Взаимосвязь циркулирующих ДНК крови с особенностями и характером иммунного ответа у бо льных иксодов ым клещевым боррелиозом на ранних стадиях

Шкода Ольга Сергеевна; Чикова Елена Дмитриевна; Фоменко Наталья Владимировна; Власов Валентин Викторович; Лактионов Павел Петрович; Рыкова Елена Юрьевна

ЛИТЕРАТУРА

1. Боргояков В.Ю., Фоменко Н.В., Панов В., Чикова Е.Д. Исследование зараженности боррелиями таежных клещей в Новосибирском научном центре СО РАН // Паразитология.

- 2010. - №44(6). - С.543-556.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М., 1984. -477 с.

3. Фоменко Н.В., Сабитова Ю.В., Хаснатинов М.А. и др. Гетерогенность гена p83/100 боррелий комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato // Молекулярная генетика микробиология и вирусология. - 2007. - №4. - С.31-37.

4. Фоменко Н.В., Стронин О.В., Сабитова Ю.В., Романова Е.В. Использование боррелий трех видов для выявления специфических антител в крови больных иксодовыми клещевыми боррелиозами // Журнал инфекционной патологии.

- 2010. - Т. 17. №3. - С.143-146.

5. Anda P., Backenson P.B., Coleman J.L., et al. Epitopes shared by unrelated antigens of Borrelia burgdorferi // Infect. Immun. -1994. - Vol. 62. - P.1070-1078.

6. Birnboim H., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure

for screening recombinant plasmid DNA // Nucl. Acids Res. -1979 - Vol.7 - P.1513.

7. Fomenko N. V., Livanova N.N., Chernousova N. Y. Diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato in natural foci of Novosibirsk region // Int. J. Med. Microbiol. - 2008. - Vol. 298. S1. - P.139-148.

8. Rauer S., Kayser M., Neubert U., et al. Establishment of enzyme-linked immunosorbent assay using purified recombinant 83-kilodalton antigen of Borrelia burgdorferi sensu stricto and Borrelia afzelii for serodiagnosis of Lyme disease // J. Clin. Microbiol. - 1995. - Vol. 33. - P.2596-2600.

9. Rossler D., Eiffert H., Jauris-Heipke S., et al. Molecular and immunological characterization of the p83/100 protein of various Borrelia burgdorferi sensu lato strains // Med. Microbiol. Immunol. - 1995. - Vol. 184. - P.23-32.

10. SigalL. Immunologic mechanisms in Lyme neuroborreliosis: the potential role of autoimmunity and molecular mimicry // S. Neurol. - 1997. - Vol. 17. - P.63-68.

11. Towbin H., Staehlin T., Gorden J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1979. - Vol. 76. - P.4350.

Информация об авторах: 630090, г. Новосибирск, Академика Лаврентьева проспект, 8, раб. тел. (383)-363-51-57, e-mail: [email protected] Бабкин Игорь Викторович — к.б.н., старший научный сотрудник; Тикунова Нина Викторовна — д.б.н., зав. лабораторией; Васькова Анна Андреевна — соискатель; Бабкина Ирина Николаевна — к.б.н., с.н.с.; Фоменко Наталья Владимировна — к.б.н., научный сотрудник.

ВЗАИМОСВЯЗЬ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ДНК КРОВИ С ОСОБЕННОСТЯМИ И ХАРАКТЕРОМ ИММУННОГО ОТВЕТА У БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛ ИОЗОМ НА РАННИХ СТАДИЯХ

Ольга Сергеевна Шкода, Елена Дмитриевна Чикова, Наталья Владимировна Фоменко, Валентин Викторович Власов, Павел Петрович Лактионов, Елена Юрьевна Рыкова (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, директор - акад. РАН, проф., д.х.н. В.В. Власов)

Резюме. Для оценки возможности использования внеклеточных ДНК, циркулирующих в крови (цирДНК), в диагностике инфекционного процесса проведено определение их концентрации в крови 61 больного с диагнозом «иксодовый клещевой боррелиоз» (ИКБ) и 60 здоровых доноров. В крови больных выявлено повышение концентрации провоспалительных цитокинов и цирДНК крови на ранней стадии ИКБ до появления специфических антител к антигенам боррелий комплекса Borrelia burgdorferi s.l. Показано, что дальнейшее возрастание концентрации цирДНК крови при развитии гуморального иммунного ответа ассоциировано с появлением высоких титров анти-боррелиозных антител и повышением уровня противовоспалительных цитокинов. Полученные данные говорят о перспективности дальнейшего изучения цирДНК крови в качестве дополнительного диагностического критерия при ИКБ.

Ключевые слова: иксодовый клещевой боррелиоз, циркулирующие ДНК крови, иммунный ответ, цитокины, специфические антитела.

CIRCULATING DNA AND IMMUNE RESPONSE CHARACTERISTICS IN PATIENTS WITH EARLY STAGES OF TICK-BORNE BORRELIOSIS

O.S. Shkoda, E.D. Chikova, N.V. Fomenko, V.V. Vlassov, P.P. Laktionov, E.Y. Rykova (Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS)

Summary. To assess the possibility of using circulating DNA diagnostic potential in tick-borne borreliosis, 61 patients and 60 healthy donors have been surveyed. With the purpose of establishment of immune response characteristics cytokine profile and antibodies level, specific to Borrelia burgdorferi s.l antigens were analyzed. At an early stage of tick-borne borreliosis induction of pro-inflammatory cytokines secretion and increase in csb-cirDNA concentration were revealed before the development of specific antibodies. Further increase in csb-cirDNA concentration was significantly associated with the appearance of high titers of antibodies specific to Borrelia burgdorferi s.l. and with anti-inflammatory cytokines secretion increase. The data obtained indicate that further study of the cirDNA concentration is promising to evaluate its applicability as the additional diagnostic criterion of tick-borne borreliosis.

Key words: Tick-borne borreliosis, circulating DNA of blood, immune response, cytokines, specific antibodies.

Иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ) - природноочаговые трансмиссивные заболевания, занимающие по широте распространения одно из первых мест среди природно-очаговых инфекций в России. Возбудители ИКБ - спирохеты комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.), - передаются человеку клещами рода Ixodes.

Боррелии обладают способностью к длительной пер-систенции в организме человека, что может вызывать осложнения, в том числе аутоиммунного характера. Поэтому актуальным является выявление факторов, пригодных для ранней диагностики и разработки подходов эффективного лечения. Одним из критериев по-

становки диагноза ИКБ является воспалительная реакции кожи в месте укуса клеща - мигрирующая эритема (МЭ), однако встречаются безэритемные формы ИКБ, диагностика которых затруднена. В таких случаях важно проведение лабораторных исследований, позволяющих подтвердить диагноз путем выявления специфических антител к антигенам боррелий или непосредственно ДНК боррелий в крови или моче больных ИКБ. Ранее было показано, что внеклеточные ДНК, циркулирующие в крови (цирДНК), присутствуют в норме в невысоких концентрациях, тогда как их количество и состав изменяются при онкологических и аутоиммунных патологиях [6]. Считается также, что одним из важных факторов в патогенезе данной инфекции является, помимо повреждающего действия эндо и экзотоксинов борре-лий, характер иммунного ответа организма, определяющийся опосредованным действием инфекции [2].

В настоящей работе проведен анализ изменения концентрации цирДНК и цитокинового профиля в норме и при различных формах ИКБ с целью оценки возможности их дальнейшего использования в качестве дополнительных диагностических маркеров.

Материалы и методы

В исследование включены образцы крови 60 здоровых лиц, отрицавших факт присасывания клеща в анамнезе за последние 3 года для определения концентрации цирДНК крови, 40 здоровых доноров для определения уровня цитокинов и 61 больной, пострадавший от укуса клеща и поступивший в Городскую инфекционную клиническую больницу №1 (ГиКб №1) г. Новосибирска с признаками инфекционного заболевания и последующим диагнозом ИКБ. Все больные подписали протокол добровольного информированного согласия на участие в исследовании. Диагноз ИКБ был поставлен на основании анамнеза (присасывание клеща), клинических симптомов, наличия МЭ и по результатам лабораторных тестов (выявление антител классов IgG и IgM к АГ боррелий). Определение титра антител классов IgG и IgM к антигенам боррелий и концентрации цитокинов (IL-10, IL-6, IL-4, аФНо, уИНФ, рецепторного антагониста ИЛ-1 (IL-1 Ra)) проводилось методом ИФА с использованием коммерческих наборов («Вектор-Бест», Новосибирск). Учет результатов производили на иммунноферментном анализаторе «Multiskan». Расчеты количества цитокинов проводили путем построения калибровочных кривых с помощью компьютерной программы.

Венозную кровь собирали в пробирки «Vac^tt^»-K3EDTA «Greiner bio-one» с 0,5 М ЭДТА (Австрия) и разделяли на плазму и клетки крови. Фракцию цирДНК, связанных с клеточной поверхностью (скп-цирДНК), получали последовательной обработкой клеток 5 мМ фосфатным буфером, содержащим ЭДТА (ФБ-ЭДТА), и 0,125 % раствором трипсина, как описано ранее [3]. ДНК выделяли из 1 мл плазмы, 3 мл ФБ-ЭДТА и 1 мл трипсиновой фракции с помощью наборов «Blood DNA Isolation Kit» фирмы «BioSilica Ltd.» (Новосибирск, Россия). Концентрацию цирДНК крови определяли с использованием количественной ПЦР в режиме реального времени, специфичной к фрагментам повторяющихся последовательностей LINE-1 как описано ранее

[4]. Выявление ДНК боррелий проводилось методом ПЦР с праймерами к межгенному спейсеру 5S-23S рРНК боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. и гену OspA.

Статистическая обработка результатов осуществлялась общепринятыми методами статистики пакета Statistica 6.0, MedCalc. Результаты представлены в виде средней и средней квадратичной ошибки. Статистическая значимость полученных данных определялась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Критическое значение уровня значимости принималось равным 5% (p<0,05).

Результаты и обсуждение

В общей группе больных ИКБ (эритемная форма

- 80,3%, безэритемная форма - 19,7%) отмечается увеличение уровня провоспалительных цитокинов (IL-6, у-ИНФ, а-ФНО) по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Ранее показано, что у взрослых больных эри-темной формой ИКБ в фазу разгара кожных проявлений наблюдается повышение уровня у-ИНФ в 2 раза, а у детей в 1-ю неделю заболевания происходит также значительное увеличение уровня IL-6 и а-ФНО [5,1]. Подобная тенденция указывает на преобладание клеточного иммунного ответа на ранних стадиях любого инфекционного процесса, в том числе, ИКБ. Напротив, уровень двух противовоспалительных цитокинов (IL-10 и IL-4) в группе больных ИКБ оказался статистически значимо ниже, чем у здоровых людей (табл. 1). В других исследованиях показано повышение уровня этих

цитокинов в динамике и последующая индукция ими гуморального иммунитета на ранних стадиях заболевания [5]. Такие различия могут быть следствием неоднородности исследованной нами группы больных ИКБ по сроку тестирования от момента инфицирования и как следствие, различным уровнем развития гуморального ответа. В связи с этим больные ИКБ разделены на группы с высоким титром (2,0-12,0 о.е.) антител (п=19), низким титром (1,1-2,0 о.е.) антител (п=10) и отсутствием (титр менее 1,1 о.е.) антител (п=32) к АГ боррелий классов М или/и G. Сравнительный анализ показал, что первоначальное снижение концентрации ГИ0 и ^-4 в плазме крови по сравнению с контролем далее изменяется на возрастание в ряду: больные без анти-боррелиозных антител - с низким уровнем антител - с высоким уровнем антител (4,56±2,1 - 5,31±2,3 - 8,87±5,5 для ГЬ-10 и 0,59±0,22 - 0,67±0,24 - 1,5±0,7 для ^-4).

Кроме того, в общей группе больных ИКБ происходит статистически значимое увеличение концентрации в крови ГИ Ra, выступающего в качестве антагониста основного провоспалительного цитокина ГИ. При этом более высокая концентрация наблюдается в группе больных с высоким уровнем анти-боррелиозных антител по сравнению с группой без антител (табл. 1). Эти результаты согласуются с более ранними данными о

Таблица 1

Концентрация цирДНК (нг/мл) и цитокинов (пг/мл) в крови больных с различными формами ИКБ и здоровых лиц

Исследуемые показатели Здоровые ИКБ (n=61) ИКБ эритемная форма (n=49) ИКБ безэритемная форма (n=12) АТ «-» (n=32) АТ «+» tt (n=19)

IL-1 Ra 398,1±30,9 531,2±45* 487,93±44 707,85±132,9** 476,1±35,8 642,4±105,3*

IL-4 1,9±0,26 1,18±0,44* 1,28±0,54 0,8±0,52 0,59±0,22 1,5±0,7***

у-ИНФ 1±0,18 19,8±2* 20,05±2,2 19,13±5,25 20,52±3,04 16,8±3,2

а-ФНО 0,8±0,14 3,26±0,81* 2,21±0,68 6,91±2,9 4,05±1,31 3,27±1,2

IL-10 9,8±1,3 5,27±2,05* 5,18±2,37 5,6±4 4,56±2,1 8,87±5,5***

IL-6 0,06±0,01 14,57±2,1* 9,59±0,79 20,38±9,5 9,8±0,96 11,6±4,2

цирДНК 2,7 ± 2,5 9,9±2,6* 4,3±0,69 7,9±2,4 3,9 ± 0,01 5,78±1,7

Скп-цирДНК 13,4 ± 0,41 98,5±14,5* 68,3±11,4 157,28±38,6** 55,4 ± 14,2* 176,1±1,49*

Примечание: *- р<0,05 по сравнению с контрольной группой; **- р<0,05 по сравнению с группой больных с эритемной формой боррелиоза; **- р<0,05 по сравнению с группой больных без выявленных АТ к АГ бор-релий.

том, что у детей с общеинфекционным синдромом ИКБ наблюдается увеличение концентрации ГИ Ra [1]. В настоящей работе также выявлена статистически значимо более высокая концентрация ГИ Ra в группе больных с безэритемной формой ИКБ относительно больных с эритемной формой (табл. 1).

Таким образом, в общей группе больных ИКБ отмечено преобладание провоспалительных цитокинов (^-6, у-ИНФ, а-ФНО) над противовоспалительными (^-10, ^-4, ГИ Ra). На ранней стадии развития ИКБ, предшествующей появлению специфических анти-боррелиозных антител, наблюдается пониженная концентрация противовоспалительных цитокинов ^-4 и ^-10, тогда как увеличение их концентрации ассоциировано с развитием высокого уровня специфических антител.

В общей группе больных с диагнозом ИКБ выявлено статистически значимое увеличение концентрации цирДНК плазмы и скп-цирДНК по сравнению со здоровыми лицами (табл. 1). Показано статистически значимо увеличение концентрации как скп-цирДНК, так и уровня цирДНК плазмы крови у больных с без-эритемной формой ИКБ по сравнению с эритемной формой ИКБ, что говорит об ассоциации увеличения

цирДНК с отсутствием неспецифической воспалительной реакции местного характера. Обнаружено, что среднее значение концентрации скп-цирДНК в группе больных с ИКБ, имеющих специфические антитела к АГ боррелий (п=29), существенно превышает значение концентрации у больных без выявленных антител (п=32) (р<0,05) (рис. 1) и возрастает в ряду: больные без анти-боррелиозных антител - с низким уровнем антител - с высоким уровнем антител (55,4±14,2 - 83,2±26,8

- 176,1±12,49). По количеству цирДНК плазмы крови не выявлено статистически значимо различий между этими группами. Согласно полученным данным, развитие специфического гуморального иммунного ответа на боррелиозную инфекцию ассоциировано с увеличением концентрации скп-цирДНК.

В настоящей работе впервые показано статистически значимое увеличение концентрации цирДНК крови при развитии ИКБ. На первом этапе развития болезни наблюдается повышение уровня провоспалительных цитокинов (^-6, у-ИНФ, а-ФНО) и концентрации цирДНК в крови. Развитие специфического гуморального иммунного ответа характеризуется повышением титра специфических антител, ростом уровня противоспалительных цитоки-нов (ГИ0, ^-4, ГИ Ra) и дальнейшим повышением концентрации цирДНК в крови. Выявлена ассоциация повышения концентрации ГИ Ra и цирДНК в крови с отсутствием неспецифической воспалительной реакции (МЭ) при ИКБ. Полученные данные говорят о перспективности дальнейшего изучения цирДНК крови как дополнительного фактора, применимого для диагностики, и, возможно, принимающего участие в патогенезе ИКБ.

Работа поддержана грантом РФФИ № 11-04-01066-а, проектом № 5.25 Программы 21 фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки - медицине».

скп-цирДНК крови цирДНК плазмы крови

Рис. 1. Концентрация цирДНК в крови больных с ИКБ (нг/мл), *- р<0,05 критерий Манна-Уитни.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бедарева Т.Ю., Попонникова Т.В., Галиева Т.Ю., Вахрамеева Т.Н. Клинико-патогенетические особенности острого периода инфекций, передающихся иксодовыми клещами, у детей // Вестник Уральской государственной медицинской академии. - 2010. - №21. - С.50-59.

2. Коренберг Э.И., Крючечников В.Н. Иксодовые клещевые боррелиозы - новая группа заболеваний человека // Журнал микробиологии. - 1996. - №4. - С.104-107.

3. Рыкова Е.Ю., Скворцова Т.Э., Хоффман А-Л. и др. Циркулирующие внеклеточные ДНК и РНК крови в диагно-

стике онкопатологий молочной железы // Биомед. химия. -2008. - Т. 54. - С.94-1013.

4. Ponomaryova A.A., Rykova E.Y., Cherdyntseva N.V., et al. Concentration and distribution of single-copy p-actin gene and LINE-1 repetitive elements in blood of lung cancer patients // Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. / Ed. P. Gahan. -2011. - Part 2. - P.41-45.

5. Simakova A.I. Ixodic tick borreliosis in primorsky region // Pasific Medical Journal. - 2005. - №1 - Р.68-71.

6. Vlassov V.V., Laktionov P.P., Rykova E.Y. Circulating nucleic acids as a potential source for cancer biomarkers // Curr. Mol. Med. - 2010. - Vol. 10 - P.142-165.

Информация об авторах: Шкода Ольга Сергеевна - аспирант, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова 25/4, АНО « Центр новых медицинских технологий в Академгородке», лаборатория генной диагностики, тел. (383)330-76-66, e-mail: [email protected]; Чикова Елена Дмитриевна - заведующая лабораторией, к.м.н.; Фоменко Наталья Владимировна -сотрудник лаборатории, к.б.н.; Лактионов Павел Петрович - заведующий группой, к.б.н.; Рыкова Елена Юрьевна -сотрудник группы, д.б.н.; Власов Валентин Викторович - директор института, д.х.н., профессор, академик РАН.

ВСТРЕЧАЕМОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ТИПОВ И ПОДТИПОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА НА ТЕРРИТОРИИ НОВОСИБИРСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА

Сергей Евгеньевич Ткачев1,Вячеслав Юрьевич Боргояков1,

Наталья Николаевна Ливанова1-2, Виктор Васильевич Панов2 (‘Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск, директор -академик РАН В.В. Власов, лаборатория молекулярной микробиологии, зав. - д.б.н. Н.В. Тикунова; 2Институт систематики и экологии животных СО РАН, г. Новосибирск, директор - д.б.н., проф. В.В. Глупов,

Circulating DNA and immune response characteristics in patients with early stages of tick-borne borreliosis