CC BY
61
УДК 577.113.7+616-006.6
Перераспределение свободных и связанных с форменными элементами циркулирующих ДНК при доброкачественных и злокачественных заболеваниях предстательной железы
О. Е. Брызгунова1*, С. Н. Тамкович12**, А. В. Черепанова1, С. В. Ярмощук3, В. И. Пермякова1, О. Ю. Аникеева3, П. П. Лактионов1,3
1Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 8
2Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2
3Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. акад.
Е.Н. Мешалкина, 630055, Новосибирск, ул. Речкуновская, 15
*E-mail: s.tamk@niboch.nsc.ru
#Авторы внесли равный вклад.
Поступила в редакцию 03.12.2014
После доработки 19.03.2015
РЕФЕРАТ Показано, что концентрация свободно циркулирующих ДНК (сцДНК) в плазме крови коррелирует с концентрацией ДНК, связанных с поверхностью клеток крови (скпДНК). Обратная корреляция между концентрацией сцДНК и активностью дезоксирибонуклеаз крови при отсутствии корреляции между де-зоксирибонуклеазной активностью крови и концентрацией скпДНК свидетельствует о том, что нуклеазы крови являются важным регулятором концентрации сцДНК, однако они не гидролизуют скпДНК и не влияют на процесс диссоциации ДНК с клеточной поверхности. Возможность перераспределения молекул ДНК между пулами сц- и скпДНК показывает, что для анализа концентраций маркерных ДНК и нормирования данных предпочтительно использовать общий пул циркулирующих ДНК, состоящий из сц- и скпДНК. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА дезоксирибонуклеазная активность, плазма, рак предстательной железы, циркулирующие ДНК.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ сцДНК - свободно циркулирующие ДНК; скпДНК - связанные с поверхностью клеток ДНК; ОЗПЖ - онкологические заболевания предстательной железы; ФБ-ЭДТА - 10 мМ фосфатный буфер (рН 7.5), содержащий 0.15 M NaCl и 5 мМ ЭДТА.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что в крови здоровых доноров и онкологических больных постоянно циркулируют внеклеточные ДНК. Такие циркулирующие ДНК обнаружены как в составе апоптотических телец, нуклеосом, макромолекулярных белковых комплексов плазмы крови [1, 2], так и на поверхности форменных элементов [1]. Ранее мы показали, что при развитии онкологических заболеваний, таких, как рак молочной железы [3, 4] и легкого [5], увеличивается концентрация сцДНК и снижается концентрация скпДНК. Взаимоотношения этих пулов циркулирующих ДНК исследованы не были.
В представленной работе изучено распределение циркулирующих ДНК между плазмой и поверхно-
стью форменных элементов крови при развитии онкологических заболеваний предстательной железы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Образцы крови здоровых мужчин (п = 40) в возрасте 37-71 (47.4 ± 1.3) лет и концентрацией простат-специфического антигена (ПСА), соответствующей клинической норме и не превышающей 2.8 нг/мл, получены из ЦКБ СО РАН. Образцы крови первично обратившихся больных с онкологическими заболеваниями предстательной железы в возрасте 45-84 (70.2 ± 1.4) лет получены из Муниципальной клинической больницы № 1; концентрация ПСА в группе больных с доброкачественной гиперплазией (п = 25) и раком (п = 16) предстательной железы составила
^
1
П
> S ф
2 ^
а с
а j
к Ц
О
П
100 -| 80 -60 -40 -20 -0
— Среднее
Ошибка среднего •k - Отличия значимы (P < 0.01)
□
^_Цъ°
1-1-1-1-
Плазма ФБ-ЭДТА Плазма ФБ-ЭДТА
+ трипсиновый + трипсиновый
элюат элюат
Здоровые доноры
Больные с ОЗПЖ
^ Л
п
с
*
и к
с
О
п
Б
100-, 80 60 40 20 0
96%
83%
17%
4%
/V
/V
Здоровые доноры
Больные с ОЗПЖ
Рис. 1. Относительное содержание сцДНК и скпДНК (А) и скпДНК (Б) в крови здоровых доноров и пациентов с ОЗПЖ
0-31.7 и 0-103.1 нг/мл соответственно (повышена в 36 и 81% случаев). Работу проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан. Стадию заболевания определяли по TNM-классификации.
Сбор и обработку крови, выделение сцДНК из плазмы, скпДНК из ФБ-ЭДТА-элюата и скпДНК из трип-синового элюата с поверхности форменных элементов крови проводили согласно [5]. Концентрацию внеклеточной ДНК определяли при помощи флуоресцирующего интеркалирующего красителя PicoGreen [5]. С учетом соотношения объемов плазмы, элюатов с поверхности клеток крови и суммарного объема крови минимальный уровень ДНК, детектируемой в плазме, составил 0.4 нг/мл крови, в ФБ-ЭДТА-элюате - 2 нг/ мл крови и в трипсиновом элюате - 20 нг/мл крови. Интегральную активность ДНКаз в плазме крови здоровых доноров и больных определяли при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) как описано в работе [6]. Чувствительность ИФА, определенная как минимальная статистически значимо определяемая активность ДНКазы I в образце, составляла 0.004 ед. акт./мл образца. Коэффициент вариации в каждой точке не превышал 4%.
Результаты обрабатывали с помощью программы GraphPad Prism 5 с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни и коэффициента корреляции Спирмена.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее нами было показано, что в крови здоровых доноров, а также у больных раком легкого [5], желудка
и кишечника [7] постоянно присутствуют циркулирующие ДНК, которые находятся не только в плазме крови, но и входят в состав комплексов, связанных с поверхностью форменных элементов крови. Часть скпДНК диссоциирует после обработки клеток ФБ-ЭДТА-буфером и, по-видимому, связана с фосфолипи-дами и другими анионами клеточной мембраны через «мостики» из ионов двухвалентных металлов [8] или низкоаффинно, и элюируется в 9 раз большим объемом буфера (по сравнению с объемом плазмы); другая часть скпДНК удаляется с клеточной поверхности при обработке клеток 0.125% раствором трипсина и, по-видимому, входит в состав комплексов с поверхностными белками форменных элементов крови [1].
В представленной работе изучены корреляционные связи между концентрацией сцДНК и скпДНК в крови в норме и при развитии онкологических заболеваний предстательной железы (ОЗПЖ). Поскольку концентрации сцДНК и скпДНК у пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы не отличались статистически значимо от их концентрации в крови больных раком предстательной железы (данные не представлены), эти группы больных были объединены в общую группу пациентов с ОЗПЖ. При оценке отношения концентраций сцДНК и суммарной циркулирующей ДНК всей крови (сц + скпДНК) обнаружено статистически значимое (Р < 0.01) увеличение доли сцДНК при ОЗПЖ (40 ± 4%) по сравнению с нормой (22 ± 4%) (рис. 1А).
Обнаружили, что ФБ-ЭДТА-элюат с поверхности форменных элементов (т.е. «слабо» связанные скпДНК) у здоровых доноров и пациентов с ОЗПЖ содержит 4 ± 1 и 17 ± 3% от общего количества свя-
и
0
X
СП
s
н
*
та к та х
м
та ^
1
X СП
О
а *
с
5
„ 1.0-L
0.5ч-0.40.30.20.1
0.0
Здоровые доноры
1 — 25-75%
— —Медиана
I —Края статистически значимой выборки
Больные с ОЗПЖ
и в
о р
к л м
К
I
i с я и J
а р
т н е J н о К
700 600 500 400 300 200 100 0
-1
4
*
• *
— ; 4»« * i * •
-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 ДНКазная активность, ед. акт./мл крови
Рис. 2. Активность дезоксирибонуклеаз в плазме крови здоровых доноров и больных с ОЗПЖ (А); зависимость концентрации сцДНК от ДНКазной активности плазмы крови здоровых доноров и пациентов с ОЗПЖ (Б)
Б
занных с клетками крови циркулирующих ДНК соответственно (рис. 1Б), и эти отличия между здоровыми и больными мужчинами статистически значимы (Р < 0.01).
Обнаруженное нами уменьшение доли скпДНК с одновременным увеличением доли сцДНК в крови при ОЗПЖ может быть следствием гидролиза скпДНК под действием дезоксирибонуклеаз крови. Данные о способности ДНКаз гидролизовать нуклеиновые кислоты, связанные с поверхностью клеток, противоречивы. Одни авторы полагают, что ДНКазы могут гидроли-зовать скпДНК [9], согласно другим - ДНКазы слабо влияют на концентрацию скпДНК [8, 10].
Активность ДНКаз крови определяли с использованием разработанного ранее иммуноферментного анализа, основанного на гидролизе ПЦР-фрагмента ДНК, модифицированного остатками биотина и флуоресце-ина [6]. Определение концентрации сцДНК и активности ДНКаз плазмы крови здоровых доноров и онкологических больных выявило существование заметной (по шкале Чеддока) обратной корреляции между этими параметрами (R = -0.57, Р < 0.01) (рис. 2).
Эти данные показывают, что ДНКазы, несмотря на статистически значимое (Р < 0.01) снижение их активности в крови больных ОЗПЖ по сравнению со здоровыми донорами (рис. 2), могут гидролизовать сцДНК и, по-видимому, являются одним из факторов негативной регуляции концентрации сцДНК.
Изучение зависимости между активностью ДНКаз плазмы крови и концентрацией скпДНК показало, что активность ДНКаз слабо коррелирует с концентрацией ДНК, связанных с поверхностью форменных элементов за счет ионных взаимодействий, и практически не коррелирует с концентрацией ДНК, связанных
с белками клеточной поверхности (R = -0.36, P < 0.01 и R = -0.28, P < 0.01 соответственно). Эти данные свидетельствуют о том, что ДНКазы практически не гидролизуют скпДНК, «прочно» связанные с белками клеточной поверхности, не вносят существенного вклада в процесс фрагментации скпДНК, ее диссоциации с поверхности клеток, а концентрация сцДНК не может возрастать за счет гидролиза скпДНК, прочно связанной с клеточной поверхностью.
Данные экспериментов in vitro [11] и результаты изучения скпДНК крови (рис. 1) показывают, что основная часть скпДНК удаляется с поверхности клеток при обработке клеток трипсином, т.е. связана с белками клеточной поверхности. Исходя из данных о корреляции между концентрацией скпДНК ФБ-ЭДТА-элюата и активностью ДНКаз, можно предположить, что часть «слабо» связанных скпДНК может обмениваться с ДНК внеклеточной среды и плазмы крови. Подтверждением этого предположения служит заметная (по шкале Чеддока) прямая корреляция между изменением концентрации сцДНК плазмы и концентрации «слабо» связанных скпДНК (ФБ-ЭДТА-элюат) (R = 0.67, Р < 0.01) у пациентов с ОЗПЖ (рис. 3А).
Кроме того, нами обнаружена прямая корреляция между концентрацией скпДНК в ФБ-ЭДТА-элюате и трипсиновом элюате у пациентов с ОЗПЖ (R = 0.65, Р < 0.001) (рис. 3Б), что может свидетельствовать о перераспределении ДНК между этими фракциями скпДНК.
Таким образом, полученные данные указывают на возможность частичного обмена сцДНК и скпДНК крови. Косвенно этот факт подтверждается также данными о размере фрагментов циркулирующей
та 2 с
т
О
I
LQ
е
m Ы Л
п
с
*
и
х
СП
О
а *
с
5
50, 40302010-
0
0 100 200 300 400 500 600 700 сцДНК в плазме, нг/мл крови
е
т
а
ю
л
э
м и
о в
в о
о р
н к
и
с л
п м
и
р / г
т н
в
К
Н
Д
п
к
с
150-1
100-
50
т
20
т
30
~г 40
-1 50
скпДНК в ФБ-ЭДТА-элюате, нг/мл крови
Рис. 3. Зависимость концентрации сцДНК в плазме крови от концентрации скпДНК в ФБ-ЭДТА-элюате (А); зависимость концентрации скпДНК в ФБ-ЭДТА-элюате от концентрации скпДНК в трипсиновом элюате (Б)
Б
0
ДНК. скпДНК трипсинового элюата представлены преимущественно высокомолекулярной ДНК размером около 10-20 т.п.н., а сцДНК и скпДНК ФБ-ЭДТА-элюата содержат кроме высокомолекулярной ДНК фрагменты размером 200-500 п.н. [3], которые, по-видимому, и могут циркулировать в составе того или другого пула циркулирующих ДНК.
Причины снижения доли скпДНК в общем пуле циркулирующих ДНК в крови больных ОЗПЖ не известны. Вполне вероятно, что они могут быть связаны с изменением строения цитоплазматических мембран клеток крови. Действительно, показано, что при развитии онкологических заболеваний изменяется соотношение липидов в мембранах клеток крови, что приводит к увеличению вязкости липидного бислоя, нарушению межмолекулярных белок-липидных взаимодействий и, как следствие, дезорганизации белкового состава, нарушению функционирования катионтранспортирующих мем-
бранных систем и дезорганизации поверхностной архитектоники клеток [12].
Известно, что пул скпДНК служит ценным источником диагностического материала [4]. Возможность обмена сцДНК и скпДНК позволяет предположить, что в будущем наиболее точная диагностическая информация может быть получена при анализе суммарной циркулирующей ДНК крови. Действительно, при условии, что сцДНК и скпДНК могут обмениваться (и механизмы этого процесса пока неизвестны), для измерения относительных концентраций маркеров правильнее использовать суммарную циркулирующую ДНК крови (сцДНК + скпДНК). •
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 13-04-01460), БОР (№ VI.62.1.4),
а также стипендиями Президента РФ для молодых ученых и аспирантов (СП-1528.2013.4, СП-5711.2013.4).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Тамкович С.Н., Власов В.В., Лактионов П.П. // Молекуляр. биология. 2008. Т. 42. № 1. С. 12-24.
2. Geary R., Watanabe T., Truong L., Freier S., Lesnik E.A., Sioufi N.B., Sasmor H., Manoharan M., Levin A.A. // Pharm. Exp. Therap. 2001. V. 296. № 3. P. 890-897.
3. Laktionov P.P., Tamkovich. S.N., Rykova E.Y., Bryzgunova O.E., Starikov A.V., Kuznetsova N.P., Vlassov V.V. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2004. V. 1022. P. 221-227.
4. Skvortsova T.E., Rykova E.Y., Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E., Starikov A.V., Kuznetsova N.P., Vlassov V.V., Laktionov P.P. // Br. J. Cancer. 2006. V. 94. № 10. P. 1492-1495.
5. Tamkovich S.N., Litviakov N.V., Bryzgunova O.E., Dobrodeev A.Y., Rykova E.Y., Tuzikov S.A., Zav'ialov A.A., Vlassov V.V., Cherdyntseva N.V., Laktionov P.P. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2008. V. 1137. P. 214-217.
6. Cherepanova A., Tamkovich S., Pyshnyi D., Kharkova M.,
Vlassov V., Laktionov P. // J. Immunol. Methods. 2007. V. 325. № 1-2. P. 96-103.
7. Тамкович С.Н., Брызгунова О.Е., Рыкова Е.Ю., Колесникова Е.В., Шелестюк П.И., Лактионов П.П., Власов В.В. // Биомед. хим. 2005. T. 51. № 3. C. 321-328.
8. Беляев Н.Д., Будкер В.Г., Горохова О.Е., Соколов А.В. // Молекуляр. биология. 1988. T. 22. C. 1667-1672.
9. Aggarwal S., Wagner R., McAllister P., Rosenberg B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. № 3. P. 928-932.
10. Dorsch C. // Thromb. Res. 1981. V. 24. № 1-2. P. 119-129.
11. Морозкин Е.С., Сильников В.Н., Рыкова Е.Ю., Власов В.В., Лактионов П.П. // Бюл. эксп. биол. мед. 2009. Т. 147. № 1.
С. 67-70.
12. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А., Федорова Т.С., Кравец Е.Б., Иванов В.В., Жаворонок Т.В., Часовских Н.Ю., Чудакова О.М., Бутусова В.Н. и др. // Бюл. сиб. медицины. 2006. Т. 2. С. 62-69.
