CC BY
76
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ И ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ / PHYSICO-CHEMICAL AND GENERAL BIOLOGY Оригинальная статья / Original article УДК 57.083
DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-4-68-73
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ СОХРАНЕНИЯ ЦИАНОБАКТЕРИИ Эр1ги11па виЬва1ва
ПОСЛЕ КРИОКОНСЕРВАЦИИ ПРИ -80 оС В ПРИСУТСТВИИ ГЛЮКОЗЫ
© Д.И. Петрухина, И.Н. Лыков
Калужский государственный университет им. К.Э. Циолковского
Данная работа посвящена изучению возможности криосохранения цианобактерий при температуре -80 оС в присутствии глюкозы в качестве криопротектора. Представлены данные о степени влияния концентрации криопротектора (глюкозы) на скорость роста цианобактерий после криохране-ния при температуре -80 оС. Определена максимальная скорость прироста биомассы в питательной среде после размораживания проб и после переноса сохраненного материала в колбы для выращивания. Рассмотрены возможные изменения характеристик культивирования оттаявших агломератов Spirulina subsalsa в зависимости от времени криохранения в присутствии глюкозы в концентрации 10%. Результаты исследования показывают, что глюкоза является эффективным криопротектором для культуры ЭрШта зиЬза!за.
Ключевые слова: цианобактерии, криоконсервация, криопротектор, удельная скорость роста.
Формат цитирования: Петрухина Д.И., Лыков И.Н. Исследование эффективности сохранения цианобактерии ЭрШ'та виЬва^а после криоконсервации при -80 оС в присутствии глюкозы // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2016. Т. 6, N 4. С. 68-73. DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-4-68-73
EFFECTIVENESS OF CONSERVATION OF CYANOBACTERIA Spirulina subsalsa BY GLUCOSE AFTER CRYOPRESERVATION AT -80 °C
D.I. Petrukhina, I.N. Lykov
Kaluga Slate University named after K.E. Tsiolkovski
The aim of the research was to assess the possibility of cryopreservation of microalgae at -80 oC in the presence of glucose as a cryoprotectant. The data concerning the influence of the cryoprotectant (glucose) concentration on the growth rate of cyanobacteria after cryo-storage at a temperature of -80 oC are given. The maximum growth rate of biomass in the nutrient medium after samples thawing and after the transfer of the preserved material into flasks for cultivation was determined. The possible changes of culturing characteristics of Spirulina subsalsa thawed agglomerates were considered in the presence of 10% glucose. The results shows that glucose is an effective cryoprotectant for the culture of Spirulina subsalsa. Keywords: cyanobacteria, cryopreservation, cryoprotectant, specific growth rate
For citation: Petrukhina D.I., Lykov I.N. Effectiveness of conservation of cyanobacteria Spirulina subsalsa by glucose after cryopreservation at -80 °C. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2016, vol. 6, no 4, pp. 68-73. DOI: 0.21285/2227-2925-20166-4-68-73 (in Russian)
ВВЕДЕНИЕ
Цианобактерии родов ЭрШ'та характеризуются уникальным сочетанием биологически активных соединений, таких как провитамин А, витамины группы В (В1, B2, B6, B12), С, Е, полиненасыщенные жирные кислоты (с высоким содержанием гамма-линоленовой кислоты), каро-
тиноиды, хлорофилл и фикоцианин, низкомолекулярные протеины, полисахариды, макро- и микроэлементы (фосфор, кальций, калий, магний, цинк, железо, марганец), а так же минеральные соли, аминокислоты, в том числе незаменимые. Благодаря относительной простоте и безопасности культивирования цианобакте-
рии родов Spirulina и Arthrospira стали наиболее востребованными микроорганизмами для выращивания в промышленных масштабах во многих странах мира.
В биотехнологической практике очень часто возникает необходимость длительного сохранения коллекций культур цианобактерий. Традиционные способы сохранения культур цианобактерий с использованием процедуры последовательного пересева субкультур не способны обеспечить долговременное сохранение этих штаммов ввиду трудоемкости, высоких рисков загрязнения по причине человеческого фактора, генетического дрейва и мутаций, что приводит к потере исследовательских видов. В данной ситуации вполне реальным представляется долговременное хранение цианобактерий путем низкотемпературного консервирования, что позволяет обойти проблемы, связанные с содержанием коллекции культур. Несомненным преимуществом низкотемпературного консервирования является использование температур существенно выше температуры жидкого азота, позволяющих применять более простое и дешевое оборудование.
Различные методы криосохранения предполагают использование проникающих и непроникающих криопротекторов. В качестве проникающих протекторов чаще применяют низкомолекулярные соединения (диметилформамид, пропандиол, глицерин, этиленгликоль, метанол, диметилсульфоксид), которые проникают внутрь клетки. Из различных непроникающих внутрь клеток веществ в основном используют сахара.
Известны работы по криоконсервации Брг-иНпа platensis с использованием в качестве криопротектора аминокислот (0,1-5,0%) и альбумина яичного белка (2-4%) [1], глицерина (5 и 10%) [2, 3], гуммиарабика (2-10%) [1], телячьей сыворотки (10%) [3], гидролизата казеина (24%), желатина (2-10%) [1]. Имеются данные о том, что использование в качестве криопротек-торов глицерина (30 и 50%) [4], сахарозы (0,52,0%) и лактозы (1-10%) [1] не способствовали успешной криоконсервации.
Применение глюкозы в качестве криопротектора для криоконсервации цианобактерий изучено недостаточно полно. Глюкоза в процессе криоконсервации в основном используется для дегидратации инкапсулированных меристем [5] или для лиофилизации и сублимационной сушки [6, 7]. Поэтому целью настоящего исследования является изучение возможности криосохранения цианобактерий при температуре -80 оС в присутствии глюкозы в качестве криопротектора.
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
В настоящем эксперименте использовали штамм БрГиИпа subsalsa PCC 9445 из коллек-
ции культур университета Пастера (Франция). Данный штамм выращивался нами в виде агломератов на стандартной питательной среде Заррука с рН 9,6 [8] и в этом же состоянии использовался в экспериментах.
Выращивание новой культуры осуществляли методом последовательного пересева субкультур, для этого в среду в качестве иноку-лята вносили агломерат культуры размером 12 см, который отделяли от предыдущей культуры с помощью пинцета в стерильных условиях. Агломераты представляли собою крупные скопления нитей спирулины, которые образовывали своеобразные водорослевые маты. Размер агломератов зависел от размера инокулята и времени выращивания.
С целью получения нужного количества биомассы культивирование проводили в авто-клавированных конических стеклянных колбах Эрленмейера с широким горлышком и номинальным объемом 50-100 мл. Питательную среду Заррука стерилизовали фильтрованием через фильтр из ацетата целлюлозы (диаметр пор 0,45 мкм) и в количестве 25-50 мл добавляли в колбы Эрленмейера.
Культуру выращивали в инкубаторе Minitron при температуре 30 °C при постоянном перемешивании с помощью встроенного орбитального шейкера диаметром качания 25 мм. Частота вращения составляла 110 об/мин. Освещение обеспечивали шестью люминесцентными лампами Grolux (15W), которые располагались над колбами на высоте 40 см, обеспечивая среднюю интенсивность света на поверхности клеточной суспензии 21 мкмоль/(м2с). Выращивание культуры осуществляли с 16-часовым фотоциклом. Цикл культивирования составлял 25 дней до замораживания.
После 25 дней выращивания питательную среду удаляли, а клеточные агломераты дважды промывали стерильной дистиллированной водой. Промытые агломераты пинцетом помещали в полипропиленовые криофлаконы с завинчивающейся крышкой объемом 2 мл. В эти же крио-флаконы в качестве криопротектора добавляли одномоментно 1,8 мл стерильного раствора глюкозы комнатной температуры. Агломераты выдерживали в растворе криопротектора в темноте в течение 20 мин при периодическом перемешивании, после чего помещали в контейнер, предварительно охлажденный до 4 оС. В эксперименте использовали контейнер для замораживания пробирок Mr. Frosty™ предназначенный для медленного и равномерного (-1 оС/мин) замораживания в криопробирках объемом 1-5 мл. Данный контейнер обеспечивал воспроизводимую скорость охлаждения -1 оС в минуту и использовался со 100%-м изопропиловым спиртом.
Контейнер помещали в морозильную камеру фирмы BINDER (модель ULTRA.GUARD™),
температура в которой была -80 оС на протяжении всего периода исследования. Через 1,5 ч пробы перемещали из контейнера в пластиковые боксы и хранили при -80 оС до последующего анализа в течение 7 сут, 2-х или 6-ти месяцев. Каждая проба имела свою индивидуальную маркировку. Все пробы замораживались минимум в трех повторностях.
После хранения пробы извлекали из камеры для размораживания и последующего выращивания. Для размораживания пробы с крио-консервированными образцами выдерживали в течение 2-3 мин в водяной бане при температуре 37 оС. После размораживания удаляли су-пернатант и агломераты дважды промывали свежей питательной средой Заррука. Промытые агломераты инокулировали в стерильную колбу Эрленмейера с 5 мл свежей стандартной среды Заррука.
Размороженные агломераты для предотвращения фотоокисления культивировали при комнатной температуре в течение первых 40 минут в темноте, после чего в колбы были добавлены еще по 5 мл среды Заррука. Последующее культивирование проходило в течение 2 ч при освещении 10-12 мкмоль фотонов/(м2с). Затем агломераты выращивали в инкубаторе Minitron как исходные культуры.
Контрольные образцы были инокулирова-ны агломератами культур той же исходной сырой массы, что и исследуемые. Их выращивали параллельно с криокультурами. Исходный вес составлял 0,6 г сырой биомассы на пробу. Для характеристики роста определяли сухую и сырую массу, для чего агломераты дважды промывали от культуральной среды дистиллированной водой на заранее взвешенных фильтрах из ацетата целлюлозы (диаметр пор 6,8 мкм) и взвешивали. Затем фильтры с образцами культур высушивали до постоянного веса в сушильном шкафу при температуре 103 оС. В эксперименте для проведения процедуры взвешивания использовали аналитические лабораторные весы фирмы KERN (Германия, тип ABJ 220-4M).
Достоверность различий выборочных средних оценивали с помощью ^критерия Стьюдента [9]. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при р <0,05. Данные представлены в виде М ± м.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Агломераты цианобактерии БргиНпа виЬва!-ва РСС 9445 восстанавливали после 7-суточ-ного криохранения при температуре -80 оС. В качестве непроникающего криопротектора использовали стерильный раствор глюкозы в различной концентрации. Восстановленную культуру БргиНпа виЬвава анализировали по нескольким параметрам по сравнению с исходной культурой (табл. 1). Для сравнения эффективности роста восстановленной культуру БргиНпа виЬва!-ва и контрольных культур определяли удельную скорость роста (м (сутки1)) по формуле
Д Ьг-тг-
где X и Х0 - величина биомассы, в конце и начале ростового цикла, гр.; At - длительность ростового цикла, сут.
Результаты исследования показали эффективность криосохранения Эр'гиНпа виЬвава РСС 9445 в присутствии не проникающего крио-протектора - глюкозы. Причем, максимальная скорость прироста сутки-1) и величина прироста биомассы наблюдались при использовании 10%-ой глюкозы. Это согласуется с данными других авторов о том, что концентрация крио-протекторов от 5 до 15% является наиболее оптимальной для цианобактерий [3, 9, 10].
После 10 сут культивирования максимальная концентрация биомассы для восстановленной культуры Эр'гиНпа виЬвава достигала 1,5 ± 0,15 г. Средняя удельная скорость прироста составляла 0,036 ± 0,007 сутки-1, а максимальная скорость прироста была достигнута на 17 день культивирования против 13 дней у исходной культуры.
Таблица 1
Характеристика роста восстановленной культуры Зр1ги!1па зиЬва^а при стандартном культивировании в колбах в течение 25 сут*
Вариант эксперимента Величина биомассы (инокулята), в начале ростового цикла, гр. Величина биомассы, в конце ростового цикла, г Удельная скорость роста j, сутки-1 Сутки, на которые достигается максимальная удельная скорость роста
Концентрация протектора (глюкоза), % 5 10 15 20 0,6 ± 0,12 0,59 ± 0,11 0,6 ± 0,15 0,58 ± 0,11 0,85 ± 0,09 1,5 ± 0,15 1,0 ± 017 0,5 ± 0,08 0,015 ± 0,0006 0,036 ± 0,007 0,019 ± 0,005 0,0016 ± 0,0002 20 17 20 25
Исходная культура (контрольная группа) 0,6 ± 0,12 1,7 ± 0,08 0,041 ± 0,005 13
Примечание: * - (At=25 суток).
Таблица 1
Особенности роста* культуры Spirulina subsalsa после длительных сроков хранения
Культура, размороженная после Удаление криопротектора после размораживания Величина биомассы (инокулята), в начале Величина биомассы, в конце ростового Удельная скорость роста |j, сутки-1 Сутки, на которые достигается максимальная удельная
ростового цикла, г цикла, г скорость роста
2-х месяцев Да 0,6 ± 0,07 1,46 ± 0,05 0,035 ± 0,007 10
криохранения Нет 0,6 ± 0,08 1,36 ± 0,11 0,032 ± 0,008 18
6-ти месяцев Да 0,6 ± 0,12 0,8 ± 0,08 0,011 ± 0,002 16
криохранения Нет 0,55 ± 0,2 0,69 ± 0,1 0,005 ± 0,001 25
Исходная культура (контрольная группа) 0,6 ± 0,11 1,7 ± 0,08 0,041 ± 0,005 13
Примечание: * Культуры выращивали в колбах при стандартных условиях в течение 25 сут ^=25 сут).
Для оценки возможных изменений ростовых характеристик размороженных агломератов Spirulina subsalsa при увеличении сроков криохра-нения выполнена их рекультивация после 2 и 6 мес. криохранения в присутствии глюкозы в концентрации 10%. По аналогии с предыдущим экспериментом культивирование проводили в колбах на качалке. Полученные в ходе исследования результаты приведены в табл. 2.
Из представленных данных следует, что ростовые характеристики восстановленной культуры Spirulina subsalsa после 2 месяцев криохра-нения незначительно отличаются от характеристик исходной культуры. Удельная скорость прироста биомассы составила от 0,032 ± 0,008 до 0,035 ± 0,007 сутки-1, а конечный вес биомассы составил 1,46 ± 0,05. Это несколько ниже веса биомассы исходной культуры (1,7 ± 0,08 г.). В опытах без удаления супернатанта и криопро-тектора глюкоза стимулировала рост культуры Spirulina subsalsa. В этом случае максимальная скорость прироста биомассы достигалась на 10 день культивирования против 13 дней у исходной культуры.
Однако с увеличением срока криохранения
до 6 месяцев удельная скорость роста биомассы и максимальное накопление биомассы снижались, и составляли от 0,005 ± 0,001 до 0,011 ± 0,002 и от 0,69 ± 0,1 до 0,8 ± 0,08 соответственно. Это может быть связано с повреждением внутренних структур в момент перехода жидкости в лед (в фазу кристаллизации). Однако полученные результаты показывают, что замораживание S. subsalsa до -80 оС приемлемо для среднесрочного хранения.
Для оценки морфологии культуры после процедуры замораживания-оттаивания делали фотоснимки сразу после размораживания (фотоаппарат Canon PowerShot G7X, изображение увеличено в 4 раза). Морфология интактной культуры была сохранена при криохранении в присутствии 10%-ой глюкозы. При криосохране-нии в присутствии 5%-ой глюкозы наблюдаются некоторые изменения морфологии агломерата в результате повреждения части клеток цианобак-терий в ходе процедуры замораживания-оттаивания. Таким образом, морфология интактной культуры и культуры после замораживания-оттаивания наиболее идентичны при криохране-нии в присутствии 10%-ой глюкозы (рисунок).
а
Морфологии агломерата, после процедуры замораживания-оттаивания: а - в присутствии 10%-ой глюкозы; б - в присутствии 5%-ой глюкозы
ВЫВОДЫ
1. Глюкоза является эффективным не проникающим криопротектором для культуры Spir-ulina subsalsa.
2. Оптимальной для криоконсервации при температуре -80 оС является концентрация глюкозы 10%.
3. Восстановленная после хранения в течении 2-х мес. культура Spirulina subsalsa сохраняет ростовые характеристики на уровне культу-
Благодарность: Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, стипендии для аспирантов Erasmus Mundus Action 2 и стипендии для аспирантов от Технического университета Дрездена для раннего развития научной карьеры у женщин.
1. Takano M., Sado J-I., Ogawa T., Terui G. Freezing and freeze-drying of Spirulina platensis // Cryobiology. 1973. Vol. 10. P. 440-444.
2. Day J.G. Cryopreservation of microalgae and cyanobacteria // Methods Mol Biol. 2007. Vol. 368. P. 141-151. DOI: 10.1007/978-1 -59745-362-2_10.
3. Motham M., Peerapornpisal Y., Tongsriri S., Pumas C., Vacharapiyasophon P. High Subzero Temperature Preservation of Spirulina platensis (Arthrospira fusiformis) and Its Ultrastucture // Chiang Mai Journal of Science. 2012. Vol. 39, N 4. P. 554-561.
4. Mühling M. Characterization of Arthrospira (Spirulina) strains [dissertation]. Durham E-The-ses Online edition. 2000. Available at http://ethe-ses.dur.ac.uk/1198 (accesed 10.02.2015)
5. Dumet D., Block W., Worland R., Reed B.M., Benson E.E. Profiling cryopreservation protocols for Ribes ciliatum using differential scanning calorimetry // Cryo Letters. 2000. Vol. 21, N 6. P. 367-378.
6. Corbett L.L., Parker D.L. Viability of lyophi-lized cyanobacteria (blue-green algae) // Applied and Environmental Microbiology. 1976. Vol. 32, N 6. P. 777-780.
ры, замороженной в течении 10 сут.
4. Длительное криохранение (более 2-х мес.) несколько снижает ростовые характеристики восстановленной культуры. Однако криосо-храненные культуры Spirulina subsalsa пригодны для дальнейшего выращивания.
5. Морфология интактной культуры и культуры после замораживания-оттаивания наиболее идентичны при криохранении в присутствии 10%-ой глюкозы.
Acknowledgement: The work was supported by the Ministry of education and science of the Russian Federation, scholarships for graduate students Erasmus Mundus Action 2 scholarships for graduate students from the Technical University of Dresden for the early development of scientific careers among women.
КИЙ СПИСОК
7. Kordowska-Wiater M., Wasko A., Polak-Berecka M., Kubik-Komar A., Targonski Z.. Spirulina enhances the viability of Lactobacillus rhamnosus E/N after freeze-drying in a protective medium of sucrose and lactulose // Letters in Applied Microbiology. 2011. Vol. 53, N 1. P. 79-83. DOI: 10.1111/j.1472-765X. 2011.03068.x.
8. Madkour F.F., Kamil A.E.-W., Nasr H.S. Production and nutritive value of Spirulina platensis in reduced cost media // The Egyptian Journal of Aquatic Research. 2012. Vol. 38, N 1. P. 51-57. DOI: 10.1016/j.ejar.2012.09.003.
9. Iwamoto K., Fukuyo S., Okuda M., Kobaya-shi M., Shiraiwa Y. Cryopreservation of the Chlorophyll d-Containing Cyanobacterium Acaryochloris marina // Procedia Environmental Sciences. 2012. Vol. 15. P. 118-125. DOI: 10.1016/j.proenv.2012.05.016.
10. Tanniou A., Turpin V., Lebeau T. Comparison of cryopreservation methods for the long term storage of the marine diatom Haslea ostrearia (simonsen) // Cryobiology. 2012. Vol. 65, N 1. P. 45-50. DOI: 10.1016/j.cryobiol.2012.03.011.
1. Takano M., Sado J.I., Ogawa T., Terui G. Freezing and Freeze-Drying of Spirulina-Platensis. Cryobiology. 1973, vol. 10, pp. 440-444.
2. Day J.G. Cryopreservation of microalgae and cyanobacteria. Methods Mol. Biol. 2007, no. 368, pp. 141-151.
3. Motham M., Peerapornpisal Y., Tongsriri S., Pumas C., Vacharapiyasophon P. High Subzero Temperature Preservation of Spirulina platensis (Arthrospira fusiformis) and Its Ultrastucture. Chiang Mai Journal of Science. 2012, vol. 39, pp. 554-561.
4. Muhling M. Characterization of Arthrospira (Spirulina) strains. Durham University, Doctoral thesis, 2000.
5. Dumet D., Block W., Worland R., Reed B.M., Benson E.E. Profiling cryopreservation protocols for
Ribes ciliatum using differential scanning calorimetry. Cryo Letters. 2000, vol. 21, pp. 367-378.
6. Corbett L.L., Parker D.L. Viability of lyophi-lized cyanobacteria (blue-green algae). Appl. Environ. Microbiol. 1976, vol. 32, pp. 777-780.
7. Kordowska-Wiater M., Wasko A., Polak-Berecka M., Kubik-Komar A., Targonski Z. Spirulina enhances the viability of Lactobacillus rhamnosus E/N after freeze-drying in a protective medium of sucrose and lactulose. Letters in Applied Microbiology. 2011, vol. 53, pp. 79-83. DOI: 10.1111/j.1472-765X. 2011.03068.x.
8. Madkour F.F., Kamil A.E.-W., Nasr H.S. Production and nutritive value of Spirulina platensis in reduced cost media // The Egyptian Journal of Aquatic Research. 2012. Vol. 38, N 1. P. 51-57.
DOI: 10.1016/j.ejar.2012.09.003.
9. Iwamoto K., Fukuyo S., Okuda M., Kobaya-shi M., Shiraiwa Y. Cryopreservation of the Chlorophyll d-Containing Cyanobacterium Acaryochloris Marina. Procedia Environmental Sciences. 2012, vol.
15, pp. 118-125. DOI: 10.1016/j.proenv.2012.05.016.
10. Tanniou A., Turpin V., Lebeau T. Comparison of cryopreservation methods for the long term storage of the marine diatom Haslea ostrearia (simonsen). Cryobiology. 2012, vol. 65, pp. 45-50.
Критерии авторства
Петрухина Д.И., Лыков И.Н. выполнили экспериментальную работу, на основании полученных результатов провели обобщение и написали рукопись. Петрухина Д.И., Лыков И.Н. имеют на статью авторские права и несут равную ответственность за плагиат.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации
Дарья И. Петрухина
Калужский государственный университет им. К.Э. Циолковского
248023, Россия, г. Калуга, ул. Степана Разина, д. 26 Аспирант
petruhina.d@gmail.com
Contribution
Petrukhina D.I., Lykov I.N. carried out the experimental work, on the basis of the results summarized the material and wrote the manuscript. Petrukhina D.I., Lykov I.N. have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.
AUTHORS' INDEX Affiliations
Daria I. Petrukhina
Kaluga Slate University named after K.E. Tsiolkovski 26, Stepan Razin St., Kaluga, 248023, Russia Postgraduate student petruhina.d@gmail.com
Игорь Н. Лыков
Калужский государственный университет им. К.Э. Циолковского
248023, Россия, г. Калуга, ул. Степана Разина, д. 26 Д.б.н., профессор, научный руководитель, зав. кафедрой linprof47@yandex.ru
Поступила 03.08.2016
Igor N. Lykov
Kaluga State University named after K.E. Tsiolkovsky 26, Stepan Razin St., Kaluga, 248023, Russia Doctor of Biology, Professor, Scientific supervisor, Head of the Department linprof47@yandex.ru
Received 03.08.2016
