий родов Spirulina и Arthrospira после долговременной криоконсервации возможно повторное использование жидкой питательной среды Заррука после добавления к ней свежей среды в пропорции 1 : 1. Нами после 12 месяцев хранения при минус 80 °С и в присутствии 10 %-го ДМСО успешно были рекультивированы на разбавленной питательной среда Зарру-ка девять штаммов цианобактерий: Arthrospira platensis штаммы PCC 9108, PCC 7345, РСС 9223, SAG 257.80, SAG 21.99, Arthrospira maxima штаммы SAG 49.88 и SAG 84.79, Spirulina laxissima SAG 256.80, Spirulina subsalsa РСС 9445. Ростовые характеристики полученных суспензионных культур цианобактерий были сравнимы с таковыми у контрольных культур, рекультивированных на стандартной питательной среде Заррука. Отметим также значительную экономическую выгоду при достаточно высокой эффективности рекультивирования от использования разбавленной питательной среды Заррука. Данный методический подход снижает стоимость используемой в экспериментах питательной среды (в два раза) для культивирования циано-бактерий после криоконсервации.
Библиографический список
1. Eriksen, N. T. Production of phycocyanin - a pigment with applications in biology, biotechnology, foods and medicine / N. T. Eriksen // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2008. - Vol. 80, iss. 1. - P. 1-14. - DOI 10.1007/s00253-008-1542-y.
2. Vonshak, A. Spirulina platensis (Arthrospira): physiology, cell-biology and biotechnology / A. Vonshak. - London : CRC Press, 2002. - 252 p.
3. Sili, C. Arthrospira (Spirulina) / C. Sili, G. Torzillo, A. Vonshak // Ecology of Cyanobacteria II: Their Diversity in Space and Time / ed. B. Whitton. - 2012. -P. 677-705. - DOI 10.1007/978-94-007-3855-3_25.
4. Zarrouk, C. Contribution à l'étude d'une cyanophycée: influence de divers facteurs physiques et chimiques sur la croissance et la photosynthèse de Spirulina maxima (Setch et Gardner) Geitler : Ph. D. thesis / Zarrouk C. - Paris : Université de Paris, 1966. - 109 p.
5. Loftus, S. E. Cross-study analysis of factors affecting algae cultivation in recycled medium for biofuel production / S. E. Loftus, Z. I. Johnson // Algal Research. - 2017. -Vol. 24, part A. - P. 154-166. - DOI 10.1016/j.algal.2017.03.007.
6. Morocho-Jäcome, A. L. Evaluation of physicochemical treatment conditions for the reuse of a spent growth medium in Arthrospira platensis cultivation / A. L. Moro-cho-Jacome, G. F. Mascioli, S. Sato, J. C. M. de Carvalho // Algal Research. - 2016. -Vol. 13. - P. 159-166. - DOI 10.1016/j.algal.2015.11.022.
7. Morocho-Jäcome, A. L. Ferric sulfate coagulation and powdered activated carbon adsorption as simultaneous treatment to reuse the medium in Arthrospira platensis cultivation / A. L. Morocho-Jacome, S. Sato, J. C. M. de Carvalho // Journal of Chemical Technology & Biotechnology. - 2015. - Vol. 91, iss. 4. - P. 901-910. - DOI 10.1002/ jctb.4655.
8. Петрухина, Д. И. Исследование эффективности сохранения цианобактерии Spirulina subsalsa после криоконсервации при -80 °С в присутствии глюкозы / Д. И. Петрухина, И. Н. Лыков // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. - 2016. - Т. 6, № 4. - С. 68-73. - DOI 0.21285/2227-2925-2016-6-4-68-73.
9. Петрухина, Д. И. Низкотемпературное хранение цианобактерии Arthrospira platensis / Д. И. Петрухина, И. Н. Лыков // Технологии живых систем. - 2018. -Т. 15, № 1. - С. 49-54.
References
1. Eriksen N. T. Applied Microbiology and Biotechnology. 2008, vol. 80, iss. 1, pp. 1-14. DOI 10.1007/s00253-008-1542-y.
2. Vonshak A. Spirulina platensis (Arthrospira): physiology, cell-biology and biotechnology. London: CRC Press, 2002, 252 p.
3. Sili C., Torzillo G., Vonshak A. Ecology of Cyanobacteria II: Their Diversity in Space and Time. 2012, pp. 677-705. DOI 10.1007/978-94-007-3855-3_25.
4. Zarrouk C. Contribution à l'étude d'une cyanophycée: influence de divers facteurs physiques et chimiques sur la croissance et la photosynthèse de Spirulina maxima (Setch et Gardner) Geitler: Ph. D. thesis [Contribution to the study of cyanophyceae: influence of various physical and chemical factors on growth and photosynthesis of Spirulina maxima (Setch and Gardner) Geitler: Ph. D. thesis]. Paris: Université de Paris, 1966, 109 p.
5. Loftus S. E., Johnson Z. I. Algal Research. 2017, vol. 24, part A, pp. 154-166. DOI 10.1016/j.algal.2017.03.007.
6. Morocho-Jacome A. L., Mascioli G. F., Sato S., de Carvalho J. C. M. Algal Research. 2016, vol. 13, pp. 159-166. DOI 10.1016/j.algal.2015.11.022.
7. Morocho-Jacome A. L., Sato S., de Carvalho J. C. M. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 2015, vol. 91, iss. 4, pp. 901-910. DOI 10.1002/jctb.4655.
8. Petrukhina D. I., Lykov I. N. Izvestiya vuzov. Prikladnaya khimiya i biotekhnologiya [University proceedings. Applied chemistry and biotechnology]. 2016, vol. 6, no. 4, pp. 68-73. DOI 0.21285/2227-2925-2016-6-4-68-73.
9. Petrukhina D. I., Lykov I. N. Tekhnologii zhivykh system [Living system technologies]. 2018, vol. 15, no. 1, pp. 49-54.
Петрухина Дарья Игоревна соискатель, Калужский государственный университет имени К. Э. Циолковского (Россия, г. Калуга, ул. Степана Разина, 26)
E-mail: daria.petrukhina@outlook.com
Petrukhina Dar'ya Igorevna Applicant, Tsiolkovsky Kaluga State University (26 Stepana Razina street, Kaluga, Russia)
УДК 606:582.232 Петрухина, Д. И.
Перспективы использования разбавленной питательной среды для рекультивирования цианобактерий / Д. И. Петрухина // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки. - 2018. -№ 4 (24). - С. 3-9. - DOI 10.21685/2307-9150-2018-4-1.
