CC BY
31
УДК 606:582.232
Низкотемпературная консервация видов Cyanophyta (врЫта, ЛАНговрга)
Д. И. Петрухина
Петрухина Дарья Игоревна, преподаватель кафедры ботаники, микробиологии и экологии Института естествознания, Калужский государственный университет имени К. Э. Циолковского, [email protected]
Актуальность исследования обусловлена тем, что цианеи родов врШпа и АгШозрка входят в обширное число коллекций лабораторных культур микроорганизмов, а их традиционное хранение последовательным пересевом субкультур не обеспечивает долговременную сохранность. Данная статья направлена на выявление возможности долговременного низкотемпературного хранения цианей врЫта зиЬза1за и АйЬюзрка рШвпзз. В работе применяли хранение биомассы цианей в течение 12 месяцев при температуре минус 80°С. Замораживали со скоростью охлаждения минус 1°С. В статье представлены результаты экспериментов по влиянию различных криопротекторов на достижение сравнительно высокой выживаемости цианей после долговременной крио-консервации. Установлено, что оптимальными криопротекторами являются 10%-ные растворы глюкозы и диметилсульфоксида (ДМСО). Криопротекторных свойств не наблюдалось при использовании метанола, глицерина, этанола, D-сорбитола, сахарозы, Ьпролина и декстрина. Полученные данные свидетельствуют о том, что в. зиЬза1за и А. р1а1впз1з сохраняют свою жизнеспособность в течение 12 месяцев криоконсервации при минус 80°С. Таким образом, настоящее исследование демонстрирует возможность консервации цианей путем низкотемпературного хранения при минус 80°С. Материалы статьи могут использоваться в прикладной биотехнологии для совершенствования способов длительного хранения различных культур микроорганизмов. Ключевые слова: криоконсервация, хранение, цианопрокари-оты, АгШозрхарШвпз'з, врЫта зиЬза1за.
DOI: https://doi.org/10.18500/1816-9775-2019-19-1-58-63
Введение
В последние годы цианеи родов БрггыПпа и Arthrospira находят все большее применение в биотехнологических производствах. Однако опубликованные успешные результаты криоконсервации цианей относятся к представителям рода Arthrospira [1, 2], а для представителей рода Бр^иПпа успешных результатов криоконсервации опубликовано не было. Кроме того, не обнаружено данных об успешной выживаемости представителей Arthrospira и БрпиПпа после длительной криоконсервации с температурой хранения минус 80°С.
В связи с этим одной из задач работы является отработка методики длительной криоконсервации цианей (минимум 12 месяцев), прежде всего Spirulina, с использованием различных
эТрЧ I Г*//
криопротекторов, а также сравнительное изучение выживаемости разных видов цианей, относящихся к родам Spirulina и Arthrospira, при замораживании-хранении-оттаивании.
Исследованные в нашей работе штаммы Spi-тИш subsalsa РСС 9445 и Arthrospira platensis РСС 9223 входят в большое число частных кол -лекций лабораторных культур. Эти штаммы были получены из коллекции культур университета Пастера (Франция), где была проведена их таксономическая идентификация. Также, что крайне важно, в университете Пастера для каждого из используемых штаммов был четко обозначен статус альгологической чистоты (аксеничности).
В нашей работе цианеи родов Arthrospira и Spir-иИш замораживали со скоростью минус 1 °С/мин до минус 80 °С и хранили при этой температуре до 12 месяцев. Данная методика криоконсервации - скорость охлаждения минус 1 °С в минуту до минус 80 °С и хранение при этой температуре - ранее для Spirulina вр. не применялась.
Для выбора соединений в качестве крио-протекторов и оценки их эффективности при различной концентрации осуществляли криокон-сервацию £ subsalsa РСС 9445 и A. platensis РСС 9223, а после размораживания оценивали выживаемость цианей в процессе рекультивирования.
В экспериментальных работах, посвященных разработке методов криоконсервирования, авторы не приходят к единому мнению относительно критериев выживаемости/жизнеспособности организма. Традиционно решающим фактором для сохранения биологических ресурсов водорослей являлся минимальный уровень жизнеспособности и 60% считается достаточно высоким уровнем [3].
Однако в последнее время акцент в оценке сместился на надежность методики криоконсер-вирования, при этом «повторяемость» в виде процента жизнеспособных проб стала ключевым фактором вместо высокого уровня жизнеспособности клеток культур [4]. Это связано с тем, что сильные колебания в уровнях жизнеспособности клеток являются общими при криоконсервации водорослей, где могут быть и низкие уровни жизнеспособности (<30%) с периодическим изменением от партии криопроб к партии, и
даже изменением уровней жизнеспособности в пределах отдельной партии криопроб [4].
Важность того, что процент жизнеспособных проб остается на одном и том же уровне, даже если клетки культур из этих проб после криоконсервирования имеют невысокие темпы роста, продиктована еще и тем, что позволит исследователям рассчитывать количество проб, закладываемых на криосохранение, и тем самым, обеспечит высокую воспроизводимость результатов.
Материалы и методы
В работе использовали аксеничные штаммы Spirulina subsalsa PCC 9445 и Arthrospira platen-sis PCC 9223 из коллекции культур университета Пастера, Франция.
Исходные культуры цианей выращивали на питательной среде Заррука в автоклавированных конических стеклянных колбах Эрленмейера с широким горлышком объемом 100 мл с пробками из целлюлозной массы. Питательную среду Заррука стерилизовали фильтрованием через стерильный фильтр из ацетата целлюлозы (диаметр пор 0,45 мкм) и в количестве 20 мл добавляли в колбы Эрленмейера. Цианеи культивировали при температуре 30 °С в инкубаторе Minitron (фирма Infors HT, Швейцария) с постоянным перемешиванием с помощью встроенного орбитального шейкера диаметром качания 25 мм. Частота вращения составляла 110 об/мин. Освещение обеспечивали шестью люминесцентными лампами Grolux 15W (фирма Osram Sylvania, США), которые располагались над колбами на высоте 40 см, обеспечивая среднюю интенсивность света на поверхности клеточной суспензии 21 мкмоль/(м2с). Выращивание цианей осуществляли с 16-часовым фотоциклом. После окончания цикла культивирования питательную среду удаляли в стерильных условиях, а биомассу цианей промывали стерильной дистиллированной водой. Отмытую биомассу в количестве 0,9 мл помещали в полипропиленовые криофла-коны объемом 2 мл с завинчивающейся крышкой. Затем в эти же криофлаконы в качестве криопро-тектора добавляли одномоментно стерильный раствор выбранного криопротектора в двойной концентрации до отметки общего объема в 1,8 мл. После этого криофлаконы выдерживали в темноте при постоянном перемешивании на ротаторе со скоростью 20 об/мин. Время экспозиции зависело от вида криопротектора, для токсичных - 10 мин, для остальных - 20 мин.
После инкубирования с криопротекторами в темноте криофлаконы с цианеями помещали
в полимерный контейнер для замораживания (Mr. Frosty, Nalgane, США), который был предварительно охлажден до 4 °С в течение минимум 5 часов. Данный контейнер обеспечивает воспроизводимую скорость охлаждения минус 1°C в минуту. Контейнер Mr. Frosty с криофлаконами помещали в морозильную камеру, в которой поддерживалась постоянная температура минус 80 °С. Через 1,5 ч криофлаконы с цианеями перемещали из контейнера Mr. Frosty™ в пластиковые боксы и продолжали хранить при температуре минус 80°С. Для размораживания криофлаконы с цианеями извлекали из морозильной камеры и переносили на водяную баню с температурой воды 37 °С, где выдерживали до исчезновения льда. После размораживания цианеи удаляли из криофлакона и переносили в стерильную колбу Эрленмейера с 5 мл питательной среды Заррука. Эти колбы для предотвращения фотоокисления культивировали в течение первых 40 мин при комнатной температуре в темноте, после чего в них добавляли еще 5 мл питательной среды Заррука. Последующее культивирование проводили в течение 2 ч при освещении 10-12 мкмоль фото-нов/(м2с). Затем колбы Эрленмейера с цианеями инкубировали как исходные культуры.
В своей работе оценку качества замороженного биоматериала через исследуемый срок хранения проводили после оттаивания путем сравнительного определения количества проб, из которых произошло успешное рекультивирование клеток после криоконсервации. Полученные результаты приведены в виде процента «жизнеспособных» проб, у которых наблюдался прирост биомассы после выращивания в течение 25 дней при температуре 30 °С и интенсивности освещения 21 мкмоль фотонов/(м2с), от общего количества замороженных проб. Замораживали по 30 проб для каждого варианта эксперимента. Проводили по 5 повторов для эксперимента.
В качестве криопротекторов были взяты различные вещества: диметилсульфоксид (ДМСО), гуммиарабик, спирты (глицерин, метанол, этанол, Д-сорбитол), сахара (декстрин, глюкоза, сахароза), аминокислоты (L-пролин). Для данных веществ ранее была показана возможность применения в качестве криопротекторов при криоконсервации у различных водорослей, преимущественно в концентрациях от 5 до 20% [5].
Результаты и их обсуждение
Было установлено, что наиболее эффективными из использованного комплекса криопротек-торов оказались ДМСО, глюкоза и гуммиарабик (табл. 1, 2).
Таблица 2
Влияние концентрации криопротектора на выживаемость A. platensis PCC 9223 после 12 месяцев хранения при температуре минус 80 °С
Таблица 1
Влияние концентрации криопротектора на выживаемость S. subsalsa PCC 9445 после 12 месяцев хранения при температуре минус 80 °С
Криопротектор Концентрация криопротектора, %
5 10 15 20
Процент проб с выжившими цианеями от общего количества проб
Без криопротектора 0,0 0,0 0,0 0,0
ДМСО 48,6 ± 07 68,6 ± 1,0 31,4 ± 0,3 0,0
Метанол 0,0 0,0 0,0 0,0
Глицерин 0,0 0,0 0,0 0,0
Глюкоза 40,0 ± 0,5 57,1 ± 1,1 42,8 ± 0,3 10,0 ± 1,0
Этанол 0,0 0,0 0,0 0,0
Гуммиарабик 11,4 ± 0,1 11,4 ± 0,9 0,0 0,0
Д-сорбитол 0,0 0,0 0,0 0,0
Сахароза 0,0 0,0 0,0 0,0
L-пролин 0,0 0,0 0,0 0,0
Декстрин 0,0 0,0 0,0 0,0
Криопротектор Концентрация криопротектора, %
5 10 15 20
Процент проб с выжившими цианеями от общего количества проб
Без криопротектора 0,0 0,0 0,0 0,0
ДМСО 45,5 ± 0,3 55,0 ± 1,0 45,0 ± 1,5 0,0
Метанол 0,0 0,0 0,0 0,0
Глицерин 0,0 0,0 0,0 0,0
Глюкоза 41,3 ± 0,5 59,0 ± 0,5 43,2 ± 0,5 13,0 ± 1,0
Этанол 0,0 0,0 0,0 0,0
Гуммиарабик 0,0 0,0 0,0 0,0
Д-сорбитол 0,0 0,0 0,0 0,0
Сахароза 0,0 0,0 0,0 0,0
L-пролин 0,0 0,0 0,0 0,0
Декстрин 0,0 0,0 0,0 0,0
Как видно из табл. 1 и 2, большинство соединений, рекомендуемых в качестве криопротекторов, не способствовали сохранению жизнеспособности исследуемых цианей. После криоконсервации цианей S. subsalsa PCC 9445 и A. platensis PCC 9223 с использованием в качестве криопротекторов таких веществ, как метанол, глицерин, этанол, сахароза, Д-сорбитол, L-пролин и декстрин, рост размороженных культур во время культивирования не наблюдался. Рост культур с применением данных криопротекторов не наблюдался также и после менее длительной криоконсервации, в течение 3 и 6 месяцев.
После криохранения цианей в отсутствии криопротектора роста культур после 12-месячной криоконсервации и последующего оттаивания также не наблюдали, что совпало с данными, полученными в исследовании Muhling [6]. Такой же результат был получен и после 3 и 6 месяцев криоконсервации.
Таким образом, полученные результаты исследования не подтвердили эффективность криозащитных свойств L-пролина [1, 5], как и глицерина [2, 6], метанола [6], этанола и сор-битола [5], которые ранее были рекомендованы в качестве криопротекторов при хранении различных видов водорослей. Также результаты
исследования подтвердили то, что сахароза в качестве криопротектора не была эффективной для цианей S. subsalsa PCC 9445 и A. platensis PCC 9223, что согласуется с данными Takano и соавт. [1].
После использования в качестве криопротекторов ДМСО, глюкозы и гуммиарабика жиз-
неспособность цианей S. subsalsa PCC 9445 и A. platensis PCC 9223 восстанавливалась с различной степенью эффективности. Так, ДМСО и глюкоза в концентрациях 5, 10 и 15% обеспечивали хорошее (41-59%) сохранение и выживаемость цианей при хранении цианей при температуре минус 80 °С (рис. 1, 2).
Рис. 1. Выживаемость Б. зыЪзаЬа РСС 9445 в зависимости от срока криохранения (процент проб с выжившими цианеями от общего количества проб)
Рис. 2. Выживаемость A. platensis PCC 9223 в зависимости от срока криохранения (процент проб с выжившими цианеями от общего количества проб)
Тем не менее полученные результаты исследования выявили различия между двумя видами цианей, которых подвергали криоконсервации. Так, выживаемость цианеи S. subsalsa PCC 9445 была наилучшей в присутствии ДМСО 10 %, а вот для цианеи A. platensis PCC 9223 наилучшей выживаемости удалось достигнуть в присутствии 10 %-ной глюкозы. Однако наибольшее различие между видами цианей наблюдалось при использовании в качестве криопротектора гуммиарабика. Так, гуммиарабик при кратко-
срочной криоконсервации способствовал восстановлению исследуемых цианей, что согласуется с Takano и соавт. [1], однако не обеспечивал оптимальной выживаемости в течение всего срока наблюдения для A. platensis PCC 9223 (см. рис. 2), а у S. subsalsa PCC 9445 выживаемость составила 11,4%.
Поскольку методика криоконсервации должна быть применимой для всех исследуемых штаммов Spirulina и Arthrospira, гуммиарабик не может быть рекомендован как эффективный
криопротектор, а потому не был задействован в дальнейших исследованиях. В то же время при необходимости унифицировать методику криоконсервации как для цианеи & subsalsa РСС 9445, так и цианеи A. platensis РСС 9223 может быть использована и глюкоза, и ДМСО. Результат такой криоконсервации будет оптимальным. Хотя для лучшего результата криоконсервации можно рекомендовать использовать для S. subsalsa РСС 9445 - 10%-ный ДМСО, а для A. platensis РСС 9223 -10%-ную глюкозу.
Полученные результаты исследования продемонстрировали некоторые различия по выживаемости после длительной (12 месяцев) криоконсервации у двух видов цианей из близкородственных родов. Хранение осуществляли при минус 80 °С, замораживали со скоростью охлаждения в 1 °С/мин. В таких условиях защитные свойства для обоих видов цианей наиболее эффективно проявляли ДМСО и глюкоза. В то же время такие наиболее распространенные криопротекторы, как глицерин и метанол не проявляли защитные свойства. Цианея A. platensis РСС 9223 в присутствии 10%-ной глюкозы имела выживаемость 59,0%, а с 10%-ным ДМСО несколько ниже - 55,0%. Для S. subsalsa РСС 9445 была впервые определена методика криоконсервирования и приведены успешные криопротекторы и их концентрации. Так, в присутствии 10%-ного ДМСО выживаемость S. subsalsa РСС 9445 составляла 68,6%, а 10%-ной глюкозы - только 57,1%.
Поскольку наилучшие результаты были получены при концентрации криопротекторов 10 и 15% ДМСО и глюкозы, то именно эти концентрации могут быть взяты за основу при проведении дальнейших исследований по изучению сохранения жизнеспособности этих штаммов после оттаивания.
Полученные результаты подтверждают, что наиболее безопасной и эффективной для криоконсервации цианей считается 5-15% концентрация ДМСО [1, 2, 6, 7]. Кроме того, исследование действия химических соединений при криоконсервации показало, что наилучшие защитные свойства для S. subsalsa РСС 9445 и A. platensis РСС 9223 продемонстрировала 5-15% глюкоза, добавленная в пробы перед криохранением.
Глюкозу используют в концентрациях 3-15% для криохранения бактерий [5], в основном молочнокислых. Однако в доступной литературе отсутствуют данные об использовании глюкозы в качестве криопротектора для криоконсервации цианей Arthrospira вр. и Spirulina вр.
Заключение
Таким образом, были исследованы условия длительного низкотемпературного консервирования штаммов Spirulina и Arthrospira. Предложенная в этой работе методика - замораживание со скоростью минус 1 °C в минуту до минус 80 °C и хранение при этой температуре - обеспечивает сохранность жизнеспособности штаммов S. subsalsa PCC 9445 и A. platensis PCC 9223 в течение 12 месяцев. Исследование действия химических соединений при криохранении показало, что наилучшие защитные свойства для всех штаммов цианей продемонстрировала 5-15% глюкоза и ДМСО, добавленные в пробы перед криохранением. Отсутствие криопротек-тора, а также добавление в качестве криопро-тектора водных растворов таких веществ, как метанол, глицерин, этанол, сахароза, Д-сорбитол, L-пролин и декстрин ни для одного штамма не дали выраженного положительного эффекта. Впервые было показано, что из общеприменяе-мых криопротекторов подошли только глюкоза и ДМСО, кроме того, рекомендовано для штамма S. subsalsa PCC 9445 применение ДМСО, а для A. platensis PCC 9223 - раствора глюкозы.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке стипендии Президента Российской Федерации для обучения за рубежом аспирантов российских вузов, стипендии MULTIC от международной стипендиальной программы ERASMUSMUNDUS Action 2 и стипендии Дрезденского технического университета для развития научной карьеры у женщин (Scholarship Program for the Promotion of Early-Career Female Scientists of TUDresden).
Список литературы
1. Takano M., Sado J. I., Ogawa T., Terui G. Freezing and Freeze-Drying of Spirulina platensis // Cryobiology. 1973. Vol. 10, iss. 5. P. 440-444. DOI: 10.1016/0011-2240(73)90073-4
2. Motham M., Peerapornpisal Y., Tongsriri S., Pumas Ch., Vacharapiyasophon P. High Subzero Temperature Preservation of Spirulina platensis (Arthrospira fusiformis) and Its Ultrastucture // Chiang Mai Journal of Science. 2012. Vol. 39, iss. 4. P. 554-561.
3. Morris G. J. Cryopreservation : An Introduction to Cryo-preservation in Culture Collections Institute of Terrestrial Ecology. Cambridge : Institute of Terrestrial Ecology, 1981. 40 р.
4. Day J. G., Fleck R. A. Cryo-injury in algae and the implications this has to the conservation of micro-algae // Micro-algae Biotechnology. 2015. Vol. 1. Р. 1-11. DOI: 10.1515/ micbi-2015-0001
5. Hubälek Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms // Cryobiology. 2003. Vol. 46, iss. 3. P. 205-229. DOI: https://doi.org/10.1016/S0011-2240(03)00046-4
6. Muhling M. Characterization of Arthrospira (Spirulina) strains : dissertation. Durham, 2000. 308 p.
7. Day J. G. Cryopreservation of Microalgae and Cyanobac-teria // Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. Methods in Molecular Biology™, vol. 368 / eds. J. G. Day, G. N. Stacey. Totowa : Humana Press, 2007. P. 141-151. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-59745-362-2
Образец для цитирования:
Петрухина Д. И. Низкотемпературная консервация видов Cyanophyta (Spirulina, Arthrospira) // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2019. Т. 19, вып. 1. С. 58-63. DOI: https://doi.org/10.18500/1816-9775-2019-19-1-58-63
Low Temperature Preservation
of an Economically Important Cyanophyta Species
(Spirulina, Arthrospira)
D. I. Petrukhina
Daria I. Petrukhina, https://orcid.org/0000-0002-5790-9958, Tsiolkov-sky Kaluga State University, 26 Stepan Razin's Str., Kaluga 248023, Russia, [email protected]
Spirulina and Arthrospira cyanoprokaryota species include a wide variety of laboratory microorganism culture collections and their traditional storage by means of isolate passages does not provide long-term preservation. The rationale for this study is to evaluate the possibility of long-term low temperature storage of Spirulina subsalsa and Arthrospira platensis cyanoprokaryota. Cyanoprokaryota biomass was stored for 12 months at minus 80 The cooling rate was minus 1 The effects of various cryoprotectants in achieving comparatively high survival of cyanoprokaryota after long-term cryopreservation are presented in the article. It was determined that optimal cryoprotectants were 10% glucose and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) solutions. No cryoprotection has been seen without cryoprotectant, or with methanol, glycerol, ethanol, D-sorbitol, sucrose, L-Proline, dextrin. The obtained data showed that S. subsalsa and A. platensis preserved their viability during a 12 months storage period at minus 80 Thus, the present study demonstrates the possibility of preservation of cyanoprokaryota using low temperature storage at minus 80 Materials of the article can contribute to applied biotechnology through the improvement of long-term storage methods for different microorganisms cultures. Keywords: cryopreservation, storage, cyanoprokaryota, Spirulina subsalsa, Arthrospira platensis.
Acknowledgements: This work was been supported by the Russian Federation President Schol-
arships for studies abroad, ERASMUS MUNDUS
Action 2 MULTIC and Scholarship Program for
the Promotion of Early-Career Female Scientists
of TU Dresden.
References
1. Takano M., Sado J. I., Ogawa T., Terui G. Freezing and Freeze-Drying of Spirulina platensis. Cryobiology, 1973, vol. 10, iss. 5, pp. 440-444. DOI: 10.1016/0011-2240(73)90073-4
2. Motham M., Peerapornpisal Y., Tongsriri S., Pumas Ch., Vacharapiyasophon P. High Subzero Temperature Preservation of Spirulina platensis (Arthrospira fusiformis) and Its Ultrastucture. Chiang Mai Journal of Science, 2012, vol. 39, iss. 4, pp. 554-561.
3. Morris G. J. Cryopreservation: An Introduction to Cryopreservation in Culture Collections Institute of Terrestrial Ecology. Cambridge, Institute of Terrestrial Ecology, 1981. 40 р.
4. Day J. G., Fleck R. A. Cryo-injury in algae and the implications this has to the conservation of micro-algae. Microal-gae Biotechnology, 2015, vol. 1, pp. 1-11. DOI: 10.1515/ micbi-2015-0001
5. Hubalek Z. Protectants used in the cryopreservation ofmicro-organisms. Cryobiology, 2003, vol. 46, iss. 3, pp. 205-229. DOI: 10.1016/S0011-2240(03)00046-4
6. Muhling M. Characterization of Arthrospira (Spirulina) strains. Diss. PhD (Biol.). Durham, 2000. 308 p.
7. Day J. G. Cryopreservation of Microalgae and Cyanobac-teria. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. Methods in Molecular Biology™, vol. 368. Eds. J. G. Day, G. N. Stacey. Totowa, Humana Press, 2007, pp. 141-151. DOI: 10.1007/978-1-59745-362-2
Сite this article as:
Petrukhina D. I. Low Temperature Preservation of an Economically Important Cyanophyta Species (Spirulina, Arthrospira). Izv. Saratov Univ. (N. S.), Ser. Chemistry. Biology. Ecology, 2019, vol. 19, iss. 1, pp. 58-63 (in Russian). DOI: https: //doi.org/10.18500/1816-9775-2019-19-1-58-63
