CC BY
41
МИКОЛОГИЯ И АЛЬГОЛОГИЯ
УДК 621.371
ПРОЯВЛЕНИЕ СОЛЕТОЛЕРАНТНОСТИ ЦИАНОБАКТЕРИЙ РОДА ARTHROSPIRA (SPIRULINA) -SPIRULINA PLATENSIS И SPIRULINA MAXIMA
А.Х. Тамбиев, С.Г. Васильева, А.А. Лукьянов
(кафедра биоинженерии; e-mail: tambiev@mail.ru)
Изучена солетолерантность у двух представителей рода Spirulina (Arthrospira) Spirulina platensis и Spirulina maxima, являющихся распространенными объектами фотобиотехнологии, и было показано, что добавление в среду морской воды с содержанием 5—15% не вызывает уменьшения выхода биомассы культур более чем на 15—20% от контроля. Дальнейшее уменьшение выхода биомассы происходило пропорционально увеличению содержания морской воды в среде. Исследование реакционной способности (РС) нативных экзомета-болитов, выделяемых в среду, как критерия физиологического состояния культур показало зависимость уровня окислительной активности (ОА) экзометаболитов от присутствия в среде морской воды, а часовая ритмика изменения ОА проявила различия между исследованными культурами.
Ключевые слова: цианобактерии, нативные экзометаболиты, реакционная способность, часовая ритмика, химическая модель.
Представители цианобактерий рода Arthrospira (Spirulina), такие как Spirulina platensis, Spirulina maxima, Spirulina pasifica, Spirulina fusiformis, широко используются в фотобиотехнологии как источники белка, незаменимых аминокислот, витаминов, в первую очередь группы В, р-каротина, различных элементов, и других полезных соединений.
Культивирование осуществляется в целом ряде стран (Израиль, США, Индия, Япония, Тайвань, Италия, Германия, Таиланд, Франция, Египет и др.), его ведут способами открытого культивирования в искусственных водоемах или в высокотехнологичных открытых фотобиореакторах с использованием солнечного освещения, а также закрытых фотобио-реакторах с искусственным освещением и поддержанием необходимой температуры.
Хорошо известен химический состав биомассы представителей рода спирулина, преимущества культивирования состоят в простоте сбора биомассы и ее высушивания, хорошей извлекаемости содержимого клеток и высокой биологической ценности [1—6].
В клетках S. maxima и S. platensis содержание белка в зависимости от места обитания колеблется от 55 до 70% от массы сухих клеток, белок спиру-лины сбалансирован по всем незаменимым аминокислотам, количество липидов доходит до 12%, в их составе преобладают ненасыщенные жирные кислоты, присутствует редкая гамма-линоленовая кислота, в клетках содержится значительное количество витаминов группы В [6]. По содержанию р-каро-тина Spirulina значительно превосходит любые про-
дукты питания. В достаточных количествах в ней содержатся такие элементы, как калий, железо, магний, фосфор, кальций, а также многие эссенци-альные микроэлементы, при этом минеральные вещества представлены в основном хелатными соединениями, что способствует их хорошей усвояемости организмом человека [6, 7].
В хорошо подобранных условиях выход биомассы представителей рода Spirulina может быть чрезвычайно высок. Дальнейшее повышение рентабельности выращивания цианобактерий рода спирулина может идти за счет удешевления сред и совершенствования приемов культивирования, а увеличение солетолерантности цианобактерий дает возможность, применяя среды различной солености, проводить их оптимизацию, что будет снижать себестоимость биомассы.
Имеется литература, посвященная солетолеран-тности цианобактерий. В работе с использованием морской воды в качестве ростовой среды с добавками нитрата или мочевины для массового культивирования S. maxima в аридных и пустынных областях южной Италии были показаны незначительные различия в выходе биомассы для этой среды по сравнению с синтетической [8]. В прибрежной зоне Чили в прудах было организовано проточное культивирование S. maxima на среде, включающей 30% морской воды, бикарбонат натрия, фосфат аммония и селитру, и для достижения выхода биомассы, равного 30 т/га/год, был важен режим перемешивания среды [9].
В работе [10] было показано, что солетолерант-ность S. platensis может быть увеличена в условиях уменьшенного содержания NaHC03 в среде, а полученный мутант S. platensis — суперпродуцент про-лина — был более толерантным к гиперсоленому стрессу, чем исходный штамм [11]. Было показано, что при росте S. platensis на средах с низким и высоким содержанием морской соли основным низкомолекулярным углеводом, накапливающимся в клетках, является глюкозилглицерин, концентрация которого менялась с увеличением солености до максимальной — 243,3 ммоль/кг сух. веса [11]. Для морской цианобактерии Microcoleus chtonoplas-tes при выращивании на средах в интервале солености от 2 до 23% было показано накопление в клетках глюкозилглицерина как единственного осмо-лита, и при максимальной солености его содержание в клетках достигало 40% от веса сухой биомассы [12]. При изучении роста морской цианобактерии S. subsalsa на средах с морской водой было показано, что на гиперсоленых средах в клетках в три раза повышалось содержание глицинбетаина по сравнению с клетками, выращенными на среде с низким содержанием солей [13].
При использовании в составе сред для S. pla-tensis черноморской воды в различных концентрациях от 5 до 40% отмечались морфологические изменения — менялись длина нитей, число спиралей, их внешний диаметр, а также наблюдался ряд цитологических изменений [14]. В одной из работ авторы предполагали, что растворимые органические вещества, накапливаемые в ответ на солевой стресс, могут служить главной биохимической характеристикой, отличающей морские и пресноводные формы рода Spirulina [15].
Объекты и методы исследования
Опыты проводили с альгологически чистыми культурами цианобактерий рода Spirulina (Arthrospi-ra) Spirulina platensis и Spirulina maxima.
Культивирование проводили на модифицированной среде Зарука [16] в стационарных условиях в люминостате при температуре 30—32° и освещенности 1000—1500 лк. Среду автоклавировали при 1 атм, рН после автоклавирования 9,5—9,6.
Среды различной солености готовили путем добавления к среде Зарука морской воды, которую приготавливали путем растворения 32 г сухой морской соли (полученной из черноморской воды) в 1 л дистиллированной воды с дальнейшим фильтрованием через бумажный фильтр.
Биомассу Spirulina определяли нефелометриче-ски, а также весовым методом. Клетки цианобакте-рий отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 мин, осадок промывали подкисленной дистиллированной водой и помещали в бюкс.
Нативные экзометаболиты, выделяемые в куль-туральную среду при нормальной жизнедеятельности клеток, в состав которых могут входить различные ценные и полезные соединения, могут трансформироваться в среде и осуществлять в ней ряд функций, а также являться регуляторами устойчивости водных и наземных биоценозов [17]. Изменения их свойств, количественного и качественного состава связаны с ростом и физиологическим состоянием культур различных таксонов микроорганизмов [18].
Нами был предложен сравнительно несложный экспрессный метод химических моделей для определения интегральных свойств нативных экзомета-болитов, с помощью которого возможно быстро определить физиологическое состояние продуцирующих их объектов по реакционной способности (РС) культуральной среды как соотношению окислительной (ОА) и антиокислительной (АОА) активностей выделяемых в среду нативных экзометаболитов с использованием в качестве индикатора 3,4-диоксифе-нилаланина (ДОФА) [18]. Культуральную жидкость S. platensis и S. maxima, содержащую нативные экзометаболиты в количестве 2,5 мл, смешивали с 1,5 мл раствора ДОФА (конечная концентрация в пробе 7,1 • 10-4 М), затем измерения РС проводили на оригинальном приборе "Аквакон" при 45°. Контролем служила питательная среда без засева цианобак-терий, значения контроля откладывались на графиках по оси абсцисс (100%). Реакционную способность (РС) определяли в процессе роста культур либо в зависимости от времени суток при определении часовой ритмики.
Контролем в опытах служило автоокисление химической модели (ДОФА), проходящее через ряд радикальных состояний [19] с изменением оптической плотности и появлением меланина. Ускорение автоокисления ДОФА и превышение контроля свидетельствует об окислительной активности выделяемых в среду нативных экзометаболитов, а при торможении автоокисления ДОФА наблюдается их антиокислительная активность [18].
Результаты и обсуждение
Сравнивался рост культур S. maxima и S. platensis на полной среде Зарука (контроль) и было показано, что биомасса S. maxima в те же сроки роста несколько превышала биомассу S. platensis, т.е. первая культура была более продуктивна.
Также сравнивался рост культур на полной (контроль) и разбавленной вдвое среде Зарука. В этом случае биомасса S. maxima заметно, на 25—30%, была меньше на разбавленной среде к началу стационарной фазы, при этом разница росла с увеличением времени культивирования. Культура S. pla-tensis в отличие от S. maxima отставала по скорости роста на разбавленной среде значительно меньше, что составляло 15—25% на 30-й день культивирова-
Рис. 1. Выход биомассы S. maxima и S. platensis (возраст — 30 сут) в зависимости от концентрации морской соли в среде
ния, и в этом случае разница между контрольной и опытной культурами уменьшалась. Эти данные, по нашему мнению, в перспективе можно учитывать при массовом культивировании этих объектов фотобиотехнологии.
Далее оба исследованных вида цианобактерий культивировались на полной среде Зарука и с добавлением искусственной морской воды в концентрациях от 5 до 90% по объему. В культуре S. maxima наиболее близкие к контролю количества биомассы были получены на средах с содержанием морской воды от 5 до 15% (рис. 1). Видно, что к 30-м сут роста полученная сухая биомасса составляла примерно 80% от контроля. Далее с увеличением содержания морской воды в среде рост культуры £ maxima замедлялся и конечная сухая биомасса уменьшалась примерно до 15% от контроля.
В опытах с культурой £ platensis была выявлена такая же зависимость, за исключением того, что отставание в выходе биомассы было несколько больше, чем у культуры S. maxima (рис. 1), при этом нами не было получено, как это указывалось в работе [14], активизации роста культуры S. platensis на среде с содержанием морской воды 40—60%. Значения рН для всех вариантов опыта у обеих культур снижались с увеличением концентрации морской воды в среде, что коррелировало с уменьшением выхода биомассы.
В работе [20] изучалось влияние солености среды на рост и биохимический состав S. platensis. В среду вводился хлорид натрия в концентрациях 10—70 г/л и было показано, что концентрацию хлорида в 20—30 г/л можно считать границей для оптимального роста, после которого начинается его интенсивное угнетение. Это несколько отличается от наших данных по S. platensis, что можно объяснить отличиями в условиях опыта. У нас в среду добавлялся не хлорид натрия, а морская вода, приготовленная из сухой морской соли, полученной из черноморской воды, в цитируемой работе применялась значи-
тельная освещенность и барботаж колб с культурами. В работе [21] исследовалось влияние повышенных концентраций хлорида натрия на некоторые биохимические показатели в культуре S. platensis.
Исследуемые культуры цианобактерий по-разному реагировали на увеличение концентрации морской воды в среде: у S. maxima длина нитей трихома увеличивалась, а у S. platensis уменьшалась.
Изменения реакционной способности (РС) на-тивных экзометаболитов, выделяемых в среду, показали у обеих культур на полной среде Зарука и среде с 15% содержания морской воды, что им свойственна окислительная активность (ОА), которая на полной среде в 1,5—2 раза выше, чем в присутствии морской воды, что согласно ряду работ, свидетельствует о том, что, ухудшение условий культивирования вызывает уменьшение ОА нативных экзометаболитов [18].
Исследовалась часовая ритмика изменения РС нативных экзометаболитов указанных культур циа-нобактерий на среде Зарука с 15%-м содержанием морской воды. Возраст культур составлял 13 сут (логарифмическая фаза), измерения проводились с 9 до 19 часов через каждые 2 часа. Данные представлены на рис. 2 и 3. Видно, что ОА нативных экзометаболитов S. maxima на полной среде Зарука была выше, как уже говорилось, в 9 часов, после чего до 11 часов наблюдали незначительное понижение ОА, затем следовал подъем ОА с 13 до 15 часов, после чего в следующие 2 часа ОА уменьшалась почти вдвое с незначительным повышением к 19 часам (рис. 2).
На среде с содержанием морской воды у культуры S. maxima наблюдалась сходная закономерность, отличие состояло в том, что первое понижение ОА растянулось до 13 часов, затем следовал подъем, как и в случае полной среды, но менее выраженный, после чего следовало такое же понижение к 17 часам, которое сохранялось до 19 часов (рис. 2).
Рис. 2. Часовая ритмика РС нативных экзометаболитов S. maxima на полной среде Зарука и с содержанием 15% мор ской воды
Рис. 3. Часовая ритмика PC нативных экзометаболитов S. platensis на полной среде Зарука и с содержанием 15% морской воды
В случае культуры S. platensis на полной среде значения OA в 9 часов утра были такими же, как у S. maxima, но далее часовая кривая S. platensis, в отличие от таковой у S. maxima, имела не один, а два подъема (рис. 3). Первый наблюдался в 13 часов, затем наблюдалось понижение OA почти в два раза и последующий подъем к 19 часам. Кривая OA у S. platensis на среде с морской водой была сходна с таковой у S. maxima и имела повышение также в 15 часов, после чего OA снижалась к 19 часам (рис. 3).
Таким образом, при росте на полной среде За-рука обе культуры имеют разную часовую ритмику PC нативных экзометаболитов, что, по нашему мне-
нию, представляет собой один из видоспецифичных признаков этих сравнительно трудноразличимых культур. Ухудшение условий культивирования на среде с добавлением морской воды, возможно, нивелирует эти различия и кривые становятся сходными.
Часовые ритмы PC нативных экзометаболитов были описаны нами ранее у зеленой морской микроводоросли Platymonas viridis Rouch. [22—24]. По сравнению с ней наблюдаемый подъем ОА у S. maxima и второй подъем у S. platensis в дневные часы, определяемые возрастанием фотос интетической активности культур, имеют более растянутый характер с последующим понижением.
В итоге приведенные данные показали возможность культивирования цианобактерий S. maxima и S. platensis на разбавленных средах и средах с различной концентрацией морской воды (от 5 до 90%). Наименьшие отличия по биомассе от контроля на 30-е сут роста наблюдались на средах с концентрацией морской воды от 5 до 15%, начиная с которой снижение выхода биомассы обеих культур линейно зависит от повышения концентрации в среде морской воды.
Исследованные культуры различаются при росте на полной среде, по величине PC, а именно, по величине ОА нативных экзометаболитов, а также по часовым ритмам — форме и наличию дневных максимумов, что является, видимо, таксономическим различием между ними. Культивирование на среде с 15% морской воды уменьшает величину ОА в два раза по сравнению с культивированием на полной среде, что связано с изменениями физиологического состояния культур.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ciferri O. Spirulina, the edible microorganism // Microbiol. Rev. 1983. Vol. 12. P. 551-578.
2. Ciferri O, Tiboni O. The biochemistry and industrial potential of Spirulina // Ann. Rev. Microbiol. 1988. Vol. 39. P. 503-526.
3. Dragos N, Hodisan V., Peterfi L. Spirulina, Caracte-rizarea biologica, obtinerea sivaloria ficarea biomasei // Cont-ributii botanice. 1987. P. 235-257.
4. Bai N.Y. Mass culture of Spirulina and its morphological variability leading to reflections on species concept in Cyanophita // Arch. Hydrobiol. Suppl. 1985. Vol. 71. N 1-2. P. 219.
5. Vonshak A. Strain selection of Spirulina suitable for mass production // Hydrobiology. 1987. N 151-152. P. 75-77.
6. Тамбиев A.X., Кирикоеа H.H., Мазо B.K. Циа-нобактерии рода Spirulina как перспективный объект фотобиотехнологии // Технологии живых систем. 2006. Т. 3. № 2.
7. Henrikson R. Earth Food Spirulina. Keenwood: Ro-nore Enterprises, 1997.
8. Tredici M.R., Papusso T., Tomasello V., Milicia F., Balloni W. La coltura di Spirulina su acgua di mare // Bio-
tecnologie per la produzione di Spirulina. Rome: CNR-IPRA-ROMA, 1987. P. 73-89.
9. Valderrama G., Gardenas A., Marcovits A. On the economics of Spirulina production in Chile with details on dragboard mixing in shallow ponds // Hydrobiology. 1987. N 151-152. P. 71-74.
10. Rippka R., Deruelles J., Waterbury J.B., Stainer R.I., Herdmann M.A. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria // J. Gen. Microbiol. 1979. Vol. 111. P. 1-61.
11. Reed R.H., Warr S.R.C., Richardson D.L., Moore D.J., Stewart W.D.P. Blue-green alga prospects and perspectives // Plant and Soil. 1985. Vol. 89. P. 97-106.
12. Кевбрин B.B., Дубинин A.B., Осипов T.A. Осмо-регуляция у морской цианобактерии Microcoleus chono-plastes // Микробиология. 1991. Т. 60. № 4. С. 596-600.
13. Gabbay R., Tellor E. Cyanobacterial biomass production in saline media // Plant and Soil. 1985. Vol. 89. P. 107-116.
14. Popovici J.H., Boldor O., Toma T., Wicola W., Titu H. Sea water used for the culture of a alga Spurulina platensis // Rev. roum. biol. Ser. biol. veg. 1986. Vol. 31. N 2. P. 131-136.
15. Reed R.H, Richardson D.L., Warr I.K., Stewart W.D.B. Carbohydrate accumulation and osmotic stress in cyanobac-teria// J. of General Microbiology. 1984. Vol.130. N 1. P. 1—4.
16. Михайлов A.A., Верзилин H.H., Пиневич B.B., Ша-ренкова Х. Влияние температурных и световых условий культивирования на продуктивность Spirulina platensis // Науч. докл. высшей школы. Биологические науки. 1972. № 2. C. 57—63.
17. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н. Регуляторные функции экзометаболитов бактерий // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 483—488.
18. Тамбиев А.Х.Реакционная способность экзомета-болитов растений. М., 1984. 72 с.
19. Верц К., Рейц Д., Дравникс Ф. Исследование методом ЭПР автоокисления 3,4-диоксифенилаланина // Свободные радикалы в биологических системах. М.: ИЛ., 1963. C. 223—226.
20. Зотина Т.А., Болсуновский А.Я., Калачева Г.С. Влияние солености среды на рост и биохимический состав цианобактерии Spirulina platensis // Биотехнология. 2000. № 1. C. 85—88.
21. Ben Dhiab R., Ben Ouada H. Growth, fluorescence, photosynthetic O2 production and pigment content of salt adapted cultures of Arthrospira (Spirulina) platensis // Journal of Applied Phycology. 2007. Vol. 19. P. 293—301.
22. Тамбиев A.X., Лапшин О.М. Временные ритмы изменений реакционной способности среды морских водорослей // Применение научных разработок ученых-биологов в рыбном хозяйстве. М.: Изд -во Моск. ун-та, 1987. C. 131—136.
23. Tambiev A.H., Lapshin O.M. Rhythms of excretion of organic substances by microalgae // Abstr. 8th Inter. Bio-technol. Sympos. 1988. Paris. P. 128.
24. Тамбиев A.X., Кирикова H.H., Бецкий О.В., Гуляев Ю.В. Миллиметровые волны и фотосинтезирующие организмы. М.: Радиотехника, 2003. 175 с.
Поступила в редакцию 12.05.11
THE MANIFESTATION OF SALT TOLERANCE
FOR CYANOBACTERIA OF ARTHROSPIRA (SPIRULINA) GENUS -
SPIRULINA PLATENSIS AND SPIRULINA MAXIMA
A.Kh. Tambiev, S.G. Vasilieva, A.A. Lukyanov
The salt tolerance of two representatives of genus Spirulina (Arthrospira) Spirulina platensis and Spirulina maxima has been investigated. They both are the widespread objects of photobio-technology and it has been shown that the content of 5—15% sea-water in medium has not caused the decreasing of biomass more than by 15—20% as compared with control. The further decreasing of biomass was proportionate to sea-water content in medium. The investigation of reactivity of native (intravital) exometabolites secreted into cultural medium has showed that the sea-water content influenced the oxidative reactivity of exometabolites. The hour's rhythmics of oxidative reactivity alteration has showed the distinguishes between examined cultures.
Key words: cyanobacteria, native exometabolites, reactivity, hour's rhythmics, chemical model.
Сведения об авторах
Тамбиев Александр Хапачевич — докт. биол. наук, проф., гл. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-25-87; e-mail: tambiev@mail.ru
Лукьянов Александр Андреевич — канд. биол. наук, науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-25-87; e-mail: loockart@mail.ru
Васильева Светлана Геннадьевна — аспирантка кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-25-87; e-mail: vankat2009@mail.ru
