CC BY
19
УДК 619:616.98:578
Власенко В.В., Лисенко О.П., Власенко I. Г., Михайлевич Е.А. ©
Втницъкий нацюнальний аграрнийутеерситет Втницъкий торговелъно - економгчний тститут КНТЕУ Научно-исследовательский институт экспериментальной ветеренарии имени
Вишелесского, г. Минск, Беларусь
ПЕРСПЕКТИВИ ВИКОРИСТАННЯ КОМП'ЮТЕРНИХ ТЕХНОЛОГ1Й ДЛЯ ОЦ1НКИ БЮЛ0Г1ЧН01 БЕЗПЕКИ МОЛОКА КОР1В, 1НФ1КОВАНИХ ЗБУДНИКОМ ТУБЕРКУЛЬОЗУ
В работе исследуется современное состояние и перспективы улучшения качества и безопасности молока в Украине. Предложены новые подходы к усовершенствованию качества и безопасности молока с использованием компьютерных технологий и новых питательных сред.
Вщповщно до сучасних м1жнародних вимог, щодо безпечносп молока лише яюсний контроль е вже недостатшм тому, що вш не може гарантувати повну безпеку. Особливо критична ситуащя склалася з оцшкою якост1 молока вщ тубшфжованих тварин на територ1ях забруднених радюнуклщами. Для виявлення тубшфжованих кор1в використовують туберкулш для ссавщв.
Як в1домо, туберкул1н е алергеном, який виготовляють з високов1рулентного (патогенного) штаму збудника туберкульозу. За повщомленням фах1вц1в ветеринарно! медицини: Ю. Колоса (канд. вет. наук), О. Якубчак та В. Хоменко (доктори наук, професори), М. Зел1нського (головний спец1ал1ст Держдепартаменту вет. медицини), а також В. Титаренка (заступник директора Держптаховетцентр м. Ки!в) та шших, цитуемо: «в даному препарат! можуть бути ф1льтрувальн1 форми м1кобактер1й».
Природно, що, нейтрал1зувавши консервант в туберкулш1 та пров1вши пос1ви на спещальш високочутлив1 середовища — ВКГ з1 стимулятором росту чи ¿нше специф1чне I високочутливе — можна досягти реверс11 ф1льтрувальних форм у вегетативну форму м1кобактер1й» [1]. Отже, як повщомляють автори [1], при туберкулшод1агностищ тварин, в орган1зм вводять фшьтруюч1 форми в1рулентного збудника туберкульозу, а вщтак цей збудник розвиваеться I з орган1зму кор1в вид1ляеться в значш к1лькост1 з молоком кор1в. 1снуюч1 бактер1олог1чн1 методи визначення збудника ще! небезпечно! хвороби в продуктах харчування досить складн1 та тривалг Це заважае оперативному визначенню тубшфжованого сирого молока. В1домо, що для туберкульозу та багатьох антропозоонозних захворювань ¿снуе 61олог1чний ланцюг "тварина — молоко — людина", тобто в раз1 недостатнього контролю продукта харчування тваринного походження, уражен1 збудником туберкульозу, можуть передавати збудника (шфекцш) людям [2]. Ситуац1я ¿з здоров'ям населения Укра!ни набувае загрозливого стану, загострилась I еп1дем1олог1чна ситуац1я з
© Власенко В.В., Лисенко О.П., Власенко I. Г., Михайлевич Э.А., 2013
289
туберкульозу. Щороку в Укра1т виявляеться 30-40 тис. хворих на туберкульоз
[3].
Вступ Украши до СОТ забов'язуе нас виконувати Постанову (GC) № 178/ 2002. Д1я постанови поширюеться на bcí краши GC. Мета постанови (£С) № 178/ 2002 - створення основ для високого р1вня захисту здоров'я людини та споживчих штереав у галуз1 продукта харчування, беручи до уваги р1зноматття асортименту харчових продукта. Це стало передумовою для створення мщно! науково! основи для розтзнавання в сирому молощ стадшного розвитку збудника туберкульозу теля проведения туберкул1тзаци у дшних Kopie.
Метою нашо! роботи було пщтвердити чи виключити наявшеть фшьтруючих форм мшобактерш в туберкулм ППД для ссавщв i можливкть шфшування ним продукта харчування та розробити експрес-методу оцшки безпеки молока з використанням комп'ютерно! системи для виявлення збудника туберкульозу.
Матер1ал та методи. Для визначення ефективност1 комп'ютерно! оцшки бюлопчно! безпеки молочно! сировини використовували культури мжобактерш: М. tuberculosis Н37 Rv (з колекц1! ГИСК im. Л.А.Тарасевича), М. bovis 8, М. bovis BCG, яю в1дновили з люфшзованого стану спочатку на середовищ1 Левенштейна-Иенсена, пот!м - на середовищ1 Павловского.
Гомогешзоваш культури суспензували в стимулятор! росту до концентраци 1 мг/мл, пот!м готували розведення (1 : 10) i ставили в термостат при температур! 37-38°С на 48 год, з наступним nociBOM на поживне середовище «Влакон».
Як бюлопчну модель використовували морськ1 свинки, яю розд1лили на дв1 групи. Перша група слугувала контролем, а друга - дослщом. В po6oTÍ використовували туберкулш ППД для ссавц1в Сумсько! б1офабрики сер1я 45 та 80, який вводили морським свинкам друго! (досл1дно! групи), що пройшли карантин, внутр1брюшино в к1лькост1 3 мл на стерильному мшеральному масл1 i через мкяць цим тваринам проводили евтаназш. Для виявлення ¿нф1кованост1 пщдослщних тварин, в1дбирали печ1нку, селез1нку та легеш морських свинок i виЫвали на поживн1 середовища. Суспенз1ю внутршшх орган1в обробляли 10% розчином трьохзамщеного фосфорнокислого натр1ю. Для виявлення фшьтруючих форм (артроспор) збудника туберкульозу використовували бактер1альний ф1льтр Millpore з д1аметром 0,22 м1крона. До отриманого фшьтрату додавали стимулятор росту ВКГ, теля чого ¿нкуб1рували в термостат! 24 год при температур! 37°С. Культуральт i бактер1олог1чн1 досл1дження проводили згщно з Наказом МОЗ Укра!ни № 45-2002 року [4].
Проводили в1дб1р молока вщ Kopie, що реагували позитивно на туберкул1н за загальноприйнятою методикою. В проб1рки з молоком в кшькост1 10 мл додавали 2-3 крапл1 5% розчину фенолу з метою ¿нг1бування росту супутньо! мжрофлори. При досл1дженн1 молока використовували збагачення препаратом ВКБ. Запропонований метод збагачення препаратом ВКБ (Власенко В., Конопко I., Березовський I., 2003) дае можлив1сть концентрувати збудник
290
туберкульозу. Метод полягае в тому, що до молока в кшькост1 10 мл додають таку ж кшькють препарату ВКБ I пщ1гр1вають до 50-60°С. Шсля охолодження вмют виливають в центрифужш проб1рки, центрифугують при 1500 об/хв протягом 25-30 хвилин, надосадну рщину зливають, а з осаду роблять бактерюлопчш пос1ви та тонк1 мазки, яю висушують, фжсують та фарбують за методом Цшь-Ншьсена. При бактерюлопчному дослщженш до осаду додавали стимулятор росту в сшввщношенш 1:1 I ставили в термостат при температур! 37-38°С на 48 год, з наступним пошвом на поживне середовище «Влакон». Мжроскопш мазюв проводили за загальноприйнятою методикою за допомогою ¿мерсшно! системи з використанням комп'ютерних технологш мжроскопування, яка запатентована нами в Укра!ш.
Результати дослщжень. Встановлено, що шокулящя матер1алу (туберкул1ну), який мютить фшьтруюч1 форми МБТ (вщсутшсть росту на традицшних поживних середовищах I ркт на середовищ1 ВКГ та Влакон), в макрооргашзм1 морських свинок за короткий час (один мюяць теля заражения) розвиток патолопчних характерних змш для туберкульозу спостер1галось лише у 8% тварин, а при бактерюлопчному дослщженш у вс1х тварин, яким вводили туберкулш виявляеться збудник туберкульозу, тод1 як на пос1вах контрольно! групи тварин ркт був вщеутнш, а патолопчш змши не спостер1гались. Результати визначення ефективност1 комп'ютерно! оцшки бюлопчно! безпеки молочно! сировини наведен! в табл. 1.
Таблиця 1
. >езультати пор1вняльних метод1в дослщжень_
Назва досладного матер1алу КШЬШСТ ь проб Результаты MiKpocKonii Бактерюлопчш дослщження (picT)
Светлова мжроскошя Комп'ютерна Середовище Левенштейна -Иенсена Середовище «Влакон»
Факт % Факт % Факт % Факт %
М. tuberculosis Н37 R v 5 5 100 5 100 5 100 5 100
М. bovis 8 10 10 100 10 100 10 100 10 100
М. bovis BCG 10 10 100 10 100 10 100 10 100
Молоко шфжованих KopiB збудником туберкульозу 10 1 10 10 100 10 100
Як видно з табл. 1, результати мжроскотчних \ бактерюлопчних дослщжень тест-культур з середовища Павловського р1знищ не мали, а при дослщженш мазюв молока св1тловим мжроскопом виявилось позитивних мазюв лише 10%, тод1 як при комп'ютерш м1кроскот!-100%. Культури, отримаш на середовищах Влакон \ Левенштейна - Иенсена за мжроскотчною картиною були щентичш. Шсля пос1ву дослщжуваних проб через 2-4 доби на дослщжуваному середовищ1 з'являлися кругл1 нашвпрозор1 др1бш колони Ыро-бших кольор1в, шод1 - з жовтуватим вщтшком, що легко зшмаються ¿з середовища при приготуванш мазюв. У процес1 перегляду мазюв з колонш, що
291
виросли на 2-4 добу на дослщжуваному середовищ!, виявлеш пол1морфш форми: др!бш коки та палички р1зно! величини, прям! й вигнут!, ¿з зернистютю (при фарбуванш по Цшь - Ншьсену - вщ рожевого до червоно-фюлетових кольор1в). Тобто ркт культур з молока кор1в шфжованих збудником туберкульозу на середовищ! «Влакон» був в 100% дослщжуваних проб, а на середовищ! Левенштейна -Иенсена - вщсутнш. Отже, можна думати, що малах1товий зелений який входить в склад середовища Левенштейна -Иенсена шпбуе рют не лише супутньо! мжрофлори, але I збудника туберкульозу, який мае понижену ферментативну актившсть. При перегляд! мазюв культур, вирощених на дослщжуваному середовищ! протягом 1,5 мю. I пофарбованих за Цшь - Ншьсеном, виявлеш розсипи коюв, ди - I тетракоюв, у великш кшькост! -палички р1зно! величини ¿з зернистктю, а також шш1 форми червоних кольор1в.
Таким чином, при культивуванш мжобактерш на дослщжуваному середовищ! пщтверджена !хня здатшсть трансформуватися в класичш палички. При комп'ютернш мшроскопп мазюв з молока кор1в, що реагували позитивно на туберкулш, спостер1гали кл1тини рожево-червоного кольору: коки, др!бш й велию, палички коротю1 довп ¿з зернами, прям! на вигнуту.
Для запоб1гання хибних результата при проведенш бактерюскопп виникае необхщшсть оцшити наявшеть живих мжобактерш в мазку, так як вони не фарбуються за методом Цшь-Ншьсена, а тому дуже важливо визначити життездатшеть мжобактерш. 3 щею метою приготовлений мазок молока вщ вищезгаданих кор1в фксували над полум'ям, фарбували 1,0% розчином малах1тового зеленого (рН 4,1) протягом 10 хвилин, пщ!гр!ваючи мазок до появи пари. Шсля цього фарбу зливали, мазок промивали водою 1 фарбували карболовим фуксином (в розведенш 1:5) протягом 5 хвилин. Жив! мжобактери фарбуються в зелений кол1р, а нежиттездатш — в червоний.
Для пщтвердження того, що з молока видшена культура збудника туберкульозу була проведена бюлопчна проба на морських свинках. У процеа проведено! бюлопчно! проби виявлено здатшсть отриманих культур з молока визивати характерш туберкульозш патологоанатом!чш змши у лабораторних тварин та видшити з них збудника туберкульозу на середовищ! Левенштейна -Иенсена без малах1тового зеленого. Таким чином, пщтверджена гшотеза, що малах1товий зелений, шпбуе не лише р1ст супутньо! м1крофлори, а I збудника туберкульозу, який мае понижену ферментативну актившсть, проте за сприятливих умов здатний викликати захворювання.
У результат! проведених досл!джень встановлено, що вш досл!джуван! мазки молока в!д кор!в, як! реагували на введений туберкулш, позитивно мали в 100 полях зору м!кроскопа в!д 7 до 43 кл!тин збудника туберкульозу. Можна думати, що при фжеаци над полум'ям спиртаки мазк!в молока мжобактери не гинуть остаточно, а тому погано фарбуються за методом Цшь - Ншьсена.
Висновки.
1. Основою гарантування безпеки молочно! продукц!! в Укра!ш е система мон!торингу саштарно небезпечних збудник!в та залишкових юлькостей токсичних речовин у молочних продуктах харчування.
292
2. Запропонований метод збагачення мжобактерш в сирому молощ препаратом ВКБ та результата комп'ютерно! MiKpocKoni! мазюв молока можуть бути використаш як експрес-метод оцшки бюлопчно! безпеки молочних продукт1в.
3.Середовище "Влакон" придатне для контролю якост1 молока та молокопродукпв, тому що дае можливють виявляти пол1морфш форми збудника туберкульозу (фуксинофшьш коковидш утвори, зернист1 палички), яю викликають специф1чне туберкульозне ураження внутршшх оргашв морських свинок.
4. Культури музейного штаму М. bovis 8, М. bovis BCG та з молока кор1в, шфжованих туберкульозом, отримаш на середовищах Влакон i Левенштейна - Иенсена, е щентичш за мжроскотчною картиною.
5. Впровадження у практику комп'ютерно! мжроскопи та поживного середовища "Влакон" суттево прискорить виявлення мжобактерш туберкульозу значно зменшить витрати на лабораторну д1агностику при контрол1 безпеки харчових продукта.
6. Туберкулш ППД для ссавщв Сумсько! бюфабрики сер1я 45 та 80 мктить живого збудника туберкульозу i п1сля введения в орган1зм вш може визвати характерн1 патолог1чн1 змши лише у 8% випадюв, а при бактерюлопчному досл1дженн1 у Bcix тварин, яким вводили туберкул1н, виявляеться збудник туберкульозу, що е вкрай небезпечним для харчово! сировини.
Л1тература
1. Колос Ю., Стець В., Титаренко В., Зел1нський М., Якубчак О., Хоменко В. До питания д1агностики туберкульозу в тварин// Ветеринарна медицина Укра!ни - 2006- №11-С. 10-12.
2. Власенко В.В. Туберкульоз в фокусе проблем современности. -Винница: Наука. - 1998.-223с.
3. Власенко В.В., Власенко И.Г., Василенко С.П., Колодий С.А., Лысенко А.П. Патоморфологические реакции, вызванные артроспорами микобактерий туберкулеза// В1сник морфолог11 -2006- №12(1)-С. 46-48.
4. Методичн1 рекомендац11 «Мгкробюлопчш методи обстеження хворих на туберкульоз».(на п1дстав1 нових даних про особливост1 61олог1чного розвитку M. tuberculosis ). МОЗ. Ки!в - 2001-23с.
Summary
In work the modern state and prospects of improvement of quality and safety of milk in Ukraine is explored. Offered new approaches to the improvement of quality and safety of milk from the use of computer technologies and new nourishing environments.
Рецензент - д.б.н., професор Куртяк Б.М.
293
